《中国西部四省区散养肉牛BVDV流行病学调查和一株分离毒株的全基因组测序》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
？一一．５５ＳＭｆ心密级：无－２０－论文编号：８２１１０１３０１？－＊？－一？一——中園兽医剪馬监察所、硕壬学位论文中国西部巧省区散养肉牛ＢＶＤＶ流行病学调查和一株分离毒株的全基因绝测序ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅＳｔｕｄｙａｎｄＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｏｖｉｎｅＶ－ｉｒａｉＤｉａｒｒｈｅｉ！ＶｉｒｕｓｉｎＦｒｅｅｒｏａｍｉｎＢｅｅｆＣａｔｔｌｅｉｎｇＷｅｓｔｅｒｎＦｏｕｒＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＲｅｇｉｏｎｓｏｆＣｈｉｎａａｎｄＷｈｏｌｅＧｅｎｏｍｅＳｅｅｕｄｎｏｆＯｎｅＩｓｏｌａｔｅｄＳｔｒａｉｎｑｇ（躁题来源；动物疫苗制剂及下游工艺技术巧究与示范编号：Ｐ２０１５００３０％）巧究生：陈锐指导教师．；赵追祖研究员申请学位类别．：农学硕去学科专业：预防兽塞学／研究方向：动物菊毒学＇学位授予单位：中国兽医药品监察所２０１６年４月． 独倒性声明，本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的作品的构的学位或证内容，也不包为中国兽医药品监察所或其它教育机含获得。工献用过的料对本论文所涉的研作做出贡的其他个人和书而使材及究集体，均己在文中明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任承。由本人担论签：学位文作者名６６［＞〇年月曰１么关于论用授权的文使说明，、使学位论文的规定本人完全了解中国兽医药品监察所有关保留用邑，论的印和磁盘，论查和；中监所有权保留送交文复件允许文被阅借阅Ｐ采印、印或扫描制手段保存、汇编学位论文。同意中国可用影缩等复药品监所可Ｗ用不同方在不同体上、论文的全兽医察式媒发表传播学位分容。部或部内解应遵此协密学位论文密后守议保的在），（生签；时间：月日研名年究时；月导师签名：取的间年／日备若＾Ａ奴 中国兽医药品监察所硕士学位论文摘要摘要牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的可导致养牛业重大经济损失的疾病。该病在中国广泛流行，已经有20多个省市自治区相继报道了本病的发生。本研究以我国西部散养肉牛为研究对象，通过血清学方法、病毒分离以及全基因组测序、生物信息分析，评估牛病毒性腹泻病毒在中国散养肉牛中的流行状况，探究国内流行的BVDV基因多样性，为制定合理防控措施和疫苗的研发提供理论依据与素材。2014-2015年从云南、新疆、甘肃和内蒙古四省区采集健康散养肉牛的血清样本1332份，利用IDEXX公司BVDV抗体检测试剂盒进行检测。将阻断率S/P≤0.6的阳性血清以及抗体阴性的血清样本进行BVDV抗原检测，阳性或可疑血清接种MDBK细胞分离病毒，经RT-PCR测定BVDV5-'UTR序列和Npro序列并绘制流行毒株系统进化树，确定分离毒株的基因型。然后，对内蒙1369病毒（命名为NM1369）进行细胞驯化培养，测定TCID50。参考NADL毒株全基因组序列，设计特异性引物对，测序获得全基因组序列。并将NM1369全基因组序列在GenBank中进行BLAST比对，比较分析基因组序列信息。四省区散养肉牛BVDV抗体阳性率为33.93%。其中，内蒙古血清抗体阳性率71.43%、新疆57.69%、甘肃16.54%、云南10.0%。BVDV抗原阳性率为1.58%，其中新疆抗原阳性率最高（5.49%）。本研究共分离13株BVDV流行毒株，分别命名为甘肃120、内蒙1369、伊犁霍清12953、伊犁霍清12960、伊犁霍清12981、博州精河13001、博州精河13023、博州精河13033、新疆奇台13041、新疆奇台13042、新疆奇台13191、新疆奇台13220、新疆奇台13251。进化树分析显示新疆地区分离毒株归为BVDV-1q和BVDV-1f，内蒙古地区分离毒株属于BVDV-1m，甘肃地区分离毒株属于一种新的基因亚型BVDV-1u。测序结果表明，NM1369基因组为12268bp，编码3902个氨基酸。对全基因组进行分析，根据其5'UTR序列和Npro序列，确定NM1369属于BVDV-1m基因亚型。NM1369与BVDV其它参考毒株对比发现，核苷酸同源性为74.0%-94.8%。其中,NM1369与中国分离毒株ZM-95以及SD-15的同源性最高，核苷酸同源性为94.8%。通过细胞驯化培养，NM1369可以很好适应MDBK细胞。间接免疫荧光试验测定病毒滴度为105.24TCID50/0.1ml。散养肉牛整体BVDV感染水平较规模化奶牛场轻，但不同省市差异明显，要整体布控重点防范。同时，BVDV流行毒株的多样性也应引起我们重视，除筛选淘汰持续性感染牛外，还要加强管理切断BVDV跨物种传播途径。关键词：BVDV；散养肉牛；ELISA；基因分型；全基因组测序I 中国兽医药品监察所硕士学位论文ABSTRACTABSTRACTBovineviraldiarrheaiscasuedbyBovineviraldiarrheavirus(BVDV)whichcanresultinsignificanteconomiclossesinthecattleindustryworldwide.BVDViswidelydistributedandhasbeendetectedinmorethan20provincesinChina.ToassesstheoverallprevalenceofBVDVinChinesefree-roamingbeeves,thefree-roamingbeevesintheWesternofChinawereusedinthepresentstudybythemethodsofserologicalandbioinformaticanalysis.Then,thegeneticdiversityofBVDVwasanalyzed.Thisstudycanprovidetheoreticalbasisforthedevelopmentofreasonablepreventionandcontrol,andforthevaccinedevelopment.1332serawerecollectedinYunnan,Xinjiang,GansuandInnerMongoliafrom2014to2015.Thesesampleswereanalyzedbythecommercialantibody(Ab)detectionkits,andtheAbpositiverateofBVDVinvariousregionsweresummarizedup.Meanwhile,thepositiveorsuspicioussamples,whoseS/Pwerelessthan60%werefurtherdetectedbytheAgdetectionkit.Then,toisolateBVDV,thepositivesampleswereinoculatedintotheMDBKcellsandpassagebyfivegenerations.IdentifygenotypeofclinicalstrainsbyRT-PCRbasedonthe5'-UTRandNpro,respectivelysequencingandphylogeneticanalysis.Then,avirus(designatedasBVDV-NM1369)wouldbeculturedadaptivelyinMDBKandTCID50trialalsowouldbeconduted.ReferingtoNADLstandardstrainsequence,asetofprimersweredesigned.ThegenomesequencewasabtainedbyPCRandsequcing.Last,thegenomesequenceofBVDV-NM1369wasanalysisedcompareingwiththedomesticandoverseasstrainsbyBLAST.ResultsshowedthattheaverageAbpositiverateofBVDVwas33.93%inthefourdetectedprovincialregions.Amongthem,theInnerMongoliapositiveratewasthehighest(71.43%),withXinjiangtakingthesecondplace(57.69%),Gansuthethird(16.54%)andYunnanthelowest(10.0%).TheaverageAgpositiverateofBVDVwasonly1.58%,withXinjiangthehighest(5.49%).Inthisstudy,atotalof13BVDVstrainswereisolated,theywerenamedasGansu120,Mongolia1369,Yilihuoqing12953,Yillihuoqing12960,Yilihuoqing12981,Bozhoujinghe13001,Bozhoujinghe13023,Bozhoujinghe13033,Xinjiangqitai13041,Xinjiangqitai13042,Xinjiangqitai13191,Xinjiangqitai13220,Xinjiangqitai13251,respectively.Thepolygenticanalysisindicatedthattheseisolatedcouldbemainlyclassifiedintofoursubtypes:BVDV-1qandBVDV-1f(isolatedinXinjiang),BVDV-1m(isolatedinInnerMongolia)andBVDV-1uwhichwasanewsubtypeisolatedinGansu.TheresultofsequencingofNM1369showedthatitwascomposedof12268nucleotidesinlength,deduced3902aminoacid.The5'-UTRandNprosequenceswereanalyzedbyClusWandconstructionofphylogenetictrees,whichrevealedthatBVDV-NM1369belongedtoBVDV-1m.Comparedwithotherreferencestrains,nucleotidehomologyrangewasbetween74.0%and94.8%.Amongthem,thestrainsofhighesthomologywhichwas94.8%wereZM-95andSD-15isloatedinChina.NM1369wasInoculatedintomonolayerMDBKcellsandpassagedserially.ThetiterofNM1369was105.24TCID50/0.1mlII 中国兽医药品监察所硕士学位论文ABSTRACTdeterminatedbyindirectimmunoinfluscentassay(IFA)。ThewholelevelofBVDVinfectionamongfree-rangebeefcattleswaslowerthanthatinthescaledairyfarms,howevertherewasabigvariationofprevalencelevelwithdifferentprovinces.Weshouldmakeoveralllayout,butpreventiondiscriminatingly.Inaddition,highgeneticvariabilityofbovineviraldiarrheavirusmightbeconcerned,therefore,identificationandremovalofpersistentinfectionanimalsandcuttingofftransmissionroutesbystrengthenmanagementarenecessary.KeyWords:Bovineviraldiarrheavirus(BVDV);Free-roamingbeefcattle;Enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA);Genotyping；WholegenomesequencingIII 中国兽医药品监察所硕士学位论文目录目录摘要....................................................................................................................................................................IABSTRACT.....................................................................................................................................................II目录.................................................................................................................................................................IV缩略词表......................................................................................................................................................VIII插图及附表清单.............................................................................................................................................X第一章文献综述..........................................................................................................................................1前言...............................................................................................................................................................11.1牛病毒性腹泻病原学..........................................................................................................................11.1.1牛病毒性腹泻病毒的生物学分类...............................................................................................11.1.2牛病毒性腹泻病毒的理化特性...................................................................................................21.1.3牛病毒性腹泻病毒的基因组结构与功能..................................................................................21.1.3.15'-非编码区..............................................................................................................................31.1.3.23'-非编码区..............................................................................................................................31.1.3.3