人用狂犬病疫苗

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人用狂犬病疫苗（一）人用狂犬病疫苗的历史和现状1882年，法国人路易巴斯德先生首次成功发明了人用狂犬病疫苗，之后经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗，发展到目前技术日趋完善的原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞、人二倍体细胞和Vero细胞培养的纯化疫苗。早期的神经组织疫苗免疫效果不佳（全程免疫后仍有1‰的死亡病例），且疫苗接种后局部和全身反应严重，由于疫苗中含有动物脑组织的髓磷脂成分，接种后可能引起神经性麻痹反应（变态反应性脑脊髓炎）。WHO于1984年建议停止生产和使用神经组织疫苗，目前各国已陆续停止使用[3,6,72]。20世纪60年代起，采用细胞和组织胚胎培养技术生产的狂犬病疫苗（CellCultureandEmbryonatedEgg-basedRabiesVaccines,CCEEVs）取得了长足发展。由于采用了细胞培养和纯化技术，CCEEVs避免了产品中残留动物脑组织、细胞蛋白残留等引起的不良反应，提高了疫苗效价和免疫后抗体水平，减少了注射针次，最大限度降低了免疫失败病例[3]。现已证明，CCEEVs可安全有效地预防狂犬病[6]。目前广泛使用的有Vero细胞纯化疫苗、人二倍体细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗等。人二倍体细胞疫苗（HumanDiploidCellRabiesVaccine,

1HDCV）为美国Wistar研究所首创，随后法国Merieux研究所1974年获得生产许可，经多中心临床人体观察，该疫苗接种后不良反应发生率低、症状轻，免疫效果好。但是人二倍体细胞增殖慢，病毒产量低，疫苗成本高，价格贵，尚不能得到广泛应用[3]。纯化Vero细胞狂犬病疫苗由法国Merieux研究所于1985年获得生产许可，人体观察不良反应轻、效果好，与人二倍体细胞疫苗有着同样的安全性和效力。而且由于培养的狂犬病病毒滴度高、疫苗产量大、价格低，在世界范围得到了广泛的应用[3]。纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗根据不同厂家的临床观察，其不良反应较轻微，免疫效果、安全性和有效性均较好[73,74]。现代生物技术的发展为新型疫苗的研究提供了更多可能性，比如重组疫苗、DNA(Deoxyribonucleicacid)疫苗、多肽疫苗等。但是与纯化细胞疫苗相比，大部分没有优势，个别重组疫苗已应用于野生动物，但目前在人体的研究进展不明。例如，临床实验结果显示，含有狂犬病G蛋白的痘苗和金丝雀痘病毒载体疫苗接种2剂可产生中和抗体，但抗体水平低于人二倍体细胞疫苗[72]。（二）我国人用狂犬病疫苗的历史和现状1980年以前，我国一直生

2产和使用羊脑制备的经石炭酸灭活的脑组织疫苗。1965年，我国开始研制原代地鼠肾细胞培养的原液灭活疫苗，此疫苗须加入氢氧化铝（Al（OH）3）作为佐剂以增加疫苗效力，1980年获生产许可证书，当时以Habel法测定疫苗效力，要求保护指数≥10000，需皮下注射14针；后改用NIH法测定效价，效价定为1.3IU/2ml，免疫程序也改为5针法。FangtaoLin的研究显示，该疫苗注射后抗体水平高于羊脑疫苗[75]，对确诊为狂犬病的动物致伤的暴露者有保护作用。由于新疫苗效价仍较低且免疫失败病例频发，卫生部决定改进疫苗生产工艺，将疫苗培养的病毒原液超滤浓缩3-5倍以提高疫苗中抗原含量，使加入氢氧化铝佐剂后的疫苗效价能达到≥2.5IU的标准。然而，单纯浓缩疫苗在提高效力的同时，由于杂质蛋白残留物含量相应增高，不良反应发生率升高且症状加重，严重不良反应发生率达5%-10%。此后，为改进疫苗的质量特性，引入柱层析等纯化技术[76]去除杂质蛋白，疫苗仍然添加氢氧化铝佐剂，NIH法检测效价可达2.5IU以上，达到了WHO设定的疫苗有效标准。使用WHO推荐的通用的暴露前“3针法”和暴露后“5针法”，尽管添加氢氧化铝佐剂可以增加免疫效果，但会导致机体免疫应答缓慢，产生中和抗体延迟。由于狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫，疫苗诱导免疫的时效性非常重要。2005年，国家食品药品监督管理局要求去除氢氧化铝佐剂。临床研究显示，去佐剂疫苗的早期免疫反应明显高于佐剂疫苗，初次免疫14天中和抗体阳转率可达100%，且不良反应发生率低

