mirna 荧光定量方法

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1、·加尾反转录法则是利用 poly(A)聚合酶为成熟的miRNA 加上 poly(A)尾巴，然后用锚定引物进行反转录，获得加长 cDNA 的第一链。最后使用与通用 标签序列互补的反向引物对 miRNA 表达进行荧光 定量 PCR 检测。这种可以批量将所有成熟 miRNA 加上 poly(A)尾巴，然后进行反转录和检测。茎环反转录法利用可以折叠成茎环结构的引物，通过与 miRNA 的 3’端碱基互补进行反转录，生成 cDNA 第一链，进行荧光定量 PCR 检测，该方法是将反转录引物设计成茎环结构，所以特异性和灵敏性较高， 可以有效区分只相差

2、几个碱基的同家族 miRNA 的不同成员，茎环反转录法对引物的要求较高，需要引物在反转录阶段形成茎环式的正确构型。  miRNA实时荧光定量PCR关键词： miRNA 实时荧光 定量 PCR2013-12-0200:00 来源：互联网 点击次数：1101实时荧光定量PCR从1996年美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧

3、光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光基团与淬灭基团分离，发出可被检测到的荧光，以此来监测整个PCR过程。（2）SYBR荧光染料法：该方法利用了SYBRGreen荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性，检测PCR的全部进程，从而判定初始RNA的量。常用的miRNA第一链合成方法成熟的miRNA大小只有22nt左右，在用实时荧光定量PCR检测miRNA时，难点在于如何识别如此小的miRNA并合成第一链。目前常用的用于识别并合成miRNA第一链的方法主要有颈环法和加尾法

4、两种。（1）颈环法原理图（2）加尾法原理图    由于成熟miRNA较小，无法用常规的方法直接进行反转录、PCR。所以上述两种方法分别加PolyA尾及颈环结构的方法，将miRNA配对的序列延长，然后进行正常的反转录及后续的PCR检测。颈环法只针对成熟miRNA，特异性相对较高，但操作繁琐，成本较高；加尾法可以检测到成熟miRNA及pre-miRNA，特异性稍低，但操作及引物设计简单。分段探针捕获miRNA近年来，研究人员发现了越来越多的miRNA，其中有很多miRNA序列相近，有的仅仅只有一个碱基差异。这些不同的miRNA虽然序列相近，

5、但是也有着不同的来源及功能。上述两种方法虽然解决了miRNA的识别及后续PCR问题，但是无法分辨这些只有一个或者两个碱基差异的miRNA。美国Signosis推出了一种新的miRNA识别方法，可以分辨仅有单个碱基差异的miRNA。  美国Signosis推出的新方法，使用多对寡核苷酸对目的miRNA进行识别，单个碱基差异就可以破坏寡核苷酸与靶标序列的结合，从而分辨单个碱基差异的miRNA；同时该方法不用进行方转录，避免了反转录过程中出现错配的可能；同时，这个新方法还引入了磁珠分离技术，在进行PCR前，通过结合有链霉亲和素的磁珠对特异性标

6、记有生物素的靶标序列进行纯化，大大提高了特异性。武汉中帜生物携手美国Signosis，为广大科研用户提供特异性更高、分辨率更强的miRNA实时荧光定量PCR检测试剂。来源：      与杂交方法相比，实时荧光定量PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度的靶miRNA。Signosis应用T7-OLA（寡核苷酸连接）专利技术和SYBRgreen实时荧光定量PCR技术，开发了一种高灵敏度、高分辨力的实时荧光定量PCR试验方法，可直接

7、对细胞裂解产物中的miRNA表达进行定量分析，无需总RNA提取和cDNA反转录。A.     产品优势 无需 RNA 制备——细胞裂解产物可直接用于实验（总RNA亦可）；分辨率高 ——能分辨仅有单个碱基差异的miRNA；实时——分析可以实时监测；自有专利——应用T7-OLA（寡核苷酸连接）专利技术。B.      技术原理      靶miRNA分子与两条寡核苷酸（oligo）连接，形成RNA/DNA杂合体。含有生物素（biotin，B）的短序列互补结合到其中的一个oligo上。通过结合有链霉亲和素（Streptavidin）的磁珠分离

8、出杂合体。用DNA连接酶连接两条oligo。单个核苷酸的差异就会阻止杂合体的形成或两条oligo的连接。寡核苷酸对连接上后，连接分子可进行实时荧光定量PCR。C.     原理示意图   D.     结果