一肺泡微石症家系临床特点及致病基因研究

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广―二：二‘―■一；、、二‘“、二：汐—一—：广■‘、 一肺泡微石症家系临床特点及致病基因研究作者姓名：马天罡专业名称：内科学研究方向：弥漫性间质性肺疾病指导教师：马忠森教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学第二医院论文答辩曰期：年（月彡曰授予学位日期：年月曰论文评阅人：答麟员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位吴尚洁教授中南大学湘雅第二医院主席李玉林教授吉林大学基础医学院孔娟教授中国医科大学盛京医院委员孙连坤教授吉林大学基础医学院李鮮中国医科大学財属第一医院张捷吉林大学第二医院许力军髓吉林大学第一医院安东善教授吉林省人民医院陈珊教授东北师范大学生命科学院马忠森教授吉林大学第二医院赵立中国医科大学盛京医院李玉新东北师范大学 未经本论文作者旳书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：各格曰期：年月曰 中文摘要一肺泡微石症家系临床特点及致病基因研宄肺泡微石症是一种罕见的缓慢进展的肺部疾病。特征是中下肺野肺泡内出现广泛球形钙化灶磷酸钙盐或称为微结石的聚集。大多数病人在诊断时是无症状的，通常是在常规体检过程中偶然发现疾病的存在，症状主要表现为反复的咳嗽或渐进性呼吸困难。疾病的发生可以是散发的也可以是家族性的，有大约为是家族性发病的，属于常染色体隐性遗传病。随着分子生物学技术的迅速发展，关于其病因的研宄已经取得了显著进展，目前认为肺泡上皮内是编码型磷酸钠协同转运蛋白的基因溶质转运蛋白家族成员突变引起富含磷酸钙的微结石在肺泡内形成和聚集，是本病发生的主要原因。属于溶质转运蛋白家族的成员之一，在人体内多种组织器官均有表达。对于维持体内无机磷的代谢平衡起着至关重要的作用。在临床工作中，我们发现了一个近亲婚配的家系，该家系共有名患者，他们是同胞。本文主要对这个家系进行临床特征分析、致病基因检测，从而为的发病机制、遗传学特点及治疗策略的研究提供研究帮助。本研究对象为中国吉林省松原市一个典型的肺泡微石症家系。该家系为近亲结婚家庭，共有代人，本家系第一代为亲表兄妹近亲结婚，均健在，第二代直系子女人，男女，根据其典型的影像学变化及病理改变，诊断为死亡人，第三代人，第一代及第三代行常规胸片检查均未见发病。该家系具有明显的家族聚集性和遗传稳定性，是研究致病基因理想的家系。材料和方法：本研究第一部分详细收集该家系名患者临床资料，对于其临床特点进行分析、总结。第二部分对该家系所能联系到的位家庭成员在严格无菌操作下 釆外周血，另选取丨例体检健康的无关正常人外周血作为对照，基因位于号常染色体的短臂上，在人体位于有个外显子，第个为非编码外显子，其余为编码外显子，计对所有编码外显子设计引物进行扩增。扩增片段包括外显子及’和’两侧的部分内含子序列。将扩增产物交由北京华大基因有限公司进行测序，测序结果用阅读，在上进行比对。第三部分利用在引导下经皮肺穿刺活检获得的其中一名患者的肺组织标本与正常肺组织标本的对比，进行基因的功能研宄。首先构建基因真核表达载体，利用限制性内切酶和将基因插入到质粒载体中，构建重组质粒，并转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定及重组质粒核苷酸测序分析，证实重组质粒构建成功。因基因编码的型磷酸钠协同转运蛋白，主要是在肺泡表面活性物质代谢过程中参与磷酸盐的转运，因而选取了可以模拟正常型肺泡上皮细胞分泌肺表面活性物质的人肺腺癌细胞系细胞进行转染研宄基因对无机憐代谢的影响，通过阳离子脂质体包裹重组表达载体转染入细胞进行表达提取、对重组质粒进行鉴定，正常对照组和组均在左右的位置出现基因扩增片段，与预期片段大小相符，证实了重组表达载体在细胞中得到完整表达。于成功转染小时以后，收集细胞培养上清，利用全自动生化分析仪检测质粒对照组、正常对照组、组细胞培养上清中无机磷浓度。结果本研究一共在个外显子上发现了处碱基改变。第个是在对号外显子扩增产物测序时在名患者中均发现了纯合突变，从而使编码的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸，属于氨基酸替换。而在患者父母和 子女的标本中该位点测序结果均为杂合突变，患者的配偶和名正常人的测序结果均正常，属于表型基因型共分离突变。第个碱基改变是在对号外显子扩增产物测序时在全部家庭成员患者及其父母、子女、配偶和一名健康受试者中均发现的纯合，在的数据库中査到为。本家系所有家庭成员及名健康受试者均有，并未表现出表型基因型共分离。第个碱基改变同样发生在号外显子上，是在患者及其父母还有其中名子女的标本中发现的〉纯合突变，在另外名子女中为杂合突变，患者的配偶和正常人测序结果均正常。该突变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列和功能，属于同义突变；且该突变在家系中的作用同样未表现出表型基因型共分离。在对质粒对照组、正常对照组、组细胞培养上清中无机磷浓度的检测中，结果显示正常对照组细胞上清中无机磷的浓度明显下降，分别与质粒对照组和组相比，差异均有显著性。组细胞上清中无机磷的浓度略有下降，与质粒对照组相比，差异均有显著性。结果证实了第一步实验中由于基因号外显子的纯合突变，使原来编码的苏氨酸变为赖氨酸，导致功能下降。结论该家系为一典型的常染色体隐性遗传肺泡微石症家系，隐匿起病，主要是在行常规胸部线检查时发现存在。根据基因测序研究发现基因号外显子存在纯合突变，从而使编码的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸属于表型基因型共分离突变，也符合该家系的遗传特点，故认为是本々家系致病的遗传学基础。