结直肠癌和肺癌kras和braf基因突变hrm检测方法的建立

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文结直肠癌和肺癌KRAS和BRAF基因突变HRM检测方法的建立EstablishmentofhighresolutionmeltinganalysisfordetectingKRASandBRAFgenemutationsincolorectalcancerandlungcancer课题来源:自选专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学刘丽琴王捷教授姜傥教授裘宇容教授马艳华教授李薇教授李林海副教授论文评阅人陈晓东教授夏勇教授2012年4月10日硕士学位论文结直肠癌和肺癌KRAS和BRAF基因突变HRM检测方法的建立硕士研究生:刘

2、丽琴指导教师:王捷教授摘要背景KRAS基因位于12号染色体上,是表皮生长因子受体(EGFR)功能信号的下游分子,在膜受体到腺苷环化酶信号转导中起重要作用。大约30%的人类肿瘤细胞中出现RAS基因突变,其中KRAS基因对人类癌症影响最大。KRAS基因与一些肿瘤的发病机理和预后相关,主要以结直肠癌、肺癌和胰腺癌的突变率比较高。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期,并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。一般认为,KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。KRAS基因最常见的突变方式为点突变,研究表明,90%的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点,其中三种常见的突变类型是G

3、GT>GAT(G12D)、GGT>GTT(G12V)、GGC>GAC(G13D)。在肺癌中以肺腺癌为主,突变率为20%---30%,结直肠癌患者突变率为27%,--,43%。BRAF基因位于人染色体7q34,长约190kb,是Ras.Raf-MEK.ERK信号转导通路重要的转导因子,主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用,该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接,启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件,如细胞生长、分化和凋亡等。研究发现约15%的结肠癌中存在体细胞BRAF基因错义突变,绝大多数(约89%)的突变发生在15#b显子,其中

4、约92%位于第1799核苷酸上,T突中文摘要变为A(T1799A)。BRAF在结直肠癌的高、中、低分化中表达的阳性率差异明显,肿瘤分化程度越低,BRAF阳性表达率越高,可为结直肠癌的诊断、治疗提供新的依据。目前,结直肠癌和肺癌的治疗仍以手术治疗为主,辅助以化学药物治疗、放射治疗。但是,随着肿瘤分子生物学、基因组学的不断发展,肿瘤靶向治疗预测指标及分子靶向治疗药物受到了越来越多的重视,并被逐渐应用到临床治疗当中。近些年来,结直肠癌和肺癌的治疗领域中最大亮点是确定KRAS基因和BRAF基因状态与抗EGFR抗体疗效的相关性。最新的研究显示,靶向治疗药物西妥昔单抗治疗的有效性受KRAS基因和BR

5、AF基因状态的影响,突变型的KRAS基因和BRAF基因无需EGFR接收信号能够自动活化该通路并启动下游信号的转导,因此只有野生型KRAS和BRAF基因的患者才能从抗EGFR的治疗中获益,而突变型的患者则不能。因此,美国国立综合癌症网络(NCCN)推荐在使用抗EGFR单克隆抗体进行治疗之前,先对患者进行KRAS和BRAF基因突变检测。对于存在KRAS和BRAF突变的患者,不推荐使用抗EGFR单克隆抗体进行治疗。目前,国内外检测基因突变的方法很多,如PCR产物直接测序法、Taqman探针法、单链构象多态性分析法、限制性片段长度多态性分析方法、焦磷酸测序方法、变性高效液相色谱法、突变特异性扩增

6、系统等。这些方法存在着成本高、操作复杂或灵敏度低等问题,不利于临床大样本检测。目前全球缺乏基因突变检测的标准化规范,因此,寻找和建立一个低成本、高通量、简便易行、准确可靠的检测方法,推广到临床应用,是一个亟待解决的问题。高分辨率熔解曲线分析法(K曲resolutionmelting,HRM)是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种新兴分子诊断技术。HRM检测无需使用序列特异性探针,不受突变碱基位点和种类的局限,具有高灵敏度、高特异性、操作简便、低成本、高通量、闭管操作等优点,可检测石蜡包埋组织块、血液、粪便等多种来源标本。HRM技术不损伤DNA,分析之

7、后可以直接纯化测序,可应用于基因分型、突变扫描等多方面。因此,Ⅱ硕士学位论文如果能建立此技术在临床结直肠癌和肺癌KRAS和BRAF基因诊断的可行性,对指导临床个体化治疗和降低患者的经济负担具有重要意义。目的本研究旨在利用当前的实时荧光定量PCR仪,结合饱和荧光染料和HRM分析软件,构建HRM法检测结直肠癌和肺癌KRAS和BRAF基因突变的方法,并初步应用于临床。通过检测条件的优化,做到对KRAS和BRAF基因进行灵敏、特异、实时简便

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