3[77]。1990年以来，我国研制或引进Vero细胞为基质的纯化狂犬病疫苗大量上市，2014年，国产人二倍体细胞疫苗也批准上市，疫苗种类不断增多，我国目前批准上市的人用狂犬病疫苗种类见表1。表1.我国目前批准上市应用的人用狂犬病疫苗种类疫苗名称病毒毒种基质Vero细胞纯化疫苗PV、CTN和aG株Vero细胞人二倍体细胞疫苗PM株MRC-5人二倍体细胞地鼠肾原代细胞纯化疫苗aG株原代地鼠肾细胞原代鸡胚细胞纯化疫苗Flury-LEP株鸡胚成纤维细胞（三）人用狂犬病疫苗免疫程序的演变人类最早由路易巴斯德应用感染狂犬病病毒的干燥兔脊髓悬液的减毒活病毒尝试预防狂犬病，连续注射13针而获得成功。之后研发的灭活神经组织疫苗需连续接种14-21针。随着细胞培养疫苗的出现，疫苗的免疫原性有了较大提高，通过实验不同免疫针次和间隔时间进行抗体应答比较，对于效价高于2.5IU/剂的细胞培养疫苗可采用简化的接种程序，欧洲率先采用0、3、7、14、28、90天注射的6针接种程序。随着研究数据的积累发现第6针疫苗的接种并不能显著提高抗体水平，所以改为根据受种者机体的具体情况决定是否接种第6针[20]，一般情况下仅需要接种5针。之后，“5针法”被WHO推荐且

4目前仍在全球广泛应用。1984年，前南斯拉夫的Zagreb公共卫生研究院针对不同种类狂犬病疫苗进行不同间隔接种的免疫程序及优化接种程序的探索研究，结果显示，于0天左右上臂三角肌各接种1剂，7、21天再分别接种1剂的免疫程序所产生的中和抗体时间较早，且水平也较高，此免疫程序被称为“2-1-1”程序[78]。1992年WHO在狂犬病专家委员会第八次会议中正式推荐应用[79]。美国免疫实施顾问委员会(AdvisoryCommitteeonImmunizationPractices,ACIP）于2009年在综合已发表文献的基础上，建议健康成年人在规范处置的情况下，可采取原5针免疫程序减少最后1针的方法，即在0、3、7、14天注射的“简易4针法”免疫程序[80]。目前，WHO推荐的暴露后免疫肌内注射程序包括“5针法”（Essen法）、“2-1-1”程序（Zagreb法）以及ACIP推荐的“简易4针法”[22]。推荐的暴露前免疫肌内注射方案为3剂疫苗，分别在0、7和21或28天接种。我国批准上市的狂犬病疫苗的暴露后免疫程序包括“5针法”和“2-1-1”程序两种，各疫苗的免疫程序以国家食品药品监督管理总局批准的疫苗使用说明书为准。（四）人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准狂犬病病毒RNA编码核蛋白（N）、M1、M2、病毒包膜糖蛋白（G）和L五种蛋白，其中G蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性T细胞（helperT,Th）和细胞毒性T细胞（Cytotoxiclymphocyte,CTL）增生，并诱导机体产生特异性抗体[81]。G蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体[82]，免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。N

