一株抗肿瘤新城疫病毒的全基因组测序及毒力测定

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1、河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北北方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：研究生签名：撇2013年5月30日研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。}导师签名研究生签名：渤疆2013年5月

2、30日目录中文摘要⋯。．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6研究论文一株抗肿瘤新城疫病毒的全基因组测序及毒力测定—1上一—jl‘且¨舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64综述新城疫病毒用于联合抗肿瘤的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯84个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85中文摘要一株抗肿瘤新城疫病毒的全基因组测序及毒力测定摘要新城疫病毒(newcastlediseasevirus，NDV)为

4、单负链不分节段的RNA病毒，属于副黏病毒属。近些年来，NDV的宿主范围不断扩大，可感染多种家禽和野生鸟类，引发新城疫(newcastledisease，ND)，而人类对NDV的感染率极低，主要表现为流感样症状。NDV对肿瘤细胞的特异性杀伤能力已经使其成为抗肿瘤生物制剂的研究热点。目前，越来越多的NDV株已被证明能够高效抗肿瘤，而对于同一种肿瘤细胞，不同NDV株的杀伤能力却不同，这可能与病毒间的基因组序列差异密切相关。同时，NDV的抗肿瘤机制研究越来越需要将病毒基因组序列与NDV诱导的肿瘤细胞凋亡信号通

5、路联系起来。本实验室保存一株抗肿瘤NDV——Ⅷ3舭SRC／F3，其抗肿瘤机制己被初步探索，本实验将测定期3NU／LSRC／F3的毒力及其全基因组序列。在毒力测定部分，首先制备NDV皿Ⅻ7／I，SRC／F3和Mukteswar，之后设立空白对照组、阴性对照组(灭菌生理盐水)、阳性对照组(Mukteswar)及实验组，最后测定鸡胚平均致死时间(meandeathtimeofchick-embryos，MOT)、脑内致病指数(intracerebralpathogenicityindex，ICPI)及静脉致

6、病指数(intravenouspathogenicityindex，IVPI)。在全基因组测序部分，首先通过试剂盒提取病毒基因组RNA，之后利用设计的16对引物通过一步法RT-PCR及两步法RT-PCR进行目的片段的扩增，扩增片段之间部分重叠，且拼接后覆盖整个基因组。对于基因组的两末端，采用锚定引物及特异性引物，通过简化的cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAend，RACE)而获取相应的扩增片段。所有扩增片段在电泳鉴定后被送往北京华大公司进行纯化后测序，并通过生物

7、信息学软件处理测序结果和进行序列分析。结果显示耶NU／LSRC／F3的MDT为105．6h，ICPI为O．26，IVPI为0，这些致病指数均在弱毒株范围内，故HBNU／LSRC／F3为弱毒株。但经序列对比及分析后发现，HBNU／LSRC／F3F蛋白的裂解位点具有中文摘要强毒株的特征性结构，即112RRQRR$F117，因此HBNU／LSRC／F3为F蛋白具有强毒株裂解位点的NDV弱毒株，可被归为不遵循一般规则的特殊NDV，其毒力必然与除F蛋白裂解位点之外的其他因素密切相关。HBNU／LSRC／F3基因

8、组全长为15192nt，其中蛋白编码序列含量为90．5％，G+Cm01％为46．8％。整个基因组包括3’末端(55nt)、ⅣP基因(1753nt)、P基因(1451nt)、M基因(1241nt)、F基因(1792nt)、HN基因(2002nt)、L基因(6703nt)和5’末端(114nt)。6个基因的编码蛋白为NP蛋白(489aa)、P蛋白(395aa)、V蛋白(239aa)、W蛋白(137aa)、M蛋白(364aa)、F蛋白(553aa)、HN蛋白(