坏死梭杆菌保护性抗原确定与基因筛选研究

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1、依据测出的氨基酸序列，设计简并性引物投反向PcR引物。以简并性引物与随辊g

2、豹簿选、菠囊PcR簿选法、跌及嚣戆基因鬻集筇选方法对抗原蒸嚣进行爨选。对筛选出的序列利用NcBI和EBI中的BLAsT和clustal进行氨基酸序列的同潲性分析、序列比对及核苷酸序列拼接。通过对基闲产物的特性分析以及功能的预测，结台生物学试验结莱，穗定与其棱梭群蔻Alee4§256(gi278874l7)溶盎素其存91％同源性的基因为筛选的目的基因。关键谰坏死梭轷菌保护性抗原基因筛选{IseqHence(sequeneingtenaminoacids，justfirstisva

3、riant)，Cofrespondingsequence帮3sn母tf。Hnd{赴_senBank。下囊isPf毽ved￡矗a￡氇主sp∞￡einis巍novolpfo￡寄谁lnFN．Accordin嚣tothesequGnceoftheaminoacids，pr{mersweredesigned．Thegeneoftheantigenwasselectedbyrandomp“merPCR，reVersePC拭andenriehingofpurpose菩毒矗e。嚣。疆olo$onsanalyslsof氇e趣耀in。a￡i建se《娃enee，se鼋班￡珏

4、eeco越}毫s}鑫n嬉撞econnoctionofribonucleot{desequencewerem龋kedusin鐾BLASTandClustalinNCBIand辩BI．Accordingtotheoonjectureofspecialityand“ctionofproductofgenoand￡矗尊fes娃】￡ofblo{o夸iealexp誓如氆。t￡，蠊e窑080攮拄￡h盎s9l毽ho塾oiog#珏ss枣qHe驻c搴弹i攮he黼olysinofFusobacte姊“mATcc49256(gi27887417)isthepurposegon

5、e．Keyword：Fusobacteriumnocrophorum，proteo“veantigen十geneselectionlV第一章绪论1．1研究目的和意义坏死杆菌病是由坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)引起的牛、羊、鹿等家养动物和野生动物常见且发病率较高的一种危害严重的传染病。其病原菌为坏死梭杆菌，坏死梭杆菌属革兰氏阴性专性厌氧多形态杆菌(长丝到短杆)，它广泛存在于动物和人的口腔和胃肠道中，属条件性致病菌。坏死杆菌病临床上多呈慢性经过，最终造成病畜严重消瘦、失去生产性能甚至死亡。怀毕付畜的阴道和于宦感染坏死梭杆苗时

6、，可导致流产。和仔卣严重发病。坏死灶常局限于肢蹄部，严重病例可感染唇部、面部、消化道、生殖道以及肝、肺等内脏器官。引起肝脏、肺脏的坏死。坏死灶内常端有代酣物和其它细菌”⋯，其中一些细菌可能是由于降低了坏死梭杆菌的最小盛染量而在最初的感染中起一定作用”⋯。坏北梭杆菌是多种坏死病(如动物的肝脓肿、腐蹄病、坏死性喉炎m446"61和人的Lemierre’s综台症‘32421等)的主要或次要病原曲。尤其是胃肝脓肿综合症在动物饲养中危害最为严重[6⋯。坏死杆菌病的l临床治疗效果不佳，且复发率高，无法控制该病的发生。所以，利用有效的抗坏死梭杆崩疫苗来拧制养殖场、动

7、物园及野生动物保护区的坏死病具有重耍意义。国内外研究人员直致力r该疫卣的研究，但进展缓慢，主要原因是坏岁匕梭杆菌免疫作用弱，无法产生保护性免疫。直到上世纪80年代末人们对坏死梭杆菌免疫研究有了新的突破，大量试验hF明，坏死梭杆菌菌体及片代谢产物中存在坏死梭杆菌免疫原。俄罗斯初步研制山坏死梭杆菌疫茸，并经小群牛试验获得成功¨引。本文验通过建立坏死梭杆前小鼠感染模型，对坏死梭杆菌免疫原及保护性抗原进行筛选研究，依据保护性抗原的氨基酸序列测定和基网筛选研究结果，结合抗原的生物学试验，确定坏死梭杆菌的保护性抗原性质及其基冈结构，为坏死梭杆菌疫苗的研制及免疫机理

8、研究打下基础。1．2国内外研究现状1．2．1坏死梭杆菌免疫性及免疫作用的初始研究国内外根多学者一直在从事坏死梭杆菌免疫性及免疫作用研究，起初一部分有治疗、保护和预防的作用。这一阶段实验说明所有抗坏死梭杆菌疫苗和血清试验，免疫作用弱，结果不理想。1．2．2坏死梭杆菌免疫原筛选研究一个多世纪以来，坏死梭杆菌作为动物和人的病原体被人们所认识”⋯。上世纪80年代末人们对坏死梭杆菌免疫研究有了突破性进展，大量试验证明，坏死梭杆菌菌体及其代谢产物中存在坏死梭杆菌免疫原。c18k等“”利用完整细胞培养物“”1、细胞质”⋯3“、外膜蛋白和培养物上清液”“诱导的坏死梭杆

9、菌保护性免疫实验大部分取得了成功。但除培养物上清液中的主要免疫原被筛选出来(证明是白细胞毒索)