5蛋白也是一种有效的保护性抗原，能够刺激B细胞和Th细胞诱导产生细胞和体液免疫。磷蛋白（P）可诱导CTL，但保护作用较弱。机体在接种狂犬病疫苗约7天左右产生IgM（ImmunoglobulinM）抗体，在约14天后产生IgG（ImmunoglobulinG）抗体并迅速升高[83]。IgM和IgG抗体均具有中和病毒的能力[3]，有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。CTL的高峰出现在免疫后12天，可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒，Th细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体，也能增加保护效果。但Suss的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明[84]。由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守，氨基酸同源性达78%至93%，故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。狂犬病病毒的主要抗原部位为G蛋白外功能区，当其氨基酸同源性>74%时，病毒之间能够交叉中和，为同一遗传谱系内的病毒；膜外区的氨基酸同源性<62%时，则无交叉中和反应。目前疫苗株均属于遗传谱系I，对遗传谱系II中的病毒感染不具保护作用[3]。现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。目前为止，遗传谱系I的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别，也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。故现有疫苗可能无法为遗传谱系I外的

6其他血清型病毒感染提供保护。因此，用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒，并具有稳定生物学特性的固定毒株，其历史和来源应确证清楚，并经过全面的特征性检定，符合国家相关文件的要求。病毒灭活后制成的疫苗对人体安全且能产生有效的免疫保护作用[3]。WHO推荐用于疫苗生产的病毒固定毒株包括PasteurVirus、Pitman-Moore、Vnukovo-32、Flury鸡胚细胞低传代株（LoweggpassageLEP）和CTN株等[85]。人用狂犬病疫苗应符合WHO生物制品标准专家委员会（ExpertCommitteeonBiologicalStandardization,ECBS）制定的指导原则中对疫苗特性、生产及质量控制的要求[85]。用于制备疫苗的细胞基质应来源于健康动物，动物来源品系清楚。根据现行《中国药典》的要求，动物必须是清洁级或以上的动物。所用动物应符合实验动物微生物学和寄生虫学检测要求的相关规定。人二倍体及传代细胞应在限定代次内使用。病毒在细胞（或胚蛋）中增殖后，将收获的病毒进行浓缩、纯化、灭活，加入保护剂冻干而成。细胞培养疫苗的最低效价为在效期内每一剂肌注剂量达2.5IU以上，由NIH法检测确定。ELISA法检测糖蛋白等其他体外测定方法目前仍处于实验室验证阶段，但该方法已用于生产过程中抗原含量的控制[6]。疫苗需经临床前研究及临床试验，企业需获得国家食品药品监督管理总局批准的生产许可证方可生产疫苗。WHO建议对新申请注册的疫苗，在临床试验中检测0、14、28/30、180、360天血清中和抗体水平[3]。已经获准生产的人用狂犬病疫苗需按照国家食品药品监督管理总局的要求申请批签发，仅有获得批签发合格证的狂犬病疫苗批次方可上市使用。

7（五）疫苗的血清学效果评价WHO仅推荐小鼠脑内中和试验和荧光灶抑制试验（RFFIT）检测中和抗体，两种方法均可以正确评价疫苗免疫后的中和抗体水平，WHO认为免疫后血清中的病毒中和抗体≥0.5IU/ml即达到有效保护水平[3]。国内外疫苗的临床研究数据显示，疫苗按暴露后的“5针法”或“2-1-1”等免疫程序接种，大多可在接种后7天出现中和抗体，14天100%抗体阳转。而美国ACIP认为，疫苗暴露后免疫的14-28天中和抗体滴度已处于峰值，28天的第五针注射不能使抗体继续升高，因此，推荐美国健康成年人的暴露后免疫采用0、3、7和14天的4针免疫程序[80]。1．暴露前免疫Morris的研究显示，接受3针狂犬病疫苗，所有接种者的血清抗体均阳转，但抗体滴度与年龄增长呈负相关[86]。我国使用国产纯化人Vero细胞疫苗按照0、7、21天各1针的程序进行暴露前免疫，结果显示，受试者血清中和抗体阳转率为100%，几何平均滴度（Geometricmeantiter,GMT）为15.87IU/ml[87]。Sehgal的研究显示，采用0、7、21天程序的暴露前免疫血清中和抗体GMT为7.08IU/ml[88]。使用人二倍体细胞疫苗和Vero细胞疫苗分别采用2针（0、28天）和3针（0、7、28天）程序进行暴露前初次免疫，结果显示，初次免疫2针组1年后抗体明显下降，但3针组抗体阳性率仍能维持在87.9%-100%，加强免疫1针后