BVDV大开放阅读框.............................................................................................................31.1.4牛病毒性腹泻病毒基因组编码蛋白的结构及功能.................................................................41.1.4.1非结构蛋白..............................................................................................................................41.1.4.2结构蛋白...................................................................................................................................51.2牛病毒性腹泻病流行病学..................................................................................................................51.2.1牛病毒性腹泻病流行特点..........................................................................................................51.2.2牛病毒性腹泻病临床表现..........................................................................................................61.2.3牛病毒性腹泻病检测方法..........................................................................................................61.3牛病毒性腹泻病防控策略..................................................................................................................71.3.1BVDV控制动力与机遇............................................................................................................71.3.2国外BVDV控制项目...............................................................................................................71.3.3国内BVDV控制面临挑战.......................................................................................................81.3.3.1自愿或强制控制......................................................................................................................81.3.3.2相关基础设施建设..................................................................................................................8IV 中国兽医药品监察所硕士学位论文目录1.3.3.3检测...........................................................................................................................................81.3.3.4防止再次引入病毒..................................................................................................................9第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查...............................................................................102.1引言......................................................................................................................................................102.2材料......................................................................................................................................................102.2.1主要试剂、耗材.........................................................................................................................102.2.2主要仪器......................................................................................................................................112.3方法......................................................................................................................................................112.3.1样品收集与保存..........................................................................................................................112.3.2BVDV抗体检测..........................................................................................................................112.3.3BVDV抗原检测..........................................................................................................................122.4结果......................................................................................................................................................132.4.1血清抗体阳性率..........................................................................................................................132.4.2血清抗原阳性率..........................................................................................................................132.5讨论......................................................................................................................................................14第三章病毒分离与基因亚型分析........................................................................................................153.1引言......................................................................................................................................................153.2材料......................................................................................................................................................153.2.1主要试剂、耗材.........................................................................................................................153.2.2主要仪器......................................................................................................................................163.2.3细胞..............................................................................................................................................163.2.4引物设计......................................................................................................................................163.3方法......................................................................................................................................................173.3.1病毒分离......................................................................................................................................173.3.2间接免疫荧光法鉴定分离毒株................................................................................................173.3.3分离毒株RNA提取..................................................................................................................173.3.4RT-PCR..........................................................................................................................................183.3.5PCR产物电泳与纯化.................................................................................................................193.3.6测序..............................................................................................................................................193.3.7构建系统进化树.........................................................................................................................19V 中国兽医药品监察所硕士学位论文目录3.4结果......................................................................................................................................................213.4.1分离得到毒株.............................................................................................................................213.4.2RT-PCR扩增片段........................................................................................................................223.4.3测序结果......................................................................................................................................233.4.4构建系统发育树.........................................................................................................................233.5讨论......................................................................................................................................................25第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序....................................................................................274.1引言......................................................................................................................................................274.2材料......................................................................................................................................................274.2.1主要试剂、耗材..........................