人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程

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1、人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程本品系用狂犬病固定毒（aG）适应株接种原代地鼠肾单层细胞，培养后收获病毒液，加入甲醛溶液灭活后浓缩，再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。1毒种1.1毒种来源狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后，再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。生产用毒种传代应不超过10aG交替代。1.2毒种检定1.2.1无菌试验aG毒种每次传代收剖后均须做无菌试验，合格者方可使用。1.2.2病毒滴定aG毒种用体重11～13g小白鼠进

2、行脑内病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。1.2.3纯毒试验生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。1.3毒种传代选择体重120～160g健康豚鼠，脑内注射，选潜伏期80～100小时具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑。豚鼠脑连续传代不超过5代。1.4毒种保存供生产用aG株在-60℃以下保存，不得超过1年。2疫苗制造2.1细胞制备2.1.

3、1地鼠选用12～14日龄健康地鼠，如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。2.1.2解剖处死地鼠，用消毒液洗涤皮毛数次，末次浸泡一定时间，无菌取肾，置于瓶中剪碎。2.1.3细胞消化及分装将剪碎肾块洗涤数次，加入适量胰蛋白酶消化液，置2～8℃过夜（约16～20小时）或37℃水浴消化适当时间，弃去消化液，经洗液洗涤2～3次，振摇或吹打分散细胞，加入适量生长液，分装培养瓶，置37℃±0.5℃培养长成单层。2.1.4使用液体均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。2.1.4.1生长液为含不超过10%小牛血清水解

4、乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，可加入适量抗生素。2.1.4.2浸泡液为水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，其中保护剂可选用0.1%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。2.1.4.3维持液为199或其他适宜的溶液，其中保护剂中可选用0.4%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。2.1.5外源因子检查每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞（4℃保存不超

5、过7天）进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果；再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。2.2病毒接种和病毒液收获2.2.1病毒接种将长成单层细胞瓶倾去营养液，换入浸泡液。同时将无菌试验合格的aG株摇碎后，经1000r/min离心10分钟，吸取上清液按1∶1000～1∶4000种入细胞瓶，也可将细胞与病毒同时接种，置32～37℃继续培养。2.2.2洗换种毒后吸附适当时间倾去浸泡液，用Hanks液或

6、其他适宜液体洗涤细胞，然后换入维持液，置32～37℃继续培育。2.2.3病毒液收获洗换后观察细胞生长情况，选择适当天数收获病毒液，取样品做病毒滴定及无菌试验。2.2.4病毒滴定将样品做10倍系列稀释，取3个稀释度的病毒液，每个稀释度用体重11～13g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，14日判定结果，计算LD50（3日内死亡者不计）。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上。可重试1次。2.3灭活病毒液内加入1/4000～1/5000的甲醛溶液，置32～37℃或2～8℃或其他适宜温度

7、灭活一定时间。2.4过滤合并将无菌试验合格的病毒液用滤球或绢布过滤后合并即为原液。2.5防腐剂按0.005%～0.01%加入硫柳汞。2.6超滤浓缩原液按其滴度进行不同倍数浓缩。按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。3疫苗剂型3.1液体浓缩疫苗病毒液灭活经超滤浓缩后再加入Al（OH）3，使最终含量为0.4～0.7mg/ml。3.2冻干浓缩疫苗用适当方法进行超滤或精制，然后冻干。3.2.1冻干保护剂1%明胶和5%蔗糖或其他适宜保护剂。3.2.2疫苗稀释将保护剂按比例加入疫苗内，充分摇匀，取样做冻干前无菌

8、试验后立即分装与冻干。4半成品检定4.1无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。4.2灭活试验将样品脑内接种体重11～13g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应健存，非特异死亡不超过20%。小白鼠如发病死亡，可继续灭活并进行灭活试验。4.3残余牛血清蛋白含量用检定所认可的试剂和方法测定，液体浓缩疫苗与冻干浓缩疫苗牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。5分装半成品检定合格后即可进行分装。液体浓缩疫苗每支装量2ml，冻干浓缩疫苗每支装量1ml或2ml。