814天抗体水平迅速提高。暴露前程序经加强免疫后抗体可维持较高水平，免疫后3年时仍为12.6IU/ml，5年时为10.6IU/ml，第10年至少可维持96%阳性。此外，在满10年时再次加强免疫1针，观察全部对象的抗体滴度几乎又恢复到满1年加强1针后14天的水平[89]。2．暴露后程序（1）“5针法”程序的保护性研究2009年，RupprechtCE对1976年至2008年间发表的12篇狂犬病疫苗研究进行meta分析。全部研究共包含1000名受试者，所有受试者在第1针疫苗免疫后14天均产生中和抗体，使用细胞培养疫苗进行免疫接种后产生的抗体滴度一般高于10IU/ml[90]。王凌云等发现，对2-67岁健康人群按“5针法”免疫程序分别接种国产和进口冻干Vero细胞疫苗，接种后7天、14天两种疫苗血清抗体水平无显著性差异，且首剂接种后45天的抗体阳转率均达100%，14、45天血清中和抗体GMT均大于0.5IU/ml，两种疫苗间无统计学差异[91]。叶茂华等发现，经实验室确诊为狂犬病的犬只咬伤的7例暴露者使用5针法免疫后，全部获得保护[92]。ZhangXiaowei一项使用“5针法”免疫的持续5年的疫苗持久性研究显示，接种后产生的中和抗体具有良好持久性及免疫记忆效应[34]。（2）“2-1-1”程序的保护性研究Zagreb研究中心的研究结果显示，分别采用

9人二倍体细胞疫苗、原代牛肾细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗、Vero细胞疫苗按“2-1-1”程序免疫，第7天抗体阳转率分别为65%、38%、83%和78%，14天时全部阳转，抗体水平达到高峰，GMT为17.0-54.9IU/ml，继续观察至28天抗体水平基本保持不变。与0、7、21天各接种1针相比，抗体水平较高[78]。多项血清学研究显示，与5针程序相比，“2-1-1”程序第7天抗体阳转率和血清抗体水平均更高，14天和42天抗体水平无差异[93-95]。对于被狂犬咬伤的实际保护效果，Wasi在泰国进行的一项原代鸡胚细胞纯化疫苗临床观察中,82名确认为被狂犬病动物致伤的暴露者分别采用“6针法”（0、3、7、14、28、90天各接种一针）和“2-1-1”程序进行免疫接种，根据暴露的严重程度，部分暴露者同时注射狂犬病人免疫球蛋白。两种方法显示出相似的免疫应答，均能快速提供足够的抗体保护。所有暴露者接种后1年100%存活，中和抗体GMT仍高于0.5IU/ml的保护性水平[93]。使用Vero细胞疫苗对100名被狂犬严重咬伤的患者进行“2-1-1”程序免疫，同时注射被动免疫制剂，一年后所有人均存活[96]。国内对于经实验室确认为狂犬病犬只咬伤的暴露者进行Vero细胞疫苗“2-1-1”程序接种并联合应用被动免疫制剂，所有受种者抗体全部阳转，6月后均存活[97]。目前对“2-1-1”程序的持久性研究数据有限，Vodopija在1997年开展的研究中，分别采用人二倍体细胞、鸡胚细胞和Vero细胞纯化狂犬病疫苗进行免疫，第1100