................................................................................................274.2.2仪器...............................................................................................................................................284.2.3溶液的配制...................................................................................................................................284.2.4引物设计......................................................................................................................................314.2.5细胞和标准毒株.........................................................................................................................314.3方法......................................................................................................................................................324.3.1PCR扩增......................................................................................................................................324.3.2PCR产物电泳与纯化.................................................................................................................324.3.3PCR纯化产物末端加A.............................................................................................................334.3.4加A产物与质粒载体连接.......................................................................................................334.3.5转化..............................................................................................................................................334.3.6STET微量裂解法制备质粒DNA鉴定转化克隆..................................................................344.3.7酶切鉴定转化克隆.....................................................................................................................344.3.8酶切产物电泳分析.....................................................................................................................354.3.9增菌培养......................................................................................................................................354.3.10质粒提取....................................................................................................................................354.3.11测序............................................................................................................................................354.3.12细胞驯化培养...........................................................................................................................364.3.13间接免疫荧光试验测定NM1369病毒滴度.......................................................................364.4结果......................................................................................................................................................374.4.1不同片段PCR扩增产物电泳结果..........................................................................................37VI 中国兽医药品监察所硕士学位论文目录4.4.2不同阳性克隆株酶切产物电泳结果.......................................................................................384.4.3全基因组序列分析.....................................................................................................................384.4.4NM1369株生物分型和毒价测定.............................................................................................394.5讨论......................................................................................................................................................40第五章结论..................................................................................................................................................415.1实验结论..............................................................................................................................................415.2创新点..................................................................................................................................................41参考文献.........................................................................................................................................................42致谢.................................................................................................................................................................48作者简历.........................................................................................................................................................49VII 中国兽医药品监察所硕士学位论文缩略词表缩略词表英文缩写英文全称中文全称BVDVBovineViralDiarrhoeaVirus牛病毒性腹泻病毒BDVBorderDiseaseVirus羊边界病病毒CSFVClassicalSwineFeverVirus猪瘟病毒HCVHepatitisCVirus丙型肝炎病毒ORFOpenReadingFrame开放性阅读框5'-UTR5′untranslatedregion5′端非编码区3'-UTR3′untranslatedregion3′端非编码区OIEOfficeInternationaldesEpizooties世界动物卫生组织TEBufferTris-EDTABufferTris-EDTA缓冲液DNADeoxyribonueleicAcid脱氧核糖核酸RNARibonucleicAcid核糖核酸dNTPdeoxyribonucleteicAcid三磷酸脱氧核苷AmpAmpicillin氨苄青霉素MEMMinimumEssentialMedium基础培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMedium基础培养基X-gal5-bromo-4-chloro-3-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷dNTPdeoxyribonucleteicAcid三磷酸脱氧核苷2×YTYeastExtractandTryptonemedium2×YT培养基PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应ReverseTranscriptionPolymeraseChainRT-PCR反转录聚合酶链式反应ReactionEDTAEthyleneDiaminetetraaceticAcid乙二胺四乙酸IPTGIsopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代糖苷PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液BTCattleTurbinatesCells牛鼻甲骨细胞MDBKMadin-Darbybovinekidney(cells)马-达氏牛肾细胞ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验DEPCDiethylPyrocarbonate焦碳酸二乙酯ddH2Odoubledistilledwater双蒸水VIII 中国兽医药品监察所硕士学位论文缩略词表PIPersistentinfection持续性感染TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷E.coliEscherichiacolibacteria大肠杆菌NTPaseNucleosidetriphosphatas核苷三磷酸酶活性CPEcytopathiceffect细胞病变rpmrevolutionsperminute每分钟转数ODOpticalDensity光密度ggram克Mmole/liter摩尔/升mMmillimole/liter毫摩尔/升mLmilliliter毫升μLmicroliter微升bpbasepair碱基ntnucleotide核苷酸IX 中国兽医药品监察所硕士学位论文缩略词表插图及附表清单图(表)注序号图(表)注说明页码图1-1HoBi-like病毒分布2图1-2BVDV基因结构模式图3图1-3不同群组BVDV感染示意图5图3-1BVDV5'-UTR序列扩增片段20图3-2BVDVNpro序列扩增片段20图3-3基于5'UTR序列（281bp）利用邻位法构建的遗传进化树21图3-4基于BVDVNpro序列（429bp）利用邻位法构建的遗传进化树22图4-1BVDV全基因组测序不同区段不同引物及单一酶切位点模式图28图4-2不同片段PCR扩增产物鉴定34图4-3不同阳性克隆株酶切鉴定35图4-42上质粒酶切鉴定35图4-52下质粒酶切鉴定35图4-66#质粒酶切鉴定35图4-7NM1369与12个参考株核苷酸同源性比较36图4-8NM1369生物型鉴定36图4-9间接免疫荧光试验36表1-1BVDV灭活苗疫苗与弱毒疫苗比较7表2-1四个省市、自治区采集的健康散养肉牛血液样品11表2-2四个省市、自治区散养肉牛BVDVAb阳性率13表2-3不同省市、自治区散养肉牛BVDVAg阳性率14表3-1用于扩增BVDV5'UTR序列和Npro序列的引物序列16表3-2分离病毒的来源19表4-1用于扩增BVDV全基因组的引物序列28表4-2用于序列比较的参考毒株信息33X 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述第一章文献综述前言牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）又称牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（BovineviraldiarrheamucosalDiseasevirus，BVD/MDV），与羊边界病毒（Borderdiseasevirus,BDV）、猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）同属黄病毒科瘟病毒属[1]。1946年Olafson等人在纽约州的病奶牛中首先发现了牛病毒性腹泻病（BVD）[2]，该病临床表现发病率较高而死亡率较低。1951年Ransey和Chiver在美国衣阿华州发现了牛粘膜病并分离到毒株[3]，该病临床表现发病率较低而死亡率较高。1954年，Baker等人首次通过细胞培养分离到牛急性病毒性腹泻相关病原，并命名为牛病毒性腹泻病毒[4]。随后十年，人们陆续分离到了BVDVNY-1[4]、C24V[5]、Singer[6]和NADL[7]。至今为止，它们一直被作为参考毒株和疫苗毒株。1971年，美国兽医协会将牛病毒性腹泻病和牛粘膜病统一命名为“BVD/MD”(Bovineviraldiarrhea/mucosaldisease)[8-10]。牛感染BVDV后，主要表现为急、慢性粘膜病、腹泻、免疫抑制、持续感染与免疫耐受、母畜流产、死胎和畸形胎等[11,12]。近年来，我国养牛规模不断增大，但各牛场缺乏系统的监测及防控措施，导致我国牛群报告感染BVDV逐渐增多[13]。由于BVDV能引起繁殖系统病变并形成持续性感染，所以会对养牛业的健康发展形成巨大冲击。成功的控制策略不仅仅包括疫苗免疫，还要包括PI牛淘汰监督以及采取生物安全措施防止BVDV引入牛群[14]。1.1牛病毒性腹泻病原学1.1.1牛病毒性腹泻病毒的生物学分类BVDV是黄病毒科瘟病毒属的一员，黄病毒科代表病毒还包括西尼罗河病毒、登革热病毒、黄热病毒和丙型肝炎病毒（HCV），它们具有相同的基因和结构特点：a）基因组为单股正义链RNA，可以编码一个大的多聚蛋白；b）多聚蛋白经过细胞和病毒的蛋白酶修饰后可以形成成熟的病毒蛋白；c）有囊膜，它的表面携带病毒糖蛋白。囊膜是在病毒组装和成熟阶段出芽时期获得的。