DB22T 2566-2016 b型流感嗜血杆菌核酸检测 多重PCR法.pdf

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1、ICS07.100C04备案号：54243-2017DB22吉本标准仅供内部使用不得翻印林省地方标准DB22/T2566—2016b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法MultiplexpolymerasechainreactionmethodforthedetectionofHaemophilus本标准仅供内部使用不得翻印2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2566—2016本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准根据GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准

2、由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：张炜煜、杨修军、王慧、刘桂华、赵薇、黄鑫、李可维。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2566—2016本标准仅供内部使用不得翻印b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法。本标准适用于b型流感嗜血杆菌核酸的实验室检测。2规范性引用文件

3、下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用本标准仅供内部使用不得翻印3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应3.2DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸3.3dNTP：deoxyribonucleosidetriphosp

4、hate，脱氧核苷酸三磷酸3.4dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸3.5dCTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸3.6dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸3.7dTTP：deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸3.8Bp：basepair，碱基对4试剂和材料4.1试剂除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。4.1.1水：应符合GB/T6682-2008中一级水的规格4.1.2DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒4.1.310×PCR缓

5、冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，20mmol/L氯化镁。4.1.44dNTP（10mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP1DB22/T2566—20164.1.5TaqDNA聚合酶4.1.6分子量标记：100bp～2000bpDNA条带（DNALadder）4.1.710本标准仅供内部使用不得翻印×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。4.1.8琼脂糖：电泳纯4.1.9

6、溴化乙锭4.2质控菌株流感嗜血杆菌ATCC9795(b型)、流感嗜血杆菌ATCC49247（N型）、流感嗜血杆菌ATCC10211(丢失荚膜的b型)。流感嗜血杆菌ATCC9795(b型)菌体DNA作为阳性对照。4.3引物及探针4.3.1流感嗜血杆菌种属特异性引物：Hi-F：5’-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT-3’Hi-R：5’-TGTGCCTAATTTACCAGCAT-34.3.2流感嗜血杆菌荚膜特异性引物：Hi-af-F：5’-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC-3’Hi-af-R：5本标准仅供内部使用不得翻印’-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3’

7、4.3.3b型流感嗜血杆菌特异性引物：Hib-F：5’-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC-3’Hib-R：5’-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA-3’5仪器和设备5.1PCR仪5.2生物安全柜5.3涡旋混合器5.4金属浴（或水浴锅）5.5高压灭菌器5.6微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL5.7静脉采血管5.8冷藏冷冻冰箱（2℃～8℃和-20℃）5.9恒流电泳