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1、实时荧光定量RT：安全意，张金刚，刘德斌，李成，马可为，姜丽萍【摘要】目的建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应（real-timequantitative,RT-PCR）检测膀胱移行细胞癌（BTCC）组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学检测VEGF蛋白表达的相关性。方法采用免疫组织化学SP法和实时荧光定量RT-PCR法分别从蛋白水平和mRNA水平检测了31例BTCC和15例正常膀胱黏膜组织中VEGF的表达。结果BTCC中VEGFmRNA表达水平显著高于正常组，两组比较差异有显著性（P<0.05）;BTCC中表达水平在高分化组与中低分化组之间、Tis-T1期与T
2、2-T4期间的差异均有显著性（P<0.05）。VEGF的阳性表达率在BTCC组中为100%,显著高于正常组（P<0.05），在高分化组与中低分化组之间、Tis-T1期与T2-T4期间的差异均有显著性（P<0.05）。结论本研究所建立的用于检测人BTCC组织VEGFmRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化SP方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性，可作为研究膀胱肿瘤的生物学行为和判断预后的参考指标。【关键词】膀胱癌;血管内皮生长因子;免疫组织化学；实时荧光定量RT-PCR【Abstract】Object
3、iveToestablishareal-timefluorescencequantitativeRT-PCRfordetectionofVEGFmRNAexpressioninbladdertransitionalcellcarcinoma（BTCC）andverifythecorrelationmunohisochemistrymethod.MethodsTotalRNAthetissuesandmRNAequan-titativeRT-PCRRNAin31inBTCCand15controlnormalbladdermucosatissues.Theimmunohistochem
4、istrySPmethodRNAalbladdermucosatissuetissues（P<0.05）.BTCCexpressionlevelsinefluorescencequantitativeRT-PCRusedtodetecttheexpressionofVEGFmRNAmightbeareliablemethodforearlydiagnosisofBTCC.TheexpressionofVEGFmRNAiscorrelatedmunohistochemistry;real-timefluorescencequantitativeRT-PCR膀胱肿瘤是泌尿系统最常见
5、的恶性肿瘤，其中膀胱移行细胞癌（bladdertransi-tionalcellcarcinoma,BTCC）占90%以上,且复发率极高，复发后肿瘤恶性度可增高、浸润、转移等行为有增强趋势。此过程与肿瘤细胞外基质的降解、新生血管的大量形成有密切关系。血管内皮生长因子（vascularendothelialgroRNA表达的报道,国外亦极少见报道。本研究拟建立实时荧光定量RT-PCR测定BTCC组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学SP方法检测VEGF蛋白表达的相关性。并结合BTCC的病理分级和临床分期,探讨了VEGF在BTCC发生发展中作用，以期为BTCC准确的临床诊
6、断、治疗和评价预后提供依据。1资料与方法1.1一般资料BTCC样本选自伊盟医院泌尿外科15例和内蒙古自治区医院16例，其中男21例,女10例,平均60.91岁。所有标本均经病理检查证实。所有患者术前均未行药物化疗、放射治疗、免疫或生物治疗。按标准:浅表性（Tis-T1）,浸润性（T2-T4）。另取15例正常膀胱黏膜作为对照。全部标本平均分成两份，一份经4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋、切片,并行HE和免疫组织化学染色。另一份经生理盐水清洗后投入液氮罐中，移入-70℃低温冰箱贮存备用。1.2免疫组化法1.2.1具体操作按即用型S-P试剂盒说明书进行。一抗分别为鼠抗人VEGF多克隆抗体,每
7、次实验均设阳性及阴性对照,VEGF阳性对照为已知胃癌的免疫组化染色阳性片,阴性对照为PBS液替代一抗。1.2.2结果判定标准高倍显微镜（×400）下观察5个视野,每个视野计数100个细胞,以阳性细胞百分率和染色强度为判定标准［4,5］。胞质无染色为阴性（-）;阳性细胞数<20%为弱阳性（+）;阳性细胞数20%～60%为中度阳性（++）;阳性细胞数>60%为强阳性（+++）。1.3实时荧光定量RT-PCR法1.3.1试剂和仪器试剂:Trizol试