黄病毒科瘟病毒属的代表病毒主要包括猪瘟病毒、边界病毒和牛病毒性腹泻病毒，它们除了具有上述病毒的一般特点之外，其开放阅读框还可以编码两种黄病毒科其它病毒没有的蛋白即Npro和Erns[15]。此外，这三种瘟病毒在血清学上具有交叉反应[16]。1994年，随着分子生物学研究的不断进步，人们发现瘟病毒属与黄病毒科的病毒在病毒粒子成份、核苷酸与氨基酸序列的同源性、开放阅读框表达的第一个蛋白酶活性等诸多方面有着根本性差异[17]。因此，Rumenapf和Hustls建议将瘟病毒属单独列为瘟病毒科[18]。最初，牛病毒性腹泻病毒是以分离宿主为基础而进行命名的，任何源自牛的瘟病毒都被称为BVDV。后来，Fernelius等人[19]通过证明不同种类瘟病毒可以感染多个宿主才弃用了上述命名方式。利用血清学方法区分瘟病毒种类有一定成效[20-25]，但由于抗原交叉反应使该方法使用受阻[20,26-29]。于是，人们根据是否引起细胞病变将BVDV分为两个生物型即致细胞病变型（CP型）和非致细胞1 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述病变型（NCP型）。后来，人们利用进化分析，基于5'-UTR、Npro和部分E2序列，将BVDV分为两个基因型BVDV-1型和BVDV-2型，每个基因型又分为多个基因亚型。2004年，欧洲学者在巴西进口的胎牛血清（FBS）中分离到HoBi-like病毒[30]。至此之后，人们对该病毒进行了陆续的报道[30-34]（如图1-1.HoBi-like病毒分布（图片来自Bauermann等人，2015）（a）北美和（b）澳大利亚的胎牛血清中检测到了HoBi-like病毒；（1）20世纪90年代后期巴西的家牛和野牛都被证明感染了HoBi-like病毒；（2）2007年，2010-2011年意大利也报道了HoBi-like病毒感染病例；（3）印度、（4）孟加拉国和（5）泰国也都发现了HoBi-like病毒。图1-1）。Hobi-like病毒可能是一种新型的BVDV-3病毒，目前还没有等到官方的认可，需要进一步试验验证。一些研究发现不同基因型BVDV病毒能够产生交叉保护力[35-37]，但也有一些研究论证了BVDV基因型与分离毒株间只存在部分交叉免疫保护[38]。1.1.2牛病毒性腹泻病毒的理化特性BVDV的核衣壳为非螺旋20面体对称结构，其病毒粒子略呈圆形，直径40-60nm，囊膜表面有一环形亚单位。蔗糖密度梯度法测定病毒的浮密度是1.13-1.14g/cm3，病毒粒子的沉淀系数是80-90S。BVDV对某些有机化合物较敏感（如乙醚、氯仿等），在pH为3以下的酸性环境中易被破坏。对热的抵抗力不强，在56℃会很快被灭活。病毒在低温下稳定，真空冻干病毒能在-60℃温度下保存多年。有研究发现[39]，在自然条件下，BVDV的存活时间取决于环境温度和湿度，5℃时可以存活3周，20℃时仅存活3天。大多数报道称BVDV没有血凝性，但也曾有某些毒株能够凝集猪、雏鸡和绵羊红细胞的报道[18,40]。1.1.3牛病毒性腹泻病毒的基因组结构与功能BVDV属于单股正链RNA病毒，非致细胞病变型基因组全长约12.3kb[41,42]，CP型由于基因组2 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述重复或细胞RNA插入等原因其全长与具体毒株相关。整个基因组包含一个大的开放阅读框（ORF），编码病毒所有蛋白。BVDV基因组RNA3'-末端没有多聚腺甘酸Ploy（A）尾巴，5'-末端也没有帽子结构[42,43]。3'-末端和5'-末端的核苷酸序列不编码蛋白质，被称为3'-非编码区（3'-UTR）和5'-非编码区（5'-UTR），如图1-2所示。图1-2.BVDV基因结构模式图（图片引自JohnD.Neill，2013年）1.1.3.15'-非编码区BVDV5'-非编码区约380bp，该区核苷酸序列保守程度很高，可以作为基因分型的依据[44]。该区域存在着一个保守的茎环样二级结构域Ia发夹，茎由18个碱基组成，富含高度保守的GC和AU碱基对，环由14个碱基组成，其中含有2个保守碱基[45,46]。5'-UTR19-391位核苷酸折叠形成的二级结构是核糖体进入的位点，这与口蹄疫病毒相类似。核糖体进入位点是BVDV起始转录所必需的，这一过程不受病毒帽子结构的限制，而是通过核糖体结合到病毒RNA内部核糖体进入位点上起始转录，其转录效率在病毒毒力上有直接体现。1.1.3.23'-非编码区BVDV的3'-UTR始于ORF的终止密码子TGA，包含223-230个核苷酸。在3'-UTR序列内有60bp富含AT的序列，有一个8核苷酸重复序列（TGTATATA）[47]。3'-UTR的3'-末端存在4个胞嘧啶组成的游离单链区以及两个稳定的茎-环结构序列SL-I和SL-II。在SL-I和SL-II之间有一段较长的单链间隔序列SS[18]，通过D19CRNA突变分析发现，SL-I、SS基序对RNA复制具有重要影响。如果发生SL-I茎的缺失、SS或SL-I环区单链核苷酸的替换，如125-127为的MGU替换GGA或128位U替换为C，将会导致病毒RNA复制能力的丧失，但SL-I茎的补偿性碱基替换不会令RNA丧失复制能力，仅仅降低了复制效率。有意思的是，如果SS区域的序列发生碱基置换对RNA复制能力几乎没有影响。因此，研究认为BVDV的茎-环结构为RNA复制的顺式作用元件[12]。此外，3'-UTR的结构、功能及其和宿主的关系仍有待更深一步的研究[48]。1.1.3.3BVDV大开放阅读框BVDV的开放阅读可以被翻译为一个约4000个氨基酸残基的前体蛋白，然后该前体蛋白在细胞和病毒基因编码的蛋白酶加工作用下产生至少11种成熟蛋白质。编码这11种蛋白质的基因在基因3 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述组上相对位置为5'-p20(Npro)-p14(C)-gp48(Erns)-gp25(E1)-gp53(E2)-p7-p125(NS2/3)-p10(NS4A)-p30(NS4B)-p58(NS5A)-p75(NS5B)-3'[47]。其中，核衣壳蛋白p14(C)和糖蛋白gp48(Erns)、gp25(E1)、gp53(E[10]2)为病毒结构蛋白。ORF后剩余3'端约2600个密码子编码非结构蛋白（如图1-2所示）。多聚蛋白加工成熟过程始于Npro的自动裂解释放，该过程不需要任何病毒或细胞因子参与。衣壳蛋白C端由信号肽酶加工修饰，而ErnsN末端则由位于内质网的信号肽酶加工[49]。后者剪切作用导致膜糖蛋白迁移到内质网腔，随后这些蛋白在信号肽酶的处理下正确插入到内质网膜上[50-52]。p7是唯一一个被信号肽酶加工修饰的非结构蛋白[53]，其它非结构蛋白是由NS3-NS4a丝氨酸蛋白酶加工处理。多聚蛋白不同位点不同剪切速率和效率导致了中间体的出现[54]。1.1.4牛病毒性腹泻病毒基因组编码蛋白的结构及功能1.1.4.1非结构蛋白Npro是BVDV开放阅读框编码的第一个蛋白质，具有自我剪切功能，可以自动从多聚蛋白中裂解出来。Npro是瘟病毒所特有的，由164个氨基酸组成，其分子量大小为20-23kDa。瘟病毒Npro在引导干扰素诱导物IRF-3降解、阻断感染细胞产干扰素[55,56]过程中发挥了重要作用，但由于病毒本身可以阻止压力颗粒形成复合物，所以Npro在病毒生命周期中的作用有待进一步阐述。此外，研究报道Npro蛋白酶存在于核糖体蛋白颗粒（RNPs）中，表明Npro在病毒颗粒形成过程中可能起到了转运作用[57]。p7是紧靠结构蛋白的非常小的非结构蛋白，全长70个氨基酸，由细胞信号肽酶介导从E2蛋白上低效裂解下来[58]。它以游离p7形式或复合物E2-p7形式存在于感染细胞中。p7与游离病毒没有密切联系[59]，但对感染性病毒颗粒释放过程是必需的[59,60]。p7有两个疏水结构域，位于蛋白的两个末端，介导感染细胞离子通道的形成，这与丙型肝炎p7功能相似[61]。由此推测，p7可能有利于病毒在细胞间的转移。NS2/3蛋白紧随p7之后，在不同生物型BVDV中有两种存在形式。在NCP型中以NS2/3未剪切形式存在，而在CP型中以NS2和NS3两种独立蛋白形式存在。最近一项研究指出，NS2/3蛋白剪切对于感染初期NCP型病毒复制过程是必需的，随着感染过程中NS2/3剪切幅度下降，NS2/3蛋白在感染细胞中积累下来。NS2/3的裂解是NS2蛋白介导的，NS2的蛋白酶活性也是最近被发现的。NS2有两个内部信号肽，指导蛋白向内质网迁移[62]。NS3蛋白具有两种酶活性，其N末端包含一个丝氨酸蛋白酶结构域，主要负责病毒多聚蛋白的裂解，是病毒生存所必需的。C末端包含一个RNA解旋酶结构域，参与RNA复制过程[63]。NS3任何一种酶活性丧失都会令病毒复制终止。NS4A为约64个氨基酸残基的小蛋白，是病毒复制酶的组成部分，有辅助NS2/3蛋白酶活性作用，其它功能需要进一步研究。NS4B是病毒复制酶的组成部分，但在BVDV感染细胞中检测不到。NS5a和NS5b蛋白位于多聚蛋白的C末端。在感染细胞中，它们以游离状态或未剪切的NS5a-NS5b状态存在。NS5a与膜结合的NS4b及NS5b共同组成RNA复制复合物，但其在RNA复制过程中的作用机制尚不清楚[64]。NS5a在细胞激酶的作用下磷酸化，但磷酸化的目的还没有研究清楚。4 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述1.1.4.2结构蛋白参与病毒颗粒形成的蛋白被称为结构蛋白。衣壳蛋白或核心蛋白具有保护作用，将基因组RNA包裹在病毒颗粒内部。衣壳蛋白N末端随着Npro的自动裂解而形成。该蛋白不具有复杂的空间结构，但是可以通过带电荷的氨基酸残基与基因组RNA相互作用[65]。Erns蛋白数量庞大，属于糖蛋白类，大约有227个氨基酸组成。该蛋白以二聚体形式存在，可以诱导机体产生抗体。Erns蛋白的一个重要特性是具有RNase活性，可以降解单链或双链RNA。该性质的意义在于能够通过降解病毒感染信号-双链RNA，抑制宿主的先天性免疫应答，使病毒得以逃避机体免疫防御。此外，Erns蛋白可以通过C末端的两性螺旋结构结合到病毒颗粒的表面[66]，由于相互作用力微弱，Erns也可以从病毒颗粒上脱离。E1蛋白又称gp25，大约由195个氨基酸残基组成，含有三个糖基化位点，非糖基化蛋白分子量约为20kda。E1是多聚蛋白Ala-498-Gya692经宿主细胞的信号肽切割形成，在其氨基酸序列中包含2个高度疏水区，通过这两个疏水区可以将E1蛋白锚定在病毒囊膜上。研究证明E1不能诱导机体免疫反应，因此推测Erns1可能埋在病毒囊膜内，具有在病毒包装、成熟过程中协助E定位的功能。E2与E1一样，属于内膜糖蛋白，由约370个氨基酸残基组成。E2膜锚定点富含疏水性氨基酸残基，可以与病毒膜蛋白相互作用，也可以介导形成E[67]1-E2异二聚体形成，E1-E2异二聚体是感染性病毒颗粒所必需的。E2N末端含有依赖空间构象的结构域，位于病毒囊膜的表面，是决定抗原性的主要部位，也是与抗体结合，介导免疫中和反应以及与宿主细胞识别、吸附的主要部位。1.2牛病毒性腹泻病流行病学1.2.1牛病毒性腹泻病流行特点BVDV最早报道于美国，现在已经遍布世界各地。1980年李佑民首次报道BVDV在中国存在以来，已经有20多个省市自治区相继报道了本病的发生[68]。BVDV可以垂直传播，也可以通过带毒动物向环境排毒实现水平传播。此外，污染的笔、直肠检查手套、皮下注射针头、鼻钳子以及环境空气都可以成为BVDV传播的媒介[69]。牛是BVDV的自然宿主，但许多报道已经证明BVDV也可以感染羊驼、骆驼、鼠鹿、山羊、猪等动物，它们作为BVDV储存宿主[70,71]，对BVDV的传播起了重要作用。目前研究发现，BVDV可以实现跨物种的传播（如图1-3）[72]，这对于牛病毒腹泻病的防控无疑是个巨大挑战。5 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述AB鹿鹿牛牛麋鹿羚羊绵羊山羊麋鹿羚羊绵羊山羊骆驼骆驼美洲驼羊驼美洲驼羊驼图1-3.不同群组BVDV感染示意图（图片修改自Danielle，2016年）（A）表示BVDV在三种不同主要宿主群体内部之间的传播：野生动物、家畜和骆驼；（B）表示BVDV在三种不同主要宿主群体之间传播及潜在可能的传播；1.2.2牛病毒性腹泻病临床表现BVDV感染后，许多牛表现为一过性感染，没有明显临床症状，很快可以自愈。但也有牛出现发热和腹泻症状，临床上将其分为两种类型：（1）急性粘膜型：常见于幼犊和青年牛，发病率高，死亡率高，多于感染后15-30d内死亡。发病牛鼻镜、鼻孔有出血点、溃疡、糜烂，口腔粘膜坏死，重者口腔呈被煮样，大量流涎，喉头出有多出溃疡结节，食道黏膜、胃粘膜、十二指肠黏膜等有出血条纹，空肠和回肠有点状或斑状出血，黏膜呈片状脱落（如图1-4.）。病牛白细胞、血小板急剧下降，淋巴组织破坏。粪便内含有大量粘液和气泡，呈黄色水样，恶臭。有些病牛可以恢复健康，受损粘膜痊愈需10-14d左右。（2）持续性感染型：妊娠母畜在怀孕早期（45-125天）通过子宫感染NCP型BVDV病毒，此时胎儿的免疫系统尚未发育成熟，入侵的病毒不能被机体识别而存活下来，进而引起新生牛犊BVDV免疫耐受和无血清转阳的持续病毒血症。这种免疫耐受的牛被称为持续感染牛（PI牛），可以通过唾液、鼻分泌物、泪液、乳汁及精液向环境排毒，当它们被引入新群时，成为BVDV重要传染源。若妊娠母畜在怀孕前三个月感染BVDV，很可能出现流产、产畸形胎、木乃伊胎等情况。若妊娠母畜在怀孕180d后感染BVDV，由于胎儿的免疫系统发育成熟，会产生强烈的免疫反应，最后可能会流产、产下健康牛犊或血清转阳牛犊。1.2.3牛病毒性腹泻病检测方法近些年，随着大规模群体检测和分子生物学诊断技术的不断发展，BVDV检测技术也取得了明显进步。BVDV的诊断方法主要有：琼脂糖凝胶免疫扩散试验、血清学中和试验和免疫荧光技术、免疫过氧化物酶技术、酶联免疫吸附试验、病毒分离与鉴定、RT-PCR技术、核酸探针技术等。每种方法各有优势，根据情况可选择一种方法或多种方法联合使用。其中ELISA方法和RT-PCR技术具有特异、敏感、快速等特点，可以用来检测大批量样品，在诊断和控制BVDV方面发挥了较重要的6 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述作用。1.3牛病毒性腹泻病防控策略1.3.1BVDV控制动力与机遇BVDV控制与与根除策略的制定必须十分周祥，成本效益是首要考虑因素。启动控制程序后的一段时间范围内，投入资金一定要低于疾病所造成的经济损失，这样才能使根除计划有效进行下去。在那些需要考虑投入回报的地方，关键是要确定BVDV控制策略实施的驱动力。但在一些对动物抗生素药物的使用有严格限制的地方，成本效益限制因素就不再那么严格[73]。目前，国内BVDV流行情况复杂，对于BVDV的控制与根除，我们既要借鉴国外成功经验，又要立足实际寻找切实可行的方案。牛病毒性腹泻病对中国养牛业的危害逐渐显现，由于没有很好的免疫防护措施，本病呈现上升趋势，对牛群的育肥、产奶和繁殖影响极大。全国20多个省市、自治区检出此病，个别地区抗体阳性率达100%。在这一背景下，BVDV控制策略的提出迫在眉睫。另一方面，国外已经具有成熟的BVDV商品化疫苗，无论是灭活疫苗还是弱毒疫苗都取得了良好的防控效果。我国商品化的疫苗种类较少，临床应用尚未全面推广。利用畜群中分离到的流行毒株作为候选疫苗株，制备出针对中国BVDV流行特点的疫苗是实施控制策略的重要机遇。对于BVDV灭活疫苗和弱毒疫苗的特点（如表1-1），人们可以根据不同需求进行选择。表1-1BVDV灭活苗疫苗与弱毒疫苗比较疫苗类型属性灭活苗弱毒苗识别病毒蛋白种类结构蛋白结构蛋白和非结构蛋白交叉保护效果有限交叉保护对多种血清型产生交叉保护抗体；CD4+T细胞；CD8+CTL免疫反应抗体；CD4+T细胞细胞接种次数多次单次保护期数周到几个月一年以上安全性可用于妊娠母畜接种不适于妊娠期接种1.3.2国外BVDV控制项目在许多牛肉生产大国，BVDV控制与根除策略已经开始实施。在荷兰，计划实施的第二年就得到了明显的收益[74]。在瑞士，BVDV根除计划取得了巨大成功。来自它们的数据显示，控制与根除计划实施四年后，2012年中期成本效益达到平衡[75]。在挪威，计划实施的十年间，每年五千二百四十万克朗的运行成本可以避免五千万到二十亿克朗的损失[76]。瑞士与挪威控制策略的成功，可以给予我们许多启示。那些成功的控制策略都是基于一个设计前提：PI动物。通常，PI动物临床表现健7 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述康，但它作为病毒储存器，会持续向环境中排毒，造成BVDV在牛群中的流行。因此，PI动物的鉴别与淘汰工作对于移除传染源十分重要。不同疾病的净化都包括以下几个阶段：初期—调查可能被感染的种群，中期—PI动物的识别与淘汰，后期—生物安全性监测，防止种群再度感染[77]。这些净化项目通常持续十年左右，然后进入监测阶段。这里需要强调一点，整个净化项目的初期和中期是成本效益最显著的阶段，人往往会忽视后期对疾病的监测，这样最终会导致努力功亏一篑，所以做好生物安全性检测才能获得长效收益。瑞典选择血清抗体抽样检测方法监测肉牛种群，散装牛乳抗体检测方法监测奶牛种群。瑞士则是在全国范围内排查动物PI状态，剔除所有阳性个体。