胰腺癌组织中BRAF基因和KRAS基因突变分析.pdf

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1、第二军医大学学报２０１１年１０月第３２卷第１０期ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｊｓｍｍｕ．ｃｎ·１１５８·ＡｃａｄｅｍｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｃｔ．２０１１，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１０ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００８．２０１１．０１１５８·短篇论著·胰腺癌组织中ＢＲＡＦ基因和ＫＲＡＳ基因突变分析ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＢＲＡＦａｎｄＫＲＡＳｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｓ１，２２１１程张军，石欣，杨平华，沈锋１．第二军医大学

2、东方肝胆外科医院肝外四科，上海２００４３８２．东南大学附属中大医院普通外科，南京２１０００９［摘要］目的探讨人胰腺癌组织中ＢＲＡＦ和ＫＲＡＳ基因突变情况及两者的关系。方法对３６例胰腺癌组织及癌旁胰腺组织中ＢＲＡＦ基因１５号外显子及ＫＲＡＳ基因１２号密码子进行测序。结果３６例胰腺癌组织中，２５例出现ＫＲＡＳ基因１２号密码子突变（６９．４％，２５／３６），３例出现ＢＲＡＦ基因Ｖ６００Ｅ突变（８．３％，３／３６），且均同时存在ＫＲＡＳ突变；１１例ＫＲＡＳ野生型胰腺癌组织中未发现ＢＲＡＦ突变；癌旁胰腺组织中均未检出突变。结论胰腺癌组织中ＢＲＡ

3、Ｆ基因突变可能并非主要突变，且常与ＫＲＡＳ基因突变同时存在。［关键词］胰腺肿瘤；ＢＲＡＦ；ＫＲＡＳ；基因突变［中图分类号］Ｒ７３５．９［文献标志码］Ｂ［文章编号］０２５８８７９Ｘ（２０１１）１０１１５８０３ＲＡＳＲＡＦＭＥＫＥＲＫＭＡＰＫ信号通路被认为与肿瘤１．３ＰＣＲ扩增引物用在线Ｐｒｉｍｅｒ３软件设计。针对的发生、发展密切相关，其主要成员ＫＲＡＳ和ＢＲＡＦ的突变ＫＲＡＳ基因第２外显子上第１２号密码子及ＢＲＡＦ基因第１５性激活可导致细胞的异常增殖和向恶性表型转化［１］。近年外显子分别设计２对引物。ＫＲＡＳ上游：５′Ａ

4、ＡＡＧＧＴＡＣＴ来，研究发现，除ＫＲＡＳ突变外，在多种肿瘤组织中还存在不ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧ３′，下游：５′ＴＣＡＴＧＡ同比例的ＢＲＡＦ突变，且与ＫＲＡＳ突变具有相互排斥的性ＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＴ３′；ＢＲＡＦ上游：５′ＡＣＴ质，提示两者对与细胞生长有关的胞间信号转导系统的激活ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴ３′，下游：可能相互独立，ＢＲＡＦ蛋白可能独立于ＲＡＳ蛋白而发挥作５′ＴＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣ３′。ＰＣＲ总反应体用［２５］。但ＢＲＡＦ突变和Ｋ

5、ＲＡＳ突变的确切关系及其在肿系２０，内含１×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑＢｕｆｆｅｒ、２．０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋、μｌ瘤发生发展中的作用尚存争议［６７］，在胰腺癌中更是缺乏深０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、０．２μｍｏｌ／Ｌ引物、１ＵＨｏｔＳｔａｒＴａｑ酶入研究。因此，本研究通过检测胰腺癌组织中ＫＲＡＳ和（Ｑｉａｇｅｎ公司，德国）和１μｌ模板ＤＮＡ。ＫＲＡＳ扩增条件：第ＢＲＡＦ基因的突变情况，初步探讨两者的关系，为后续研究１步，９５℃１５ｍｉｎ；第２步，９４℃１５ｓ、６２℃４０ｓ、７２℃１ｍｉｎ，奠定基础。１１个循环；第３步，９４℃１５ｓ、５６

6、℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ，２４个循环；第４步，７２℃２ｍｉｎ。ＢＲＡＦ扩增条件：第１步，９５℃１０１材料和方法ｍｉｎ；第２步，９４℃４５ｓ、５８℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；第１．１标本来源及患者资料与患者签署知情同意书后，收３步，７２℃７ｍｉｎ。产物行１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。集东南大学附属中大医院及第二军医大学长海医院普通外１．４ＰＣＲ产物纯化取８μｌＰＣＲ产物，加入１Ｕ虾碱酶科２００４年６月至２０１０年６月因胰腺癌手术切除标本３６例ＳＡＰ和６Ｕ外切酶ＥｘｏⅠ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司，美国），３７℃水浴（中大医院２０例，长海医院

7、１６例），对应癌旁胰腺组织取自６０ｍｉｎ，然后７０℃水浴１０ｍｉｎ。距肿瘤边缘２ｃｍ以上，所有肿瘤标本均经病理检查证实为１．５测序分析按ＢｉｇＤｙｅ３．１试剂盒（美国ＡＢＩ公司）说明胰腺癌。其中，男性２１例，女性１５例，年龄４５～７５岁，平均书进行操作。取纯化的ＰＣＲ产物２μｌ，加入ＢｉｇＤｙｅ３．１混合（６２．２±７．７）岁。肿瘤分期参照国际抗癌协会（ＵＩＣＣ）的液２μｌ和０．４μｍｏｌ／Ｌ测序引物２μｌ（ＫＲＡＳ：５′ＡＡＡＧＧＴ［８］。患者具体资料见表１。手术切除后立即ＴＮＭ分期标准ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧ

8、３′；ＢＲＡＦ：５′ＡＣＴ切取标本，快速液氮冷冻，－８０℃保存。ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴ３′）。反１．２ＤＮＡ提取组织样本清洗后剪碎，裂解，进行酚氯仿应条件：首先，９６℃１ｍｉｎ；然