实时荧光定量rt

《实时荧光定量rt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实时荧光定量RT蒋卫平，丁茂文，朱亚非，李冰，朱晚林，李欣华，林菲菲【摘要】目的：建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-timefluorescencequantitativeRT-PCR)检测人外周血单个核细胞中FOXP3mRNA的方法，并研究其与CD4+CD25+Treg细胞活性相关性。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA.freelRNA逆转录成cDNA，以β-actin为内参照，实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24例同龄对照FOXP3mRNA的相对表达量，采用融解曲

2、线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性；同时采用流式细胞技术检测CD4+CD25+Treg细胞含量，分析两者相关性。结果：哮喘患儿组CD4+CD25+Treg细胞百分率明显低于同龄对照组，P＜0.01；FOXP3mRNA的表达也显著降低，P＜0.05；FOXP3和β-actin的融解曲线分析表明均仅有单一峰，Tm值分别为82.4℃和87.8℃；琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3mRNA表达水平简便易行、结果稳定可靠。初步结果证实

3、，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和FOXP3mRNA表达有相同的趋势，存在一定的相关性。【关键词】实时荧光定量RT-PCR；哮喘；FOXP3；CD4+CD25+调节性T细胞Abstract:Objective:Toestablishareal-timefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）todetectFOXP3mRNAexpressioninhumanperipheralb

4、loodmononuclearcells（PBMCs）andtoinvestigatethecorrelationsbetRNA.Methods:TotalRNAhumanPBMCsandmRNAefluorescentquantitativeRT-PCRRNAin29pediatricpatientsaand24age-matchedhealthychildren.ThespecificityofPCRproductionsetryanalysisaRNA(P0.05).Theanalysis

5、ofdissociationcurvesonFOXP3andβ-actinshohadonlyonesimplespikeandtheTmvaluesshoRNAbySYBRGreenⅠreal-timefluorescencequantitativeRT-PCRandthepreliminaryexperimentalresultshoRNAhavethesametrendandconfirmsthecorrelationbet.KeyefluorescencequantitativeRT-P

6、CR；asthma；forkhead/RNA的表达，并验证了其与流式细胞术检测CD4+CD25+Treg表达的相关性，现报道如下。1材料和方法1.1材料1.1.1标本2008年2月至5月在我院小儿科就诊的29例哮喘患儿（病程2～8年）及24例正常对照共计53例，年龄3～14岁，平均（6±2）岁，其中男32例，女21例，患儿诊断均符合中华医学会儿科学会呼吸组制定的哮喘诊断标准5，正常同龄对照组均为无过敏性疾病史的健康儿童；分别采取两管EDTA抗凝的静脉血2mL，及时送检。1.1.2主要仪器：BDF

7、ACSCalibur流式细胞仪，罗氏LightCycler荧光PCR仪，电泳分析系统及凝胶成像系统。1.1.3试剂：多甲藻素叶绿素蛋白（PerCP）标记的CD45单克隆抗体（McAb）、人异硫氰酸荧光（FITC）标记的CD4McAb、藻红蛋白（PE）标记的CD25McAb均购自美国BDPharMingen公司；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司；总RNA提取试剂盒Trizol、第一链cDNA合成试剂盒、热启动荧光定量PCR核心试剂盒（SYBRGreenI染料法）均购自上海闪晶分子生物科

8、技有限公司；引物序列由上海闪晶分子生物科技有限公司合成纯化。1.2方法1.2.1流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4+CD25+Treg的比例：分别加入6μLPerCP标记的CD45McAb、10μLFITC标记的CD4McAb和PE标记的CD25McAb于50μL的EDTA抗凝血中，避光孵育15min，加入溶血素，避光溶血10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，1200r/min离心5min，弃上清，再用500μLPBS重悬细胞，上流式细胞仪（BD公司）检测，结果用Cell