1.3.3国内BVDV控制面临挑战在中国，BVDV对养殖业造成的损失没有具体的统计数据，所以许多学者认为做好疾病的宣传工作会大力推动BVDV控制策略的实施。但是，许多潜在的挑战也必须要考虑，比如是自愿参与还是强制性要求、生物安全相关的配套基础设施、诊断方法的可靠性和实用性、野生或圈养动物作为病毒储存宿主的风险、利益相关人的执行力、动物的流动以及项目实施所需的经费。下面就各种因素分别进行讨论，以期获得满意的解决方案。1.3.3.1自愿或强制控制养殖人员的配合对于BVDV的控制至关重要，随着BVDV控制策略的进行和牛群BVDV免疫力的下降，其余感染种群潜在的有害影响可能会令净化的种群再次感染。为此，一些国家（如瑞士和瑞典）实施强制性诊断检验或限制BVDV背景不清楚的牛群流动。在瑞士，动物流动限制是BVDV控制策略的重要组成部分。考虑到中国养殖规模以及养殖人员的整体素质，自愿性措施可能达不到预期效果。实行动物流动管制，避免动物随意跨境、省或市流动，可以有效切断传播途径。1.3.3.2相关基础设施建设在着手制定BVDV控制策略之前，需要对必要的基础设施进行评估。农业部已经着手建立动物健康网络体系，国家动物疫病控制中心也成立了许多疾病监测数据的管理体系。活畜交易流动由当地主管部门负责，能够直接掌握动物健康状况的第一手资料。因此，这些资源会促进BVDV控制策略的顺利进行。1.3.3.3检测目前，检测BVDV病毒抗原或特异性抗体的方法主要是琼脂糖凝胶免疫扩散试验、ELISA和RT-PCR。检测样品种类包括血清、乳汁和组织。皮肤和毛发类样品由于便于储存和运输，检测中使用较频繁。一批次的牛乳样品检测一次就可以确定整个牛群的感染状况，所以奶牛场通常选用乳汁作为检测样品。欧洲制定的BVDV控制策略就选用了多种方法[78]。对大规模牛群进行检测时，需要考虑恰当的检查方法。既要方便快捷，又能节约费用。在中国目前BVDV血清阳性率较高的情况下，尤为如此。在奶牛场，可以对每批鲜奶进行RT-PCR检测，其它商品牛可以采用血清学方法。对检测出来的PI牛及时进行淘汰，对感染牛也要根据实际情况隔离治疗或淘汰8 中国兽医药品监察所硕士学位论第一章文献综述1.3.3.4防止再次引入病毒一旦BVDV控制项目进入后期阶段，防止BVDV病毒再次引入成为首要工作。疫苗接种是个不错的选择，同时要加强对BVDV储存宿主的监测，防止动物因随意流动而散播病毒。9 中国兽医药品监察所硕士学位论文第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查摘要：为了调查牛病毒性腹泻病毒（BVDV）在中国西部散养肉牛中的流行状况，分别从云南、新疆、甘肃和内蒙古四省区采集了1332份健康散养肉牛的血清样本，利用BVDV抗体检测试剂盒进行检测。结果显示，四省区散养肉牛BVDV抗体阳性率为33.93%，低于国内平均水平。其中，内蒙古血清抗体阳性率71.43%、新疆57.69%、甘肃16.54%、云南10.0%。然后，将阻断率S/P≤0.6的抗体阳性血清以及抗体阴性的血清样本进行BVDV抗原检测，共检出21份抗原阳性血清，17份可疑血清，阳性率为1.58%。2.1引言牛病毒性腹泻病（BVD）是危害养牛业的重大经济性疾病之一，在世界各国普遍流行[79]。感染牛通常表现为发热、不同程度的腹泻、免疫抑制或白细胞减少并时常伴有继发感染，母畜妊娠期间感染甚至会流产或产下病毒血症牛（持续性感染牛，PI牛），因此会对牛的生产性能和繁殖性能造成严重影响。近几年，随着我国社会经济的快速发展，居民生活质量的不断提高,我国肉牛产业进入了快速发展的阶段。肉牛养殖规模化程度在不断提升，但散养户及小规模养牛户仍是目前国内肉牛养殖业的主体。据报道[80,81]，中国西北地区的甘肃、新疆，北部的内蒙古以及南部的云南肉牛的存栏量位居全国前列，其经济收益也在当地居民总收入中占重要比例。随着重大动物疫病的逐步控制，这些慢性消耗性疫病对养殖业的影响逐渐显现，为了有效预防控制BVDV，需要对其流行状况进行调研。由于散养肉牛分布不集中、流动快、混群饲养等原因，有关我国散养肉牛中BVD流行状况和流行毒株的报道寥寥无几。2014-2015年，对云南、新疆、甘肃和内蒙四省区健康散养肉牛流行性腹泻病进行监测，共采集血清样本1332份。本研究以不同地区散养肉牛为调查对象，拟通过血清学检测方法对新疆、甘肃、内蒙古和云南四个地区散养肉牛中BVD的流行情况进行摸底，大致掌握这些地区散养肉牛BVDV感染状况，为评估全国散养肉牛BVDV感染水平以及制定合理的预防程序提供理论依据。2.2材料2.2.1主要试剂、耗材牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒：IDEXX公司产品，货号：99-44000；牛病毒性腹泻抗原检测试剂盒：IDEXX公司产品，货号：99-4383；一次性移液管（10ml）：Corning公司产品；离心管（1.5ml、2ml）：AXYGEN公司产品；吸头（2ul、200ul、1ml）：AXYGEN公司产品；10 中国兽医药品监察所硕士学位论文第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查2.2.2主要仪器XO-250B智能型生化培养箱：南京先欧仪器制造有限公司；DEM-III型自动酶标洗板机：北京拓普分析仪器有限责任公司；光吸收酶标仪SpectraMax190：MolecularDevices公司；Millipore超纯水过滤系统：密理博中国有限公司；高速低温离心机：Sigma公司；高压灭菌器：HIRAYAMA公司；单道可调微量移液器：Gilson公司；12道可调微量移液器：Thermo公司；4℃、-20℃、-40℃冰箱：Hair公司；2.3方法2.3.1样品收集与保存2014-2015年从中国云南、新疆、甘肃和内蒙四省区采集多批健康散养肉牛血液（均未免疫BVDV疫苗）。其中云南样品主要来自保山瓦马、保山旧城和大理云龙，新疆样品采集于伊犁霍清、奇台和博州精河，甘肃样品来自河西走廊地区，内蒙古样品来自锡盟草原。血液样本置于37℃温箱1h，之后在4℃冰箱过夜。第二天取出，4000r/min离心15min，取上清于灭菌的1.5ml离心管中，-20℃保存备用。总共收集1332份血清样本。表2-1.四个省区采集的健康散养肉牛血液样品省市采样时间样本数（份）2014/12/08362云南2015/08/041782015/01/25188内蒙古2015/05/041622015/02/15120甘肃2015/03/20140新疆2014/08/301822.3.2BVDV抗体检测1.将IDEXX抗体检测试剂盒中所有试剂置于18-26℃，然后将10倍浓缩洗液上下颠倒混匀，确保析出的盐类全部溶解。将浓缩洗液用去离子水作1:10稀释，配置1L洗液备用。2.由于样品量较大，分5批进行检测。将包被好的96孔板取出，在操作记录本上标记好样品的位置。用8道可调微量移液器向每孔中加入100μl样品稀释液。3.加入25μl血清样品，每个样品必须更换吸头。在最后四个孔中分别加入25μl阳性对照和阴性对照（各2孔）。11 中国兽医药品监察所硕士学位论文第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查4.轻弹微量反应板，将反应板中的溶液混匀。在22℃培养箱中孵育90min。5.弃去反应孔中溶液，利用自动酶标洗板机进行洗涤，每孔300μl洗液，重复洗涤3次。6.在每个反应孔中加入100μl酶标抗体。移入22℃培养箱中孵育30min。7.重复步骤5。8.用8道可调式微量移液器在每个反应孔中加入100μlTMB底物，按样品加入顺序添加。将96孔板移入22℃培养箱中避光孵育10min。9.在每个反应孔中加入100μl终止液终止反应。利用光吸收酶标仪在450nm波长测定记录样品及对照的吸光值（OD450），并计算结果。计算方法如下：（a）阴性对照平均OD450值（NCx）计算公式：NCx=NC1A(450)+NC2A(450)2（b）阳性性对照平均OD450值（PCx）计算公式：PCx=PC1A(450)+PC2A(450)2（c）被检样品计算公式：S/P=样品A(450)–NcxA(450)PCxA(450)–NcxA(450）2.3.3BVDV抗原检测研究已经证明了抗体阳性率与抗原阳性率之间是负相关的关系，血清抗体水平高的样品，抗原检测均为阴性，血清抗体阴性或可疑的样品，抗原检测阳性居多，研究中进一步证明了这一点，所以本研究选择了S/P≤0.6以及抗体阴性的血清样本进行BVDV抗原检测。1.将IDEXX抗原检测试剂盒中所有试剂置于18-26℃，同时将10倍浓缩洗液混旋，确定析出的盐类全部溶解。将浓缩洗液用去离子水作1:10稀释，配置1L洗液备用。2.对S/P≤0.6抗体阳性血清样本以及抗体阴性的血清样本进行BVDV抗原ELISA检测。将包被好的96孔板取出，并在操作记录本上标记样品的位置。用8道可调微量移液器在每孔中加入50μl检测抗体。3.加入50μl血清样品，每个样品必须更换吸头。在最后四个孔中分别加入50μl阳性对照和阴性对照（各2孔）。4.轻弹微量反应板，将反应板中的溶液混匀。在22℃培养箱中孵育2h。5.弃去反应孔中溶液，利用自动酶标洗板机进行洗涤，每孔300μl洗液，重复洗涤3次。6.在每个反应孔中加入100μl酶标抗体。在22℃培养箱中孵育30min。7.重复步骤5。8.用8道可调式微量移液器在每个反应孔中加入100μlTMB底物，按样品加入顺序添加。将96孔板移入22℃培养箱中避光孵育10min。9.在每个反应孔中加入100μl终止液终止反应。加终止液时按照第8步加入底物的顺序进行滴加。10.利用光吸收酶标仪在450nm波长测定记录样品及对照的吸光值（OD450），并计算结果。计算方法如下：（a）阴性对照平均OD450值（NCx）计算公式：12 中国兽医药品监察所硕士学位论文第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查NCx=NC1A(450)+NC2A(450)2（b）阳性性对照平均OD450值（PCx）计算公式：PCx=PC1A(450)+PC2A(450)2（c）被检样品计算公式：S–N=样品A450–NCx结果判定：1.S/P值小于0.20的被检样品，判为BVDV抗体阴性；2.S/P值大于或等于0.20但小于0.30的被检样品，判定为BVDV抗体可疑；3.S/P值大于或等于0.30的被检样品，判定为BVDV抗体阳性；2.4结果2.4.1血清抗体阳性率从四个省市、自治区采集血清样本共1332份，其中抗体阳性血清共452份，可疑样本10份，整体阳性率为33.93%。但是，不同省区血清的BVDV抗体阳性率存在较大差异。其中云南BVDV抗体阳性率仅为10%，而内蒙古BVDV抗体阳性率却高达71.43%，新疆BVDV抗体阳性率也处在较高水平。表2-2.四个省区散养肉牛BVDVAb阳性率阳性样本/总各批次阳性率各省阳性率省市采样时间样本（份）（%）（%）2014/12/0818/3624.97云南10.02015/08/0436/17820.222015/01/25132/18870.21内蒙古71.432015/05/04118/16272.842015/02/1519/12015.83甘肃16.542015/03/2024/14017.14新疆2014/08/30105/18257.6957.692.4.2血清抗原阳性率对四个省区筛选后的血清样本进行抗原检测，共检出21份抗原阳性血清，17份可疑血清，阳性率为1.58%。其中，云南血清抗原阳性率为0.19%，内蒙古血清抗原阳性率为1.60%，甘肃血清抗原阳性率为2.31%，新疆血清抗原阳性率为5.49%。13 中国兽医药品监察所硕士学位论文第二章中国西部散养肉牛BVDV流行病学调查表2-3.不同省区散养肉牛BVDVAg阳性率选取样阳性样本/总样本可疑样本阳性率各省阳性省市采样时间本（份）（份）（%）（%）率2014/12/083521/36230.28云南0.192015/08/041440/17800.00内蒙2015/01/25512/18831.061.60古2015/05/04442/16211.232015/02/151055/12044.17甘肃2.312015/03/201201/14010.71新疆2014/08/308010/18255.495.492.5讨论从整体血清BVDV抗体阳性率来看，本研究从四个省区采集血清样本整体阳性率33.93%与邓明亮等人[82]对中国奶牛、肉牛、牦牛和水牛四种不同品种牛调查的58.09%（801/1379,2015年）结果偏低。一方面是由于样本采集对象和采集时间有差异，更主要的是样本采集区域的不重叠性（其报道的河南、辽宁和江苏的阳性率均达到80%以上）。此外，王淑娟等人[83]对新疆等11个省市的奶牛场血清学调查显示BVDV抗体总阳性率达69.1%，明显高于本研究中散养肉牛的33.93%，这表明散养肉牛整体BVDV感染水平较规模化奶牛场较轻。但是，王文等人[84]通过对采自新疆10个地区大型牛场和散养户牛群血清进行BVDV抗体检测，结果显示这些地区牛群中都不同程度的存在BVDV的感染，最高阳性率达100%，最低阳性率为55%，平均阳性率为86.7%，而本调查中新疆地区散养肉牛56.79%的阳性率也在本范围中。内蒙古作为我国四大牧区之一，是奶制品重要的输出地，奶牛饲养量在全国居于首列。同时，内蒙与多个省市毗邻，动物跨省交易频繁，这些都为BVDV的传播创造了条件。2013年童钦等人[85]对6个集约化奶牛场的509份血清进行了BVDV抗体检测，平均阳性率为58.35%。2014年李智勇等人[86]对内蒙古地区17个大、中、小奶牛场的2391份血清样品进行了BVDV抗体检测，平均阳性率为88.9%（2125/2391），14个奶牛场的抗原阳性率为3.6%（8/222）。2015年姚伟[87]对辽宁地区规模化奶牛场血清型调查结果显示，BVDV抗体平均阳性率为74.0%。这些数据充分表明内蒙及周边地区奶牛BVDV感染已十分严重，这无疑对散养肉牛生存环境造成巨大挑战。内蒙、新疆两省出现的高阳性率与其散养密度高、牛羊混群放牧（研究表明羊可以作为BVDV的储存器）、动物交易频繁、流动性大以及较多的野生动物出没有关，特别是内蒙大量饲养BVDV感染率高的奶牛，也是造成黄牛BVDV增高的重要原因。而甘肃、云南两省与以往报道的情况一致，BVD相对较洁净。云南省整体阳性率较低，但两批血清样品BVDV抗体阳性率差异较大。这是由于2014年12月采集的362份样品来自保山瓦马和保山旧城，2015年8月采集的178份样品来自大理云龙，同一省份不同地区散养肉牛BVDV感染情况有所不同。14 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析第三章病毒分离与基因亚型分析摘要：将抗原检测阳性和可疑血清接种MDBK细胞，分离病毒。本研究共分离13株BVDV流行毒株，分别命名为甘肃120、内蒙1369、伊犁霍清12953、伊犁霍清12960、伊犁霍清12981、博州精河13001、博州精河13023、博州精河13033、新疆奇台13041、新疆奇台13042、新疆奇台13191、新疆奇台13220、新疆奇台13251。经RT-PCR，测定BVDV5'-UTR序列和Npro序列，分别绘制流行毒株系统进化树，确定分离毒株的基因亚型。最终结果显示，新疆地区的散养肉牛分离毒株属于BVDV-1q和BVDV-1f，内蒙古地区分离毒株属于BVDV-1m，甘肃地区分离毒株是一种新的基因亚型BVDV-1u。通过分离毒株的基因分型，有利于阐明不同毒株间的遗传演化关系，追溯病毒传播来源和预测预报病毒的流行趋势，并为BVDV疫苗的研制积累素材。3.1引言基于5'-UTR高保守序列，可以将BVDV分成两个基因型即BVDV-1亚型和BVDV-2亚型。所有的瘟病毒几乎都可以很容易扩增获得5'-UTR序列，但对于遗传进化关系十分接近的毒株通过5'-UTR序列却很难区分。在其它瘟病毒基因分型中引入了Npro基因序列和部分E2基因序列，研究也已经证明利用它们可以区分遗传关系相近的毒株。并且，基于后者任意一种序列的分型结果与5'-UTR序列分型结果基本一致，可以相互佐证的效果。目前，至少发现了17种BVDV-1(1a-1t)[88-91]亚型和四种BVDV-2(2a-2d)[92,93]亚型，而国内报道主要流行的是BVDV-1a、1b、1c、1m和1q[82]。1980年，中国首次从牛体内分离到BVDV毒株，命名为长春184，属于BVDV1b亚型。1995年，中国又分离到一株猪源BVDV毒株，命名为ZM-95,属于BVDV1m亚型。近些年，中国陆续报道了JL-1、GX-4、SD0803等毒株。本研究对散养肉牛中BVDV的流行状况进行了调查，通过病毒分离，对5'UTR序列和Npro序列扩增测序，构建系统进化树。通过对系统进化树的分析，发现不同地区散养肉牛中BVDV的流行毒株，结合以往报道综合评估散养肉牛中BVDV流行状况，为制定散养肉牛BVDV控制策略提供参考依据。