荧光定量pcr基础原理

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1、○PCR扩增的理论模式○RealtimePCR理论基础PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数

2、。实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。PCR扩增的理论模式PCR中，随着扩增周期的增加，模板以指数方式进行扩增。PCR理论方程：N=N0×(1+E)nN:扩增子数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环

3、数此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。PCR分期——“S”形曲线对PCR扩增过程的详细分析表明，PCR扩增曲线可被分为三个典型时期：早期背景扩增期、中期指数扩增期（或对数线形扩增期），以及晚期的平台期理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线；因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。两种定量方法两种定量方法终

4、点定量起点定量无规律对数期分析：平行性好终点产物数量：误差大拐点产物数量：重现性好，误差小影响因素多扩增效率恒定，标准曲线呈线性起始DNA量，更具意义重现性好，误差小扩增效率恒定，标准曲线呈线性普通PCR技术的检测模式普通PCR仪器扩增，约2.5小时琼脂糖凝胶电泳，约1小时EB染色，约20分钟紫外成像阴性阳性样品检测结果无法定量实时荧光定量PCR的检测模式荧光定量PCR仪器扩增，约2小时检测过程有实时监测数据光滑的S型指数曲线，阳性无S型指数曲线，阴性实时荧光定量PCR的检测模式需绝对定量时四个已知浓度的标准品

5、，得到标准曲线系统即可自动计算出未知样品的浓度阴性结果曲线图示阳性结果曲线图示实时荧光定量PCR基本原理在常规PCR反应的基础上，加入荧光染料或荧光标记的探针，随着PCR反应的进行，PCR产物不段累积，荧光信号强度等比增强。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而对起始模板定量及定性的分析。荧光扩增曲线分三阶段荧光背景信号，荧光信号指数扩增阶段，平台期荧光背景信号阶段：该时期扩增的荧光信号被

6、背景信号所掩盖，扩增产物量无法判断。平台期：扩增产物不再呈指数增加，PCR终产物量与起始模板量无线性关系，无法计算起始DNA拷贝数。荧光信号指数扩增阶段：该时期，PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系，因此选择这一阶段进行定量分析。引入两个概念：荧光阈值和Ct值。实时定量PCR的两个重要概念（1）荧光域值（threshold）：荧光扩增曲线上人为设定一个值，以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。阈值=基线信号的标准偏差x10实时定

7、量PCR的两个重要概念(2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，Ct值也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的循环次数,可见Ct值取决于阈值。基线阈值Ct值Ct值∝DNA起始浓度Ct值与模板DNA的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，达到荧光阈值的Ct值越小。Rn=RB+X0(1+E)nRs总信号=本底信号+分子数量×单位信号强度Rn：第n个循环时的总信号RB：本底RS：单位信

8、号强度X0：起始DNA数目E：PCR效率Rn=RB+X0(1+E)nRs当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（线性方程）定量方法利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值。所以，只要