新城疫病毒基因组生物信息分析及mukteswar株毒力增强分子机制研究

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1、Ph．D．DissertationTheBioinformaticsAnalysisofNDVandTheMolecularMechanisminVirulenceIncreaseofMuktswarStrainBYPh．D．candidate：SongQingqingSupervisor：Prof．LiuXiufanYangzhouUniversityCommencementinJune2013宋庆庆：新城疫病毒基因组生物信息分析及Mukteswar株毒力增强分子机制研究新城疫病毒基因组生物信息分析及Mukteswar株毒力增强分子机制研究博士研究生：宋庆庆导师：刘秀梵教授摘要新城疫是一

2、种重要的家禽传染病，该病病原体为新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)，又称禽副粘病毒1型(Avianparamyxovirus．1，APMV-1)，属于副粘病毒科Avulavirus病毒属中的一员。尽管NDV只有一个血清型，但却存在多个基因型。按不同分离株基因组之间的分歧度大小，NDV被分为11个基因型(I．Ⅺ)；根据最新提议的分类标准，该病毒进一步被分成16个基因型(I．XⅥ)和更多的基因亚型。作为副粘病毒科一员的NDV其主要进化动力是来源于RNA依赖性的RNA聚合酶缺乏校对功能而造成的RNA复制错配率高，但也有学者表示不同分离株之间也会发生重组现象，使该病毒

3、能以一种更迅速的方式进化。在这两种进化动力中，RNA依赖性的RNA聚合酶的高变异率是毋庸置疑的，但是对于负链RNA病毒来讲同源重组似乎并不多见。本研究通过对NDV基因组一系列的数据集进行生物信息学分析来估测影响NDV变异的主要进化动力。另外，根据不同分离株的毒力差异，NDV又可以分为低毒力、中等毒力和强毒力三种致病型。本研究在全基因组比对分析时发现一株基因III型强毒分离株JS／7／05／Ch的基因组与I系苗Mukteswar株相似度高达99％以上，但其毒力却明显高于后者，为了探究影响这两株III型NDV毒力差异的关键性基因，本文详细比对了两株病毒基因组之间的差异，并对主要差异基因的生物学

4、意义进行了研究。II扬州大学博士学位论文1非自然重组对新城疫病毒遗传进化分析的影响通过对本实验室于2005年到2009年间分离的100多株NDV的F和HN基因进行遗传进化分析，我们并未发现同源重组事件的存在，但近几年越来越多的关于NDV的同源重组的案例被报道，其中有些基因组甚至发生多重重组现像。鉴于同源重组在NDV遗传进化过程中所起的作用存在不同的观点，本研究首先从GenBank数据库中下载到80条NDV的全基因组序列(2011年4月18日之前释放的序列)并使用重组分析软件(RecombinationDetectionProgram，RDP)进行分析。结果显示有8条全基因组序列具有重组现象

5、，在这8株预测的同源重组子代病毒中有5株病毒发生了多重重组现象。本研究对其中的两条含有重组片段的全基因组序列(China／Guangxi09／2003和NDV／03／018)进行遗传进化分析，结果同样显示GenBank数据库中的全基因组序列均含有两种不同基因型的DNA片段。为确保重组事件的真实性，我们对这两株NDV进行空斑纯化后重新测序并再次进行重组分析。结果显示，新获得的全基因组并不存在同源重组片段，我们分析认为原始数据中的重组现象很可能是测序者对混合感染的分离样品或者实验室污染的样品测序时造成的人为重组事件。为证实人为重组存在的可能性，我们将两株不同基因型的NDV进行人为混合，然后使用

6、一对引物对该混合样品扩增M基因并测序，结果表明这对引物不仅可以扩增出两种不同基因型的M基因片段，而且还可以在同一段PCR产物中同时扩增出两种基因型的DNA片段。这充分证实对NDV基因组进行PCR时Taq酶存在模板转换的现象，导致不同基因型的序列被扩增到一起而产生非自然的人为重组现象。以上结果充分表明GenBank数据中NDV全基因组序列中的同源重组并非都是自然重组事件，而这些非自然的人为重组现象会对NDV遗传进化动力学分析造成一定的误导作用。2鸽副粘病毒1型进化动力学特点分析鸽源NDV，又称鸽副粘病毒l型(pigeonparamyxovirus．1，PPMV-I)，是APMV-1的变异分支

7、，20世纪80年代中期该变异株病毒通过鸽群开始向世界各国蔓延。虽然PPMV-1的F蛋白裂解位点是典型的强毒类型，但多数PPMV-1对鸡的致病力却是中等毒力或低毒力。基于这个特点我们推断PPMV-1应该具有其独特的进化动力学基础。遗传进化分析显示几乎所有分离于鸽群的NDV均聚拢在同一个分支——_GenotypeVIb，说明PPMV-1很可能已经在鸽群中获得适应性变异导致该分支对鸽子具有明显的宿主特异性；与之相对的是基因VI