3.2材料3.2.1主要试剂、耗材青霉素、链霉素等抗生素，Trizolkit、SuperscriptⅢ反转录酶、RNase抑制剂：Invitrogen公司产品；DNAMarker、PrimeSTAR@MaxDNAPolymerase、TaKaRaMiniBESTDNA片段纯化试剂盒：购自大连TaKaRa公司；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）：购自Gibco公司；15 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析BVDV间接免疫荧光试剂盒：由中国兽医药监察所提供RNeasyMini试剂盒：购自QIAGEN公司；GoldviewNucleicAcidStain：赛百盛公司产品；Agarose：Biowest公司产品；细胞培养瓶（25ml）、一次性移液管（2ml、5ml、10ml）：购自Corning公司；吸头（freeRNase）、离心管（1.5ml、）：购自AXYGEN公司；0.22μm微孔滤膜：Millipore公司产品；3.2.2主要仪器奥林巴斯CKX41显微镜：日本OLYMPUS公司；sigma1-14离心机：德国SIGMA公司；II级生物安全柜：美国Nuaire公司;PCR仪：德国Biometra公司涡旋混合器：Kylin-bell公司；CO2培养箱：Thermo公司水浴锅：德国Julabo公司；3.2.3细胞MDBK细胞：本实验室冻存。3.2.4引物设计参考GenBank中NADL毒株全基因序列，利用Ridpath等人[93]设计的引物对IVDC536F/537R，PCR扩增获得毒株的5'-UTR序列。利用Vilcek等人[94]设计的引物对BD1/BD3，PCR扩增获得毒株的Npro序列。表3-1.用于扩增BVDV5'-UTR序列和Npro序列的引物序列引物名称引物序列片段大小IVDC536F(107-123bp)CATGCCCATAGTAGGAC281bp，5'-UTRIVDC537R(373-389bp)CCATGTGCCATGTACAGBD1(367-388bp)TCTCTGCTGTACATGGCACATG429bp，NproBD3(771-795bp)CCATCTATRCACACATAAATGTGGT首先将合成引物12000rpm离心1min，然后用TEBuffer稀释为100uM的储存浓度，最后用双蒸水（ddH2O）取部分引物稀释为10uM的工作浓度，-20℃冻存备用。16 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析3.3方法3.3.1病毒分离1.将培养细胞所需物品移入生物安全柜进行紫外消毒；2.配制8%FBS细胞生长液:取16mlBVDV抗原和抗体阴性的胎牛血清加入到184mlDMEM基础培养基中，轻轻混匀；3.从液氮罐中取出冻存的MDBK细胞，直接浸入37℃温水中，轻轻摇动令其融化；4.从温水中取出冻存管，移入生物安全柜进行操作。打开盖子，用2ml移液管吸出细胞悬液，加入到25ml的细胞瓶中，然后加入5ml预先配置好的生长液，轻轻吹打，使细胞均匀分布。移入37℃2.5%CO2温箱培养；5.待培养瓶中细胞贴壁后，更换培养基，继续传代培养；6.弃去细胞生长液，用无血清DMEM培养基洗3遍。将0.5ml抗原阳性或可疑血清样本接种单层MDBK细胞，37℃吸附1h；7.每隔15min轻轻摇细胞瓶一次；8.将溶液倒入废液缸，加入5ml2%FBS的DMEM维持液（含100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素）在5%CO2培养箱中继续培养；9.连续盲传3代；10.收毒：反复冻融三次，收获病毒上清液；3.3.2间接免疫荧光法鉴定分离毒株（1）取对数生长期的MDBK细胞，稀释至约1×105个/mL，将细胞接种于48孔板培养24h后弃去培养基，用不含血清的DMEM洗三遍；（2）将病毒原液进行103倍梯度稀释，0.2mL/孔。37℃恒温培养72h；（3）吸去孔中的病毒液，加入预冷的固定液（丙酮：甲醇=1:1），0.5mL/孔，-20℃固定30min；（4）吸去孔中的固定液，晾干；（5）加入BVDV抗体，37℃孵育1h，PBS洗3遍；（6）加入FITC标记二抗，37℃孵育1h，PBS洗3遍；（7）显微镜下观察感染情况。3.3.3分离毒株RNA提取RNA提取采用Trizol法，根据RNeasyMini试剂盒操作手册，制备步骤如下：1.按每250μl样品加入750ulTrizol试剂进行漩涡混匀，室温静置5min；2.加入200μl三氯甲烷，用力振荡15s，室温静置10min；3.12000rpm，4℃离心15min；17 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析4.转移上清到一个新的离心管中，加入等体积的70%冷乙醇，翻转轻轻混匀，室温静置10min；5.取700μl溶液加入套管，做好样品标记。12000rpm，离心30s，弃去溶液；6.重复操作5；7.加入700μlRW1缓冲溶液于套管中，12000rpm，离心30s，弃去溶液；8.加入500μlRPE缓冲溶液于套管中，12000rpm，离心30s，弃去溶液；9.12000rpm，空离2min；10.将RNeasy柱移至DEPC处理的1.5ml离心管中，加入30μl无核酶水，12000rpm，离心2min，-70℃保存；3.3.4RT-PCRRT反应体系：RNA模板10μl随机引物2.5μl5×SuperscriptⅢbuffer4μL0.1MDTT1μL10mMdNTP1μLRNaseinhibitor0.5μLSuperscriptⅢ1μL总体积20μl反应条件：42℃30min制备的病毒cDNA20μL-20℃保存备用。PCR反应体系：PrimeSTAR@MaxDNAPolymerase25μL10μMPrimer-R2.5μL10μMPrimer-L2.5μLcDNA模板2μLddH2O18μL总体积50μl反应条件：变性98℃30s退火55℃30s30个循环延伸72℃1min延伸72℃10min18 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析3.3.5PCR产物电泳与纯化将扩增产物50μL与10μL6×LoadingBuffer均匀混合后加入0.8%琼脂糖凝胶孔中，120V电压下电泳30min左右，用凝胶成像系统进行成像分析，切取目的片段的凝胶块，按DNA凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收纯化。操作步骤如下：（1）使用前向WashBuffer加入无水乙醇100mL混匀；（2）将从琼脂糖凝胶中切下的单一目的DNA条带放入干净的1.5ml离心管中，称取重量；（3）向胶块中加入3倍量的BufferGM，均匀混合后室温15-25℃溶解胶块；（4）将上一步溶液加入SpinColumn中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm,室温离心1min；（5）弃去收集液，向吸附柱内加入700μLBufferWB（已加无水乙醇），12000rpm，室温离心1min，弃滤液；（6）重复步骤（5）；（7）12000rpm，空离2min，弃滤液；（8）将SpinColumn放入一个新的1.5ml离心管内，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μL的ddH2O（预先加热至60℃），室温静置2min，12000rpm，室温离心1min。（9）收集液即为回收纯化的DNA；3.3.6测序将纯化的PCR产物采用正反双向测序，获得扩增片段序列。3.3.7构建系统进化树利用ClustalX生物信息软件对序列进行分析，然后通过Mega5.0构建系统进化树，分析分离病毒的遗传演化关系。表3-2.用于构建进化树的参考毒株信息毒株分离地/年份序列号来源SD-1美国/1992M96751牛NADL美国/1999AJ133739牛Osloss比利时/1993M96687牛CP7德国/1999AF220247牛Bega澳大利亚/1998AF049221牛F-Au澳大利亚/1998AF298065牛19 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析OK1日本/2007AB359927牛J-Au澳大利亚/1998AF298067牛W-Au澳大利亚/1998AF298073牛KM斯洛伐克/2001AF298068牛G-Au澳大利亚/1998AF298066牛L-Au澳大利亚/1998AF298059牛Deer日本/2000AB040132鹿KS-Au日本/2002AB078950牛Rebe瑞士/2000AF299317牛LZ05中国/2008GU120241牛ZM95中国/2006AF526381猪Shitara日本/2008AB359930牛So-Au日本/2008AB359929牛IS25日本/2001AB359931牛BJ0703中国/2007GU120249牛TJ06中国/2006GU120246牛11N36中国/2012JX437156牛UM-Au意大利/2014LM994673牛890美国/1994U18059牛1373美国/1995AF145967牛SD0803中国/2011JN400273猪L-1753斯洛文尼亚/2003AY323875牛M31182中国/2012JQ799141牛SH9德国/1991AF144473狍VEDEVAC匈牙利/2003AJ585412牛TR29土耳其/2007EU163977牛TR27土耳其/2007EU163975牛26-V639法国/1998AF287281牛IS26NCP01日本/2007AB359932牛TJ0801中国/2008GU120262牛HB-1中国/2013KC695812牛Camelisolate6加拿大/2012KC207702骆驼W澳大利亚/1998AF287290牛J澳大利亚/1998AF287286牛20 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析3.4结果3.4.1分离得到毒株通过间接免疫荧光实验鉴定（如图3-1），共分离到13株BVDV毒株（如表3-3）。129531296012981130011302313033130411304213191132201325112021 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析1369C24VC图3-1.间接免疫荧光法鉴定分离的BVDV病毒表3-3.分离病毒的来源编12013691295312960129811300113023130331304113042131911322013251号来甘内伊犁伊犁伊犁博州博州博州新疆新疆新疆新疆新疆源肃蒙霍清霍清霍清精河精河精河奇台奇台奇台奇台奇台3.4.2RT-PCR扩增片段运用RT-PCR方法成功扩增了BVDV5'UTR序列片段和Npro序列序列片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示在281bp（图3-2.）和429bp（图3-3.）处分别出现了与预期目的基因大小的片段。图3-2.BVDV5'-UTR序列扩增片段图3-2.M为DL2000Marker，1-13泳道分别为样品12953、12960、12981、13001、13023、13033、13041、13042、13191、13220、13251、120、1369扩增BVDV5'-UTR序列片段（281bp）；22 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析图3-3.BVDVNpro序列扩增片段图3-3.M为DL2000Marker，1-13泳道分别为样品12953、12960、12981、13001、13023、13033、13041、13042、13191、13220、13251、120、1369扩增BVDVNpro序列片段（429bp）。其中第7泳道13041样品和第9泳道13191样品扩增条带相对其它样品亮度较弱。3.4.3测序结果所有样品的5'UTR序列测序均成功。而BVDVNpro序列测序中除13041样品未获得扩增条带，13191测序出现双峰测序失败外，其余样品测序也都成功。3.4.4构建系统发育树BVDV5'UTR包含保守序列和高变序列，可以作为BVDV基因分型的依据。从基于5'-UTR序列构建的系统进化树可以看出，所有分离毒株均为BVDV-1型。其中，新疆地区散养肉牛中分离毒株属于BVDV-1q(8/11，77.78%)和BVDV-1f(3/11，22.22%)。内蒙地区分离的毒株属于BVDV-1m。甘肃地区分离的毒株是一种新的亚型BVDV-1u，该亚型目前还没得到权威认可，但我国已与2012年、2013年在中国多个省市多个物种中分离到此毒株。所有这些分离毒株的同源性达81%-99%。另外，临床分离的1q、1f、1m和1u与其参考序列的同源性分别为94%-97%、93-94%、94%-99%和95%-96%。基于Npro序列的分型可以对5'-UTR序列分型结果加以佐证。在本实验中，基于不同序列构建的两种进化树结果一致（图3-4，图3-5）。23 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析图3-4.基于5'UTR序列（281bp）利用邻位法构建的遗传进化树24 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析图3-5.基于BVDVNpro序列（429bp）利用邻位法构建的遗传进化树3.5讨论BVDV作为单股RNA病毒，具有很高的突变率。因此，不同国家甚至同一国家的不同区域BVDV基因型分布有很大差异。在美国主要流行的是BVDV-1a、BVDV-1b和BVDV-2a[14]，欧洲许多国家主要流行1a、1b、1d、1e和1f[95,96]，日本和韩国主要流行BVDV-1b[97,98]，澳大利亚则主要流行BVDV-1c[99]。我国地域辽阔，疾病流行情况十分复杂，BVDV-1和BVDV-2的许多亚型已在不同物25 中国兽医药品监察所硕士学位论文第三章病毒分离与基因群分析种中被发现，并呈现多样性分布。本研究在新疆地区分离到的病毒主要为BVDV-1q和BVDV-1f亚型，此前高善典等人[100]在该地区双峰驼中分离到BVDV-1q，这说明BVDV-1q已经在新疆地区跨物种传播。而BVDV-1f首次在该地区检测到，钟发刚等人[101]早前在新疆七个地区商品化肉牛和奶牛中分离到的主要是BVDV-1b和BVDV-1c亚型毒株，通过BLAST比对发现这些序列与斯洛文尼亚分离到的BVDV-1f毒株有很高的同源性，所以不排除BVDV通过贸易或其它途径实现了跨境传播，亦可能是原有毒株发生了突变。甘肃地区分离到的是一种新基因亚型BVDV-1u，该型毒株最早于2012年分离于四川成都（NCBI:JQ799141），后邓明亮等人在广西、湖北、青海等地分离到该亚型毒株。甘肃与四川、青海毗邻，散养肉牛流动性大且牲畜交易频繁，所以不难解释甘肃肉牛中可以分离到BVDV-1u毒株。内蒙古地区分离的毒株属于BVDV-1m亚型，该亚型在中国很多省市已经分离到，是目前国内BVDV最流行的亚型之一。邓明亮等人、张书清等人分别从内蒙古地区的肉牛血清和胎牛血清中分离到过BVDV-1m，同时在内蒙古相邻的黑龙江、吉林、辽宁和宁夏等地[102,103]也都分离到了BVDV-1m毒株，所以可以确定BVDV-1m是内蒙古地区的主要流行毒株且该毒株较稳定，变异程度低。26 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序摘要：参考NADL毒株全基因组序列，设计特异性引物，对BVDV内蒙古1369毒株进行全基因组测序（命名NM1369）。测序结果表明，NM1369基因组为12268bp，编码3902个氨基酸。对全基因组进行分析，根据其5'UTR列和Npro序列，确定内蒙1369属于BVDV-1m基因亚型。与BVDV其它参考毒株对比发现，NM1369与中国分离毒株ZM-95以及SD-15同源性最高，核苷酸同源性为94.8%。通过细胞驯化培养，NM1369可以很好适应MDBK细胞，且属于细胞病变型。间接免疫荧光试验测定病毒效价为105.24TCID50/0.1ml。本试验通过分析流行毒株间的差异为制定BVDV防控措施提供了参考，同时全基因组测序为进一步研究我国BVDV的分子生物学特性、致病机制及开发新型疫苗奠定了基础。4.1引言牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是养牛业常见的一种病毒，目前已在20多个省、市、自治区报道分离到或检测到该病毒抗体。BVDV感染宿主较广，包括不同品种的牛、羊、猪、鹿和野生动物，其中中国在对上述物种BVDV感染情况均有报道。作为一种慢性消耗性疾病，人们对牛病毒性腹泻病（BVD）的重视程度显然不够，仅仅停留在对该病的研究阶段，我国尚无商品化的BVDV疫苗。许多农场采用猪瘟兔化弱毒疫苗预防BVD，但因为应激反应，妊娠母牛不宜接种，这也为牛群中出现持续性感染（PI）牛埋下了了隐患。根据对培养细胞是否产生病变作用，BVDV可分为两个生物型即非致细胞病变型（NCP型）和致细胞病变型（CP型）。研究发现，CP型的产生与NS2/3蛋白编码序列的改变有直接关系，如基因组序列重复、细胞mRNA序列插入或点突变都可以导致NS2/3蛋白剪切为NS2和NS3蛋白，NS2/3蛋白的裂解使病毒由NCP型转变为CP型。