braf突变肽核酸钳制——pcr检测法的建立

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1、万方数据BRAF突变肽核酸钳制．PCR检测法的建立摘要背景结直肠癌的发病率逐年增加，并且先进的生物靶向治疗主要针对复发患者。大肠癌术后治疗计划，美国FDA和我国明确指出，在一线和二线化疗计划的实施，加入靶向EGFR受体抗体靶向药物(西妥昔单抗和帕尼单抗)时，需进行药敏基因突变检测。国际大样本多中心研究表明，同时进行KRAS、BRAF突变检测，并按此顺序串联诊断，可最大限度地准确预测患者对于抗体靶向药物的敏感性。现有检测方法主要有：经典测序法、Taqman．ARMS、qPCR．HRM和Scorpion．ARMS。虽然DNA测序为国际公认的分子检测金标准，但其

2、灵敏度较低(10％)，有碍其临床广泛应用。国外专利技术蝎形探针ARMS和对应的TaqMan探针法，灵敏度高(O．1％)，主要用于各种类型的组织，包括操作，穿刺或内窥镜检查组织，2小时即可完成检测，试剂盒商业化程度高，临床认可程度高，国内已有试剂盒获批CFDA。qPCR—HRIVI其灵敏度尚可(1％)，需要较高档次的Q．PCR仪，多用于研究中，限制了其临床应用。肽核酸(PeptideNucleicAcid，PNA)是一种在结构上与DNA有些许近似，但是在碱基组成上又有一点不同的核酸，其骨架由2．氨乙基甘氨酸代替DNA的磷酸二酯糖后形成了一种远比DNA稳定的核

3、酸。PNA十分稳定，正确配对的DNA／PNA的稳定性远远高于相应的DNA／DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被其他酶所降解。对于错配的PNA／DNA，哪怕只有一个碱基的错配，也会造成其融解温度下降9一lO℃左右。目前，肽核酸作为一种非常有用分子生物学工具己在疾病的诊断、治疗等领域得到应用。本课题拟在实验室前期摸索出的肽核酸(PNA)压制．PCR／KRAS突变检测法的基础上，将核心的PNA钳制技术转化应用于结直肠肿瘤组织中BRAF突变的检测，有效抑制样本在PCR反应中BRAF野生型基因的扩增，从而提高突变基因的检测灵敏度以及降

4、低检测下限。研究目的探索肽核酸(PNA)抑制．PCR／BRAF突变检测法的诊断界值及其检i9{,I-F限。研究方法将含BRAF突变的质粒／细胞株DNA和BRAF野生型组织DNA以不同比例(突变／总体：50％，25％，12．5％，6．25％，3．1％，I．6％，0．8％，0．4％，0)混合配制成参考品，独万方数据第二军医大学硕士学位论文立配制10个批次并分别进行PNA-PCR／BRAF突变检测，整理出BRAF突变CT值及其总体CT值，并计算ACT值(突变CT值一总体CT值)，运用ROC曲线拟合的ACT作为判明BRAF基因突变的最佳诊断界值(Cut-off值)

5、，并根据前者得出对应的检测下限。研究结果阳性参考品在不同突变百分率下的突变CT值、ACT值与阴性参考品相比有统计学差异口

6、为1．6％。结论本研究初步建立了含有肽核酸(PNA)的PCR／BRAF基因突变检测法的截断值和最低检测限，为进一步的临床应用提供了重要的参数。岩；键词：BRAF基因，突变，肽核酸酸类，聚合酶链式反应万方数据BRAF突变肽核酸钳制．PCR检测法的建立AbstractBackgroundTheoccurrenceofeolorectalcarcimomaisboominggradually．Patientsinlatestageorpeoplewithrecurrenceafteroperationneedtreatmentofbiologicaltarget

7、edagents．TheguidelinesoftherapyonchemicalsincolorectaltumorbothinUnitedStatesandinChinaindicatethatthetargetedagents(cetuximabandpanitumumab)，whichbelongtoresistingEGFRshouldbeusedinprimaryorsecondarychemicaltherapy．Basedonappearanceoftheascendingdemands，itisnecessaryforpatientsto

8、implementthetestsofdrugsensitivit