10天测血清抗体GMT为0.61-0.97IU/ml，给予1剂加强后14天检测血清抗体水平，GMT增高至14.28-28.81IU/ml[98]。3．特殊人群VodopijaR的研究表明，使用原代鸡胚细胞纯化疫苗的“5针法”免疫程序接种无临床症状的人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）感染者，首剂接种后14天抗体阳转率为64%，30天为89%。有明显临床症状的艾滋病（AcquiredImmuneDeficiencySyndrome,AIDS）病人，且CD4＋（clusterofdifferentiation4）细胞数低于300/mm3者，对狂犬病疫苗免疫应答很差，首剂接种后14天抗体阳转率仅为25%，30天仅为42%[99]。对于使用免疫抑制药物的患者，狂犬病疫苗接种后应监测患者是否具有适当的病毒中和抗体应答[99]。妊娠妇女几乎均能对狂犬病疫苗产生正常的免疫应答，且对胎儿不会造成不良影响[100]。对接受器官移植的儿童进行肌内接种免疫反应良好[101]。4．疫苗效力及免疫失败Nicholson估计在发达国家中应用细胞培养疫苗免疫失败率为每80000人中1例，而发展中国家为每12000到30000人中发生1例[102]。早期最著名的狂犬病疫苗的保护性研究案例之一，是伊朗对45例被狂犬病

11动物致伤的患者接种6针次疫苗并联合注射抗狂犬病血清，所有接受暴露预防处置者均存活。出于伦理的考虑，对狂犬病疫苗有效性的研究不可能设置安慰剂对照，而仅可通过以往经验和案例记载估算，如不经疫苗免疫，预计有35%的严重致伤者将患狂犬病死亡[103]。后续在德国、美国以及泰国的狂犬严重暴露后免疫研究均得到类似的结果[104,105]。绝大多数狂犬病的发病是由于没有接受规范的暴露后预防处置，包括接受暴露后处置较晚，多处咬伤等严重暴露，以及头、颈部咬伤时难以彻底进行伤口清洗等。Krebs对于28例使用疫苗后仍发病的案例进行回顾性分析发现[106]，90%的病例未应用被动免疫制剂，或者应用方法不当。其他操作失误包括应用疫苗24小时前进行了被动免疫、局部伤口清洗不当、多部位咬伤未发现细小伤口而遗漏处理、疫苗注射部位不正确（如注射臀部而非三角肌）。只有两例为严重面部咬伤的患者，虽进行了被认为正确的暴露后处置仍然发病。一项使用原代鸡胚细胞纯化疫苗的有效性随访研究共报道46例可疑失败病例，43例发生在印度，3例发生在泰国，分析显示所有案例均未完全执行WHO的暴露预防处置指南[107]。2007年Wilde等研究综合报道了7例失败病例，均经过正确规范的伤口处理和暴露预防处置，并接受人二倍体细胞疫苗或Vero细胞疫苗及抗血清或人免疫球蛋白注射。免疫失败的原因可能包括：1、存在不易察觉的微小穿透性损伤，致使伤口未得到冲洗、消毒，局部未注射免疫球蛋白；2、

12病人伴有未被发现的免疫功能减低性疾病或应用免疫抑制性药物而未报告[108]。王世清的研究显示，暴露后处置失败率为1.24/万，主要原因为狂犬病被动免疫制剂应用率低，未完成全程接种等[109]。5.疫苗安全性WHO的立场文件中指出[22]，不同种类狂犬病疫苗的安全性和耐受性整体较好。不良反应的出现与狂犬病疫苗的纯度、制备工艺、处方成分及剂型有关，并可能与产品各批次间的差异相关。此外，疫苗的使用方式（如肌肉注射或皮内注射）和受种者的个体差异也有影响。据统计，约有35%-45%的受种者接种部位会出现一过性轻微红疹、疼痛和/或红肿，在接种加强针次时尤为显著。5%-15%的受种者曾观察到一过性发热、头痛、头晕、胃肠道症状等轻微全身不良反应，过敏、神经系统症状等严重不良反应罕见。1997-2005年，据美国疫苗不良事件报告系统（VaccineAdverseEventReportingSystem，VAERS）显示，在鸡胚细胞疫苗的所有不良反应中严重不良反应占7%，主要为神经系统反应和过敏反应，神经系统反应临床表现不一，过敏反应主要表现为荨麻疹、皮疹和血管性水肿[110]。对人二倍体细胞疫苗安全性和免疫原性的观察中