通常，BVDVCP型毒株分离于持续感染的动物。但值得一提的是，目前还没有研究发现BVDV的生物型与病毒毒力之间存在联系。本研究对内蒙分离病毒（命名为NM1369）进行细胞驯化培养，通过在牛肾细胞（MDBK细胞）上的连续传代，观察到该病毒可以导致细胞病变，属于BVDVCP型。同时对病毒全基因组进行测序，测序结果与中外毒株进行比对，阐述该病毒的演化关系。4.2材料4.2.1主要试剂、耗材PgemT-easy载体，T4连接酶：Promega公司产品；质粒提取/纯化试剂盒：OMEGA公司产品，批号：D061101;PfuUltraHigh-FidelityDNAPloymerase：Strategene公司产品；加A试剂盒：购自北京康为世纪生物科技有限公司；27 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序BVDV间接免疫荧光试剂盒：由中国兽医药监察所提供；Top10感受态细胞：购自天根生化科技有限公司；Amp、ProteaseK：购于北京华美生物工程公司；dNTPmixture、dATP：购自Roche公司；Tryptone、YeastExtract：Oxiod公司产品；氯化钠：购自国药集团化学试剂有限公司；多种限制内切酶：购自NEB公司；BactoTMAgar：：购自BD公司；其余试剂、耗材与上一章相同。4.2.2仪器ND-1000微量紫外分光光度计：NanoDrop公司产品；超净工作台：购自苏州净化超净工作台公司；冰盒：购自鼎国生物有限公司；分析天平：sartorius公司产品；制冰机：Labway公司产品；其余仪器与上一章相同。4.2.3溶液的配制4.2.3.175%RNAase-free乙醇溶液无水乙醇和0.1%DEPC水按75:25（V/V）比例混匀，4℃保存备用。4.2.3.20.1%DEPC水将DEPC与双蒸水按1:1000（V/V）比例混合，37℃静置12h，121℃高压灭菌15min，室温保存备用4.2.3.350×TAE溶液（1）称取下列试剂于烧杯中，加入800mL去离子水，充分溶解；Tris碱242gNa2EDTA·2H2O37.2g（2）加入57.1mL冰乙酸，充分搅拌混匀；（3）补加去离子水定容至1L，室温保存备用；工作液浓度为1×TAE。4.2.3.41%琼脂糖凝胶（W/V）：称取1g琼脂糖，加入100mL1×TAE加热溶解，待冷却至50-60℃时加入5μLGoldviewNucleicAcidStain混匀，倒入凝胶槽中制备琼脂糖凝胶。4.2.3.5100ng/μLAmp贮存液称取2gAmp溶于20mL去离子水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，0.5ml/支分装，-20℃保存。28 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序4.2.3.62×YT液体培养基（1）称取下列试剂置于烧杯中，加入400mL去离子水，充分搅拌溶解；胰蛋白胨8g酵母浸出物5gNaCl2.5g（2）滴加2NNaOH调节pH至7.0；（3）补加去离子水至0.5L；（4）121℃高压灭菌30min；室温保存备用。4.2.3.7含Amp的2×YT液体培养基根据需要取适当体积的灭菌2×YT液体培养基，每毫升培养基加入1微升100ng/μLAmp，最终浓度为100ng/mL。4.2.3.8含Amp的2×YT平板同2×YT液体培养基的配方称取各组分溶于400mL去离子水中，加入7.5g琼脂搅拌溶解，补加去离子水至0.5L，121℃高压灭菌30min，待温度降至40-50℃时，每毫升培养基加入1微升100ng/μLAmp，混合均匀倾倒在平皿上，冷却至室温移至4℃保存备用。4.2.3.9SOB液体培养基（1）配制2MMgCl2溶液。在4mL去离子水中加入9.5gMgCl2溶解混匀，补加去离子水至50mL，用0.22μm滤膜过滤除菌；（2）配制250mMKCl溶液。在40mL去离子水中加入0.98gKCl溶解混匀，补加去离子至50mL；（3）称取下列试剂于1L烧杯中，加入400mL去离子水充分搅拌溶解；胰蛋白胨10g酵母浸出物2.5gNaCl0.25g（4）量取5mL250mMKCl溶液加入到烧杯中搅拌混匀；（5）滴加2NNaOH溶液调节pH至7.0；（6）补加去离子水至0.5L，121℃高压灭菌30min，4℃保存备用；（7）使用前加入2.5mL2M的无菌MgCl2溶液混匀即可。4.2.3.10SOC液体培养基（1）配制1M葡萄糖溶液。在90mL去离子水中加入18g葡萄糖，充分溶解，定容至100mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；（2）向200mLSOB液体培养基中加入4mL无菌的1M葡萄糖溶液，搅拌混匀，即为SOC液体培养基，以无菌安瓶分装，4℃保存备用。4.2.3.1120mg/mLX-Gal贮存液称取100mgX-Gal加入5mL二甲基甲酰胺中搅拌溶解，分装后-20℃闭光保存。4.2.3.1220mg/mL蛋白酶K29 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序称取1g蛋白酶K加入50mL0.1%DEPC水中，充分溶解混匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。4.2.3.133MNaAC（pH5.2）称取CH3COONa·3H2O40.824溶于60mL0.1%DEPC水中，用冰醋酸调整pH值为5.2，定容至100mL，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。4.2.3.141MTris-Cl（pH8.0）在80mL0.1%DEPC水中加入12.1gTris碱，用浓盐酸（约加4.2mL）调节pH值至8.0，补加0.1%DEPC水至100mL，在121℃高压下灭菌30min，常温保存备用。4.2.3.151MNaCl在80mL0.1%DEPC水加入5.84gNaCl，充分溶解混匀，补加0.1%DEPC水至100mL，常温保存备用。4.2.3.16STE（1）在80mL0.1%DEPC水中加入下列试剂充分搅拌溶解；1MTris-Cl（pH8.0）1mL1MNaCl10mL0.5MEDTA（pH8.0）0.2mL（2）补加0.1%DEPC水至100mL，在121℃高压下灭菌15min；4℃保存备用。4.2.3.17TE（pH8.0）（1）在80mL0.1%DEPC水中加入下列试剂充分搅拌溶解；1MTris-Cl（pH8.0）10mL0.5MEDTA（pH8.0）2mL（2）补加0.1%DEPC水至100mL，在121℃高压下灭菌20min；室温保存备用。4.2.3.18STET：（1）在70mL去离子水中加入下列试剂充分搅拌溶解；蔗糖8g曲松X-1005mL1MTris-Cl（pH8.0）5mL0.5MEDTA（pH8.0）10mL（2）补加去离子水至100mL，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌；4℃保存备用。4.2.3.190.01mol/L的PBS（pH7.4）（1）量取400mL去离子水加入1L烧杯中，将以下组分充分混合溶解；0.2MNa2HPO436mL0.2MNaH2PO414mLNaCl8.5g（2）补加去离子水至0.5L，常温保存。4.2.3.20细胞固定液分别取200ml丙酮和甲醇按1:1的比例混匀，-20℃避光保存备用。30 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序4.2.4引物设计参考GenBank中NADL毒株全基因序列（登录号：M31182），用Primer5.0软件在各个保守区内设计7对特异性引物（表4-1）。引物交由生工生物股份有限公司合成（表4-1）。根据参考序列选择不同区段单一限制性酶切位点，以便转化克隆的筛选以及后续研究（如图4-1）533/526547/548541/532531/528527/530529/524525/5406666666图4-1.BVDV全基因组测序不同区段不同引物及单一酶切位点模式图表4-1用于扩增BVDV全基因组的引物序列引物名称引物序列片段名称及大小IVDC533GGACAAGCCTCGAGATGCCACG1#，1700bpIVDC526CGTAACCAAGCTTCCGTTCTACCIVDC547AGAACGGAAGCTTGGTTACG2上，1266bpIVDC548CTGTAGCCACTCTCATTCTCIVDC541GATATGTAGGTGGGCCCGTCGAATCCTG2下，867bpIVDC532CTATTGTGACTAGTGGCACCACIVDC531GTGGTGCCACTAGTCACAATAG3#，1990bpIVDC528CAGCCTTTGGGAGCTCCGTGGTCIVDC527GACCACGGAGCTCCCAAAGGCTG4#，1883bpIVDC530CAACCAGGTCGACGGCTGCCTGIVDC529CAGGCAGCCGTCGACCTGGTTG5#，2510bpIVDC524AGGATCCACTTGTTATGTTCTCIVDC525GAGAACATAACAAGTGGATCCTIVDC540CATGGCCGGCGGGGCTGTTAGAGGTCTTCC6#，2078bpCTAGTCCAACCATGGACGTC4.2.5细胞和标准毒株MDBK细胞：本实验室冻存；BVDVC24V标准毒株：由中国兽医药品监察所提供；31 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序4.3方法4.3.1PCR扩增PCR扩增：用特异的上、下游引物（F、R）和RT产物NM1369cDNA进行PCR扩增，总体积50μL。10×Pfubuffer5μL10mMdNTP1μL10μMPrimer-R2.5μL10μMPrimer-L2.5μLpfuDNAPloymerase1μLcDNA2μLH2O36μL总体积50μl将溶液震荡混匀，移入PCR仪中。反应条件：预变性94℃3min；变性94℃30s退火55℃30s30个循环延伸72℃2min延伸72℃10min4.3.2PCR产物电泳与纯化在50μLPCR扩增产物中加入10μL6×LoadingBuffer，均匀混合后上样于0.8%琼脂糖凝胶孔中。130V电压下电泳30min后，通过凝胶成像系统分析样品条带大小，将大小正确的目的片段切下，按DNA凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收纯化。操作步骤如下：（1）使用前向WashBuffer加入100mL无水乙醇，充分混匀后再使用；（2）将从琼脂糖凝胶中切下的单一目的DNA条带放入干净的1.5ml离心管中，称取重量；（3）向胶块中加入3倍量的BufferGM，均匀混合后室温15-25℃溶解胶块；（4）将1.5ml离心管中的溶液移入SpinColumn中，室温放置2min，12000rpm，离心1min；（5）弃去收集液，向吸附柱内加入700μLBufferWB（已加无水乙醇），12000rpm，室温离心1min，弃滤液；（6）重复步骤（5）；（7）12000rpm空离2min，弃滤液；32 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序（8）将SpinColumn移入一个新的1.5ml离心管内，晾干后加入20μL的ddH2O（预先加热至60℃），，12000rpm，室温离心1min。（9）收集液即为回收纯化的DNA；4.3.3PCR纯化产物末端加ApfuDNAPloymerase是高保真酶，其扩增的PCR产物末端无附加的碱基A，要使PCR产物克隆到pGEMT-easy载体上，就必须在PCR产物末端加上碱基A。利用康为世纪加A试剂盒进行末端加A反应，总体积10μL。10×TaqBuffer1μLTaqDNAPloymerase1μL10mMdATP1μL纯化的DNA片段7μL总体积10μl反应条件：72℃30min4.3.4加A产物与质粒载体连接连接体系2×LigBuffer6μLpGEMT-easyVector0.5μLT4DNALigase0.5ulPCR加A产物5μL总体积12μl反应条件：4℃过夜连接4.3.5转化（1）从-70℃冰箱取出Top10感受态细胞，冰上复苏5min；（2）在紫外消毒的超净工作台中，取连接产物10μL加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴中静置30min；（3）将离心管置于42℃水浴中热激60s，然后快速将感受态细胞移到冰浴中静置5min，该操作过程中避免摇动离心管；（4）无菌加入800μL37℃预热的SOC培养基，置于37℃摇床中170rpm-190rpm条件下增菌1h。（5）4500rpm，室温离心5min，吸取800ml培养基弃去，留存100μL菌液。（6）在混悬的菌液中加入40μlx-gal(20mg/ml)和40μlIPTG(100mM)，混匀后加到含有Amp的2×YT平板上，用L型细胞涂刮器涂抹均匀。（7）将平板移入37℃温箱内培养16h，待平板长出大量蓝色和白色菌落；置4℃保存备用。33 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序4.3.6STET微量裂解法制备质粒DNA鉴定转化克隆操作程序：（1）将含有抗生素的1.0ml2×YT（或其它培养基）加入1.5ml离心管，开盖置于试管架；（2）用灭菌牙签或枪头挑单克隆，在一新的Amp2×YT培养基平板中按顺序做好备份。然后，放入上述离心管中；（3）轻轻搅动每个牙签，弃去；（4）放置于37℃摇床，过夜培养；（5）第二天取出离心管，室温离心2min；（6）将上清小心吸出弃去，避免吸到菌体沉淀；（7）加入250μl含有1mg/ml溶菌酶的STET（4.9mlSTET缓冲液加入0.1ml50mg/ml的溶菌酶）；（8）涡旋混匀；（9）煮沸1min。溶液颜色由黄色变为白色；（10）煮沸后立刻离心，室温，10min；（11）用牙签挑出粘稠的沉淀物，弃去；（12）加入250μl异丙醇，上下颠倒混匀；（13）室温离心10min；（14）小心吸出上清弃去。重复操作12，弃去上清；（15）离心管真空干燥5min，或4℃上下颠倒过夜；（16）用20μlTE缓冲溶液重悬离心管底部沉淀，68℃加热10min。涡旋离心1-2min；4.3.7酶切鉴定转化克隆利用一系列限制内切酶分别双酶切和单酶切鉴定转化克隆：单酶切体系：质粒2μL10×CutSmartBuffer1μL酶A0.5μLddH2O6.5μL总体积10μL反应条件：37℃3h；双酶切体系质粒2μL10×CutSmartBuffer1μL酶A0.5μl酶B0.5μl34 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序ddH2O6μl总体积10μL反应条件：37℃3h；4.3.8酶切产物电泳分析将双酶切和产物和单酶切产物10μL与2μL6×LoadingBuffer均匀混合后加入0.8%琼脂糖凝胶孔中，120V电压下电泳30min左右，用凝胶成像系统进行成像分析4.3.9增菌培养挑取酶切鉴定正确的质粒所对应的菌落，加入到装有5ml含有Amp2×YT培养基的试管中，每个片段挑取3个阳性克隆。然后，将试管放入37℃、200rpm摇床中，过夜增菌。4.3.10质粒提取用PlasmidMiniprepKit进行质粒小量提取，操作步骤如下：（1）使用前向DNAWashBuffer中加入无水乙醇80mL，混匀后再使用；（2）将1mlRNaseA加入到SolutionI中混匀，4℃保存备用；（3）在超净工作台内，将试管中的菌液分装到1.5mL离心管中，12000rpm室温离心1min，弃去上清；（4）向离心管中加入250μLSolutionI（含RNaseA）漩涡混匀；（5）向离心管中加入250μLSolutionⅡ轻轻混匀，静置2min；（6）向离心管中加入350μLSolutionⅢ翻转混匀，12000rpm，室温离心10min；（7）将上清转移到HiBindMiniprepColumn中，12000rpm，室温离心1min；（8）倒掉CollectionTube中的液体，加入500μLBufferHB，12000rpm室温离心1min；（9）倒掉CollectionTube中的液体，加入700μLDNAWashBuffer（已加无水乙醇），12000rmp离心1min，重复1次；（10将HiBindMiniprepColumn放入收集管中，12000rmp，室温空管离心2min，除去残留的液体；（11）将HiBindMiniprepColumn放置于一个新的1.5ml离心管中，打开HiBindMiniprepColumn盖，室温放置10-15min彻底晾干；（12）向吸附膜的中间部位悬空滴加50μLElutionbuffer（预先加热至65℃），12000rpm离心2min；-20℃保存备用。提取的质粒分别进行命名，同时取500μL菌液和等量50%甘油混合，-40℃保存菌种。4.3.11测序所有阳性克隆株分别取1.5ml菌液送生工生物股份有限公司进行测序。