荧光定量PCR技术检测黑素瘤BRAF基因突变复习课程.ppt

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1、荧光定量PCR技术检测黑素瘤BRAF基因突变黑色素瘤概况恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3％～5％。2010年全球黑色素瘤新发病例199627例，死亡例数为46372例［1］。虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例［1］。［1］CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(2011版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期BRAF基因与黑色素瘤检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9％其中BRAFV600E是最常见的突变位点(

2、87％)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础［1］。在103个治疗中心共入组了675例不能手术切除的Ⅲ期或Ⅳ期的初治黑色素瘤患者，结果Vemurafenib组的客观有效率达到48％而达卡巴嗪(DTIC)组仅5.5％，故在指南中也将Vemurafenib作为BRAFV600E突变患者的一类证据推荐。［1］CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(2011版)临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路该通路在细胞的生长、分化和增殖中起着重要作用，通路通过Ｒas、Ｒaf、有

3、丝分裂原活化蛋白激酶(MEK)及胞外信号调节激酶(EＲK)的特异性级联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内［2］。［2］董高超，周湘，唐伟方，陆涛.B-Ｒaf激酶抑制剂的研究进展［J］中国药科大学学报2014，45(1):1－9.BRAF基因RAF激酶家族有3个亚型:ARAF、BRAF和CRAF。这3个亚型均有3个保守区域CR)：CR1、CR2和CR3。研究表明BRAFV600E的催化活性比野生型B-Ｒaf活性高500倍［3］［3］WanPTC，GarnettMJ，ＲoeSM，etal．MechanismofactivationoftheＲAF-EＲKsignal

4、ingpathwaybyoncogenicmutationsofB-ＲAF［J］．Cell，2004，116(6):855－867.ARMS引物只和突变位点结合，然后TaqDNA多聚酶启动PCR反应ARMS引物不与野生型靶DNA结合，因而TaqDNA多聚酶无法启动PCR反应扩增阻碍突变系统PCR原理引物与探针结合区的上游序列结合引物延伸复制的区域与探针区互补阻止基团使DNA多聚酶不能复制探针区随着温度升高，引物延伸序列变性温度降低，引物延伸序列内部杂交荧光基团远离淬灭基团开始有荧光信号未延伸引物则退火，荧光信号被淬灭实时荧光定量PCR检测BRAF突变步骤第一步

5、：石蜡组织切片DNA提取第二步：样品评估第三步：样品检测石蜡组织中DNA提取1.石蜡组织切片收集及鉴定2.组织切片刮取3.加热裂解消化DNA4.去除石蜡5.吸附柱收集DNA实时荧光定量PCR质量监控1、样本DNA评估体系:加入5μl样本，BRAFpositivecontrol以及无酶水（NTC）DNA样品质量结果分析1)NTC在FAM通道的Ct值小于40表示有污染；2)BRAFpositivecontrol(PC)在FAM通道的Ct值必须在27.82-33.85之间，如果不在这个范围，说明设置有误；3)在BRAFpositivecontrol和NTC都满足要求

6、的情况下，样本FAM通道Ct值必须在20.95-33.00之间；4)样本FAM通道Ct值小于20.95，即使是非常接近20.95，样本必须稀释至Ct值在20.95-33.00之间，可以按照每稀释两倍Ct值增加1计算；检测BRAF突变体系：加入待测5μl样本，BRAFpositivecontrol以及无酶水（NTC）NTC在FAM通道的Ct值小于40表示有污染BRAFpositivecontrol(PC)在FM通道的Ct值必须在27.82-33.85之间A样本分析mutationCt–controlCt=ΔCt检测的意义对病理确诊黑色素瘤的患者进行BRAF突变检

7、测对于指导临床用药十分必要。实时荧光定量PCR法（TaqMan）是目前检测基因突变最有效的方法之一，可以在同一试管完成DNA扩增和检测，避免交叉污染，特异性和敏感性高。国内开展此项目的部分医院：北京大学第一医院吉林大学中日联谊医院中国医学科学院肿瘤医院四川大学华西医院复旦大学附属中山医院南昌大学第二附属院敬请批评指正!谢谢！15此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