13，超过1770名志愿者中观察到的不良反应如下：严重上臂疼痛（15-25%）；头痛（5-8%）；不适、恶心，或两者兼有（2-5%）；过敏性水肿（0.1%）[111]，过敏反应主要发生于加强免疫之后[112]。加强免疫后，全身过敏反应发生率上升至6%[113]。细胞培养疫苗的神经系统并发症少。在注射人二倍体细胞疫苗的数百万个体中，共报告发生5例中枢神经系统疾病，包括GBS及急性播散性脊髓炎，不超过疾病的基础发生率，可能与接种疫苗无关。目前大规模使用的Vero细胞疫苗及原代鸡胚细胞纯化疫苗的神经系统并发症与人二倍体细胞疫苗相仿[72]。国内对国产与进口Vero细胞疫苗安全性对比研究发现，国产疫苗的局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒的发生率分别为1.4%、0.8%、17.1%和2.4%；发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他全身反应的发生率分别为1.2%、0.4%、2.4%、4.2%和0.3%，上述不良反应均在第7天完全消失，与进口疫苗的安全性基本一致[91]。对于肌内接种和皮内接种的不良反应发生率比较，有部分研究显示二者并无显著性差异，但也有研究显示皮内接种的不良反应发生率高于肌内接种，主要表现为局部红斑、疼痛和肿胀，但总体来讲反应较轻微。目前的研究表明，“2-1-1”程序与“5针法”程序比较，不良反应发生率无显著性差异[114,115]。研究表明，孕妇接种狂犬病疫苗是安全的，并且不会对胎儿造成影响。对202名孕妇接种Vero细胞狂犬病疫苗的观察发现，孕妇的不良反应发生率与非孕妇无显著性差异[116-118]，国内大量研究的结论与上述观点一致[119-123]。

14（六）暴露前及暴露后预防成本效益评价国外对于暴露后预防成本效益的相关评价,由于研究地区的自然、社会和经济条件不同，得到的结论也不尽相同。Pannipa关于泰国儿童暴露前预防与暴露后预防的成本比较发现，当犬咬伤率达到2-30%时，对于儿童采取暴露前免疫和暴露后免疫的预防成本一致，具体取决于应用何种暴露后程序[124]。美国的研究表明，当感染狂犬病的可能性大于0.7%时候，暴露后免疫是经济的。对于低风险区，避免1例发病的成本在50万到100万美金之间，具体数额取决于风险程度[124-126]。Shim在坦桑尼亚的研究显示，每伤残调整生命年（DisabilityAdjustedLifeYear,DALY）医疗花费为27美元，政府花费为32美元。成本效益较低，但对于1%的真正暴露于狂犬病的人群来说，非常符合成本效益原则[127]。国内学者周世红通过建立暴露前及暴露后预防方案的狂犬病发病(死亡)及成本的决策树模型,进行成本效果分析和敏感性分析。在每10万人中,暴露前预防可避免12人发病，暴露后预防可避免8人发病，暴露前预防避免1例发病的成本为273.34万元，暴露后预防避免1例发病的成本为19.60万元，前者为后者的14倍[128]。王传林等对暴露后5针程序和“2-1-1”程序进行经济成本分析，测算直接医疗成本、直接非医疗成本和间接成本，两种程序的就医成本分别为694元、482.2

15元，每名患者节省超过210元，按每年暴露后接种疫苗1400万人计算，采用“2-1-1”程序，全国的就医总成本将节约29.63亿元[129]。