测序片段经分析后利用35 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序Sequencher软件进行分析拼接，获得BVDV全基因组全长序列。表4-2用于序列比较的参考毒株信息毒株分离地/年份序列号来源SD-15中国/2015KR866116.1牛ZM-95中国/2006AF526381.3猪SD0803中国/2014JN400273.1猪camel-6中国/2010KC695810.1骆驼GX4中国/2014KJ689448牛M31182中国/2010JQ799141.1牦牛IS26/01日本/2016LC089875.1牛NADL美国/2005AJ133738.1牛USMARC美国/2015KP941586.1牛VEDEVAC匈牙利/2005AJ585412.1牛Osloss比利时/2003M96687.1牛1-SD1美国/2005M96751.1牛4.3.12细胞驯化培养1.将培养细胞所需物品移入生物安全柜进行紫外消毒；2.配制8%FBS细胞生长液:取16ml胎牛血清加入到184mlDMEM基础培养基中，轻轻混匀；3.从液氮罐中取出冻存的MDBK细胞，直接浸入37℃温水中，轻轻摇动令其融化；4.从温水中取出冻存管，移入生物安全柜进行操作。打开盖子，用2ml移液管吸出细胞悬液，加入到25ml的细胞瓶中，然后加入5ml预先配置好的生长液，轻轻吹打，使细胞均匀分布。移入37℃2.5%CO2温箱培养；5.待培养瓶中细胞贴壁后，更换培养基，继续传代培养；6.弃去细胞生长液，用无血清DMEM培养基洗3遍。取0.5mlNM1369病毒液接种单层MDBK细胞，37℃吸附1h；7.每隔15min轻轻摇细胞瓶一次；8.将溶液倒入废液缸，加入5ml2%FBS的DMEM维持液（含100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素）在5%CO2培养箱中继续培养；9.收毒：反复冻融三次，收获病毒上清液；10.连续传代，观察细胞病变情况；4.3.13间接免疫荧光试验测定NM1369病毒滴度（1）取对数生长期的MDBK细胞，稀释至约1×105个/mL，将细胞接种于48孔板培养24h后弃去培养基，用不含血清的DMEM洗三遍；36 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序（2）将病毒原液进行10倍梯度稀释，获得10-3至10-8六个稀释度的病毒液，每个稀释度的病毒液接种一排（8个）细胞孔，0.2mL/孔。37℃恒温培养72h；（3）吸去孔中的病毒液，加入预冷的固定液（丙酮：甲醇=1:1），0.5mL/孔，-20℃固定30min；（4）吸去孔中的固定液，晾干；（5）加入BVDV抗体，37℃孵育1h，PBS洗3遍；（6）加入FITC标记二抗，37℃孵育1h，PBS洗3遍；（7）显微镜下观察感染情况，并对每一稀释度的感染孔数进行计数。找出有至少一半的孔发生感染的最高稀释度。根据感染情况计算TCID50，TCID50计算公式：logTCID50=出现大于50%阳性孔的最高稀释度对数+距离比例×稀释系数的对数，距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性百分比-小于50%的阳性百分比）。计算病毒滴度，做好记录。4.4结果4.4.1不同片段PCR扩增产物电泳结果图4-2.M为DL5000Marker。泳道1-7分别对应片段1、2上、2下、3、4、5、6，大小分别为1700bp、1266bp、867bp、1990bp、1883bp、2510bp、2078bp，符合预期大小。37 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序4.4.2不同阳性克隆株酶切产物电泳结果图4-3.M为DL5000Marker。泳道1-7分别对应1、2上、2下、3、4、5、6片段连接pGEMT-easy载体后选择单一限制性内切酶双酶切产物，符合预期大小。图4-4图4-5图4-6图4-4.M为DL5000Marker。泳道1-2分别对应2上质粒Apal、Apal/HindIII单酶切和双酶切产物，均符合预期大小。图4-5.M为DL5000Marker。泳道1-2分别对应2下质粒HindIII、HindIII/Spel单酶切和双酶切产物，均符合预期大小。图4-6.M为DL5000Marker。泳道1-2分别对应6#质粒BamHI、BamHI/NgoMIV单酶切和双酶切产物，均符合预期大小。4.4.3全基因组序列分析测序结果表明，NM1369基因组为12268bp，编码3902个氨基酸。对全基因组进行分析，根据其5'UTR列和Npro序列，确定内蒙1369属于BVDV-1m基因亚型。NM1369全基因序列与GenBank数据库中6个中国分离毒株和6个外国分离毒株进行比较，核苷酸同源性为74.0%-94.8%，其中NM1369与中国分离毒株SD-15同源性最高，核苷酸同源性为94.8%（图4-7）。38 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序图4-7.NM1369与12个参考株核苷酸同源性比较4.4.4NM1369株生物分型和毒价测定NM1369与参考毒株BVDVC24V分别接种MDBK细胞，3d-4d后均出现CPE，呈现细胞聚堆，拉网等现象，未接种病毒MDBK细胞形态正常（如图4-8），这表明NM1369属于致细胞病变型。图4-8.NM1369生物型鉴定ANM1369接种MDBK细胞、BC24V株接种MDBK细胞、C正常MDBK细胞BVDVNM1369株经MDBK细胞培养连续传代后，细胞适应良好。采用免疫荧光方法（图4-9）测定病毒毒价，结果显示BVDVNM1369第20代细胞培养液的病毒滴度为105.24TCID50/0.1ml。图4-9间接免疫荧光试验ANM1369接种细胞、BC24V接种细胞、C正常MDBK细胞39 中国兽医药品监察所硕士学位论文第四章一株分离BVDV毒株的全基因组测序4.5讨论全基因组序列蕴含了大量生物信息，本研究从散养肉牛中分离获得了BVDVNM1369毒株，并完成了全基因组测序。通过分析可以发现，不同地理区域流行株间存在一定差异，这也反映了RNA病毒在适应环境过程中表现出了高的突变频率，符合RNA病毒的一般特性。序列核苷酸同源性比对结果显示，NM1369与中国分离毒株ZM-95以及SD-15同源性最高，核苷酸同源性为94.8%。其中SD-15分离于牛，ZM-95分离于猪，显然BVDV已实现了不同物种间的传播。此外，从第三章构建的进化树可以知道，NM1369属于BVDV1-m亚型，这与报道中近些年1m亚型数量增多趋势一致，同时也提醒我们需要加大对BVDV流行病学的检测以及加强对BVDV防控的力度。细胞驯化培养发现，NM1369株属于细胞病变型。接种MDBK第3-4天，细胞开始出现聚堆、圆缩、拉丝等现象，但这一结果需要进一步使用其他细胞，如BT细胞等进行验证。由于本研究血清样本均采集于无临床症状的健康散养肉牛，所以NM1369能否引起回归动物发病，需要进一步的试验验证。NM1369毒株的成功分离以及全基因组测序，可以丰富备选疫苗毒株库，为BVDV疫苗研究提供参考。40 中国兽医药品监察所硕士学位论文第五章结论第五章结论5.1实验结论5.1.1对从云南、新疆、甘肃和内蒙古四省区采集的1332份健康散养肉牛血清样本进行BVDV抗体检测，阳性率为33.93%。其中，内蒙古血清抗体阳性率71.43%、新疆57.69%、甘肃16.54%、云南10.0%。BVDV抗原检测阳性率为1.58%，其中内蒙古血清抗原阳性率1.60%，新疆5.49%，甘肃2.31%，云南0.19%。5.1.2本研究共分离了13株BVDV流行毒株，从基于5'-UTR序列和Npro序列分别绘制的系统进化树可以看出，新疆地区分离的11株毒株分别属于BVDV-1q和BVDV-1f，内蒙古地区分离的1株毒株属于BVDV-1m，甘肃地区分离的1株毒株属于一种新的基因亚型BVDV-1u。5.1.3NM1369基因组为12268bp，编码3902个氨基酸。其基因型为BVDV-1m，接种MDBK生物型为CP型，病毒效价为105.24TCID50/0.1ml。5.2创新点1.较为系统的调查了西部四省区散养肉牛BVDV流行状况。2.明确了西部四省区散养肉牛流行的BVDV中有基因型1m，1f，1q和1u毒株。3.对一株1m基因型的BVDV分离毒株进行了全基因组测序以及生物特性的初步探究。41 中国兽医药品监察所硕士学位论文参考文献参考文献[1]C.M.Fauquet,M.A.Mayo,J.Maniloff,U.Desselberger,andL.A.Ball,Virustaxonomy:VIIIthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses[M],AcademicPress,2005.[2]P.Olafson,A.MacCallum,andF.H.Fox.Anapparentlynewtransmissiblediseaseofcattle[J].TheCornellVeterinarian,1946,36:205.[3]F.Ramsey,andW.H.Chivers,Mucosaldiseaseofcattle[J],IowaStateCollege,1951.[4]J.A.Baker,C.J.York,J.Gillepsie,andG.B.Mitchell.Virusdiarrheaincattle[J].AmericanJournalofVeterinaryResearch,1954,15:525-531.[5]J.H.Gillespie,J.A.Baker,andK.McENTEE.Acytopathogenicstrainofvirusdiarrhoeavirus[J].CornellVeterinarian,1960,50:73-79.[6]A.McClurkin,E.Pirtle,M.Coria,andR.Smith.Comparisonoflow-andhigh-passagebovineturbinatecellsforassayofbovineviraldiarrheavirus[J].ArchivfürdiegesamteVirusforschung,1974,45:285-289.[7]D.E.Gutekunst,andW.A.Malmquist.Separationofasolubleantigenandinfectiousparticlesofbovineviraldiarrheavirusesandtheirrelationshiptohogcholera[J].Canadianjournalofcomparativemedicineandveterinaryscience,1963,27:121.[8]段震,荆景华.动物病毒学第二版[M],北京:科学出版杜,1997.[9]陈家璞.乳牛疾病学[M].农生出版杜,北京,1992.[10]蔡宝样,家畜传染病学[M],北京:农业出版杜,2001.[11]H.Houe.Epidemiologyofbovineviraldiarrheavirus.VeterinaryClinicsofNorthAmerica[J].FoodAnimalPractice,1995,11:521-547.[12]高存福,秦建华,赵月兰,等.牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科技,2005,35:620-622.[13]张改文,李赟,郝卫芳,等.太原地区奶牛病毒性腹泻流行病学调查[J].中国奶牛,2013:39-42.[14]J.F.Ridpath,G.Lovell,J.D.Neill,T.B.Hairgrove,B.Velayudhan,andR.Mock.ChangeinpredominanceofBovineviraldiarrheavirussubgenotypesamongsamplessubmittedtoadiagnosticlaboratoryovera20-yeartimespan[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,2011,23:185-193.[15]J.D.Neill.Molecularbiologyofbovineviraldiarrheavirus[J].Biologicals,2013,41:2-7.[16]N.Underdahl,O.Grace,andA.Hoerlein.Cultivationintissue-cultureofcytopathogenicagentfrombovinemucosaldisease[J].ExperimentalBiologyandMedicine,1957,94:795-797.[17]季新成,牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究[D],西北农林科技大学,2010.[18]郜玉钢,鹿源BVDV分离鉴定,E0基因的克隆与表达及免疫原性研究[D],万方数据资源系统,2005.[19]A.Fernelius,W.Amtower,W.Malmquist,G.Lambert,andP.Matthews.Bovineviraldiarrheavirusinswine:neutralizingantibodyinnaturallyandexperimentallyinfectedswine[J].Canadianjournalofcomparativemedicine,1973,37:96.[20]S.Bolin,V.Moennig,N.K.Gourley,andJ.Ridpath.Monoclonalantibodieswithneutralizingactivitysegregateisolatesofbovineviraldiarrheavirusintogroups[J].Archivesofvirology,1988,99:117-123.[21]B.Cay,G.Chappuis,C.Coulibaly,Z.Dinter,S.Edwards,I.Greiser-Wilke,M.Gunn,P.Have,G.Hess,andN.Juntti.Comparativeanalysisofmonoclonalantibodiesagainstpertiviruses:reportofaninternational42 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中国兽医药品监察所硕士学位论文致谢致谢宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。三年研究生生活，不仅让我积累了丰富的专业知识，掌握了各种实验操作技能，也开阔了我的眼界，拔高了我的人生观与世界观。值此论文完成之际，我要向一路走来给予我支持、帮助和温暖的人致以最衷心的感谢！感谢恩师赵启祖研究员的悉心栽培！从课题的切入到试验方案的确定，从试验瓶颈期的解疑答惑到对试验结果的深入剖析，从文章的发表到论文的撰写，无不凝聚了恩师的心血与智慧。恩师的博学、严谨和负责，深深感染着身边的每个人。三年来，我耳濡目染，受益匪浅。感谢范学政副研究员的无私指导！感谢邹兴启师兄、朱元源师姐、马丽师姐、李纬亮师弟和刘元杰师弟的诸多帮助！感谢检测技术室宁宜宝主任、丁家波主任、王琴研究员、徐璐副研究员、张乾义博士、彭晓薇博士、蒋卉老师、朱良全副研究员以及所有教职工人员的关怀！感谢中国兽医药品监察所为我们学生创造了良好的生活和学习环境，搭建了一流实验平台，让我们在科学的前沿勇攀高峰。感谢金宇保灵、新疆天康、中牧兰州实验动物检验室及保山生物药厂的赵丽霞、王焰、马爱荣和彭正启在本次试验采样过程中提供的诸多帮助！感谢张玉杰、孙莹、张金亚、张东东和张映在奋斗岁月中的陪伴！因为分享，所以快乐；因为交流，所以进步；因为共同面对，所以一起成长。陪伴是最长情的“告白”，愿我们之间的友谊地久天长！感谢父母！赐予我生命，滋养我成长，教育我成人。此时此刻，脑海中反复播放乌鸦反哺、羔羊跪奶的画面，是时候鼓起勇气向您们说：爸爸、妈妈，我爱您们。让我接过您们肩头的担子，让我来照顾您们吧！最后，再次向所有关心、鼓励和帮助过我的老师、同学、亲人、朋友表示最诚挚的谢意，感谢人生的旅途能与您们同行。路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！48 中国兽医药品监察所硕士学位论文作者简历作者简历基本情况:姓名：陈锐性别：女民族：汉出生日期：1988年3月15日政治面貌：共青团员籍贯：山东省德州市专业方向：预防兽医学受教育经历:2008年9月—2012年6月，山东农业大学动物医学专业，获农学学士学位；2012年7月—2013年8月，山东和康源有限公司，从事化验工作；2013年9月—今，中国兽医药品监察所预防兽医学专业；在读期间发表文章:[1]陈锐,范学政等.西部散养肉牛病毒性腹泻病毒流行及遗传变异研究[J].中国农业科学，接收.49
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