荧光定量PCR检测项目复习过程.ppt

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1、荧光定量PCR检测项目5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan®ProbeRQTaqman实时PCR的反应过程Displacement5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerRQHydrolysis5’3’5’5’3’5’QRPolymerizationCompleted5’3’5’5’3’5’RQ每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通

2、过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理　　　　　　定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收

3、集荧光基团荧光检测元件荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板

4、进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样

5、品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample绝对定量25标本采集和运送血液标本：用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5

6、ml的离心管中。脑脊液：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封标本采集后，应尽可能快的送至实验室，如运送时间需2小时以上，必须用冰盒送至实验室。标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。注：RNA采用EDTA抗凝的全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本则尽快（2小时内）分离血清。严禁使用肝素抗凝。定量检测的临床意义治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，

7、避免盲目用药。治疗后定量PCR直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机。HBV基因分型HBV基因型是根据HBV病毒核酸异源性≥8%进行分型分为A、B、C、D、E、F、G、H等8种亚洲主要为B型以及C型感染HBV后的临床经过与不同基因型有关HBV基因型的临床意义HBV标志物清除与B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg阳性率，分别为16%与53%Ｂ基因型的自发性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝脏生物化学指标持续正常。病毒致病性HBsAg阳性者中，C基因型比B基因型的

8、肝功能异常更为常见。C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重。乙型肝炎的病程及转归亚洲无症状HBV携带中，与B基因型比较,