荧光定量PCR.ppt

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1、北京康为世纪生物科技有限公司实时荧光定量PCRRealTimeQuantitativePCR内容miRNA的特点及检测荧光定量PCR检测microRNA长度20∼24nt单链小分子RNA与目标基因3’端非编码区的识别位点相结合导致目标基因mRNA分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA分子结构变化（5‘脱帽），从而表达水平下降。3’AAAAAAAA5’capmiRNA作用靶点编码区mRNAmicroRNA分子功能microRNA的来源miRNA前体与成熟体靶点识别–不严格互补配对一个miRNA可调节多个基因一个基因可受多个miRNA调控60%人类蛋白基因受miRNA调控miR

2、NA与siRNA的异同分子形式无区别，都是由Dicer产生的~22nt小分子分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降，但通常siRNA效果更剧烈产生来源不同miRNA有其基因，内源性表达siRNA多数情况下为人工外源导入miRNAsiRNAmiRNA与siRNA的异同miRNA检测与定量经典方法:放射标记Northern杂交miRNA芯片–基因表达谱基本原理：某物种全部已知miRNA集中于一张芯片，点杂交检测各miRNA丰度所回答的问题：哪些miRNA是你所应该关注的优点：高通量，全景观察缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛需后续验证：荧光定量PCRPre-miRNA检测

3、必要性：不排除miRNA从前体到成熟体，从核内转运到核外的过程中存在调控机制的可能。SpecificmiRNAquantificationbyrealtimePCR–waytogo关键难点丰度低解决办法:小RNA提取太短解决办法:加长序列高度相似miRNA之间难以区分解决办法:特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化解决miRNA丰度难题基本原理影响RNA分子与硅胶柱结合的因素离液剂chaotropicagent，如盐酸胍离子强度，如NaCl小分子有机溶剂，如乙醇精心调整各组份配比，达成大、小RNA与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA，富集小分子量RNA小RN

4、A提取M123M：Marker#1：康为柱式分离的小片段RNA#2：康为柱式分离的总RNA#3：沉淀法得到的总RNA提取小分子量RNA成熟miRNAqPCR检测-Poly(A)加尾法优点：简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA可用于多个目标分子的检测。成熟miRNAqPCR检测–茎环法优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测检测方法选择依样本特性，检测目标多寡而定康为技术服务经验举例：复旦大学某客户miRNA芯片提示10个miRNA在病人与正常人之间有显著差异表达要求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRN

5、A加尾法，5个目标获得良好检测茎环法，4个目标获得良好检测1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系康为miRNA产品小RNA提取试剂盒加尾法miRNAcDNA第一链合成试剂盒miRNA荧光定量PCR检测试剂盒CW0627CW2141CW2142康为miRNA检测服务全套miRNA检测：从生物样本到数据茎环法miRNA检测引物：定制(RealtimeQuantitativePCR)miRNA的特点及检测荧光定量PCR检测内容PCR：伟大的天才发明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstance

6、sBeliefinastrologyPCR：理想与现实起点定量终点定量起点定量检测：--起点量是样本中未经PCR放大之前的模板量--具有重现性，误差小--“加入了500个拷贝”终点定量检测：-终点产物量经过PCR放大的DNA量--不恒定，误差大--“生成了500，0000，0000个拷贝”扩增曲线--Ct值：模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小。确定模板初始数量？Real-timePCR:检测原理非特异性荧光标记：SYBRGreenI特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：MolecularbeaconRQReporterQuenc

7、herRQ5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBRGreenI只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。SYBRGreenI工作原理Taqman工作原理在退火过程中，探针与靶序列结合探针被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。染料法与探针法对比探针法特异