荧光定量PCR原理--Ct值复习过程.ppt

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1、荧光定量PCR原理--Ct值实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－定义扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理－－常用名词概念Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线Cycle（

2、循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过域值Threshold荧光定量PCR原理－－荧光域值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值Cyclenu

3、mberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认Notemplatecontrol确认PCR扩增效率（E）:0.8-1.235Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（r2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认定性分析研

4、究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA

5、双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现

6、非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高不能进行多重定量缺点SYBRGreenI染料法——优缺点Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸

7、酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-2

8、50nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立3’淬灭基团淬灭基团性质建议使用的5’报告基团TAMRA荧光物质FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非荧光物质FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探针法——荧光标记物的