通过构建基因的真核表达载体并转染人肺泡上皮细胞中，对基因的功能进行研宄发现由于号外显子纯合突变的发生，导致该家系患者体内由基因编码的蛋白功能下降，使其正常的磷酸盐转运功能受损，因而不能完全 的从肺泡腔内清理掉磷离子，使磷酸盐在肺泡内大量沉积，与钙离子结合形成磷酸钙微结石，导致了疾病的发生。■词肺泡微石症，家系，基因 AbstractTheresearchaboutclinicalfeatureandgenemutationdetectioninapedigreewithpulmonaryalveolarmicrolithiasisPulmonaryalveolarmicrolithiasis(PAM)isarareautosomalrecessivediseasecharacterizedbydiffuseaccumulationofinnumerablesphericcalciumphosphatemicrolithsinthealveoli.Clinical-radiologicaldissociationisanimportanthallmarkofthisdisease.MostPAMpatientsareasymptomaticandpulmonarytissuechangesarediscoveredincidentally.Generally,PAMpatientsbegantopresentsymptomsmainlyincludingrepeatedcoughorprogressivedyspnea.PAMhassporadicandfamilialoccurrenceand38-61%ofPAMpatientsarefamilial.PAMismainlypathologicallyattributedtoformationandaggregationofcalciumphosphatemicrolithsinthealveoliaftermutationsintheSLC34A2gene(thetypelibsodium-phosphatecotransportergene)codingNaPi-IIb.Asamemberofsolute-transferproteinfamilySLC34，， familialaggregationandsteadyinheritancethussuitableforstudyofPAMpathologicalmechanism.MATERIALSANDMETHODSClinicaldataandcharacteristicsoffourpatientsaredetailedandanalyzedinthefirstpartofthispaper.Thesecondpartofthispaperaimedatanalyzingexperimentalprocess:5mLofperipheralbloodwastakenfromninefamilymembersrespectivelyandkeptunderanti-coagulationwithEDTA.Simultaneously,equalamountofperipheralbloodwastakenfrom10unrelatedhealthysubjectsafterphysicalexamination.SLC34A2gene,equippedwith13exonsincludingthefirstnon-codingexonandtherest12codingexons,islocatedontheshortarmofchromosome4(4pl5.1-pl5.3).PCRprimersweredesignedtoamplifythese12codingexonsforamplication,includingtheexonsequenceandapartofintronsequence(i.e,,5'and3'flankingregions).PCRproductssequencingwereassignedtoBGICo.，，，，， recombinantplasmid.InbothcontrolgroupandPAMgroup,amplificationfragmentsobtainedformthelocusat2000bpwereinaccordancewiththesizeofexpectedSLC34A2fragment.Inthisway,pcDNA3.1(+)?SLC34A2recombinanttransfervectorwastotallyexpressedinA549cells.Cellculturesupernatantsfromplasmidcontrolgroup，：，，，，，， culturesupernatantdecreasedslightlyinPAMgroupyetstillsignificantlyincomparisonwithplasmidcontrolgroup(P<0.01).TheresultsconfirmedthatNaPi-IIbdisfunctionderivedfrommutatedcodeoflysineratherthanthreonineowningtoc.575C>Ahomozygousmutationat6thexonofSLC34A2.Conclusion：： 目录第章综述第部分肺泡微石症文献回顾第部分基因的表达及影响因素第章家系的遗传特征、临床特点家系病例调查临床特点讨论第章家系致病基因的研究第部分家系的提取和突变位点的筛查材料与方、法觀寸仓第部分家系基因的功能研究第节基因的真核表达载体的构建材料和方法■第节基因转染人上皮细胞对无机磷代谢的影响材料和方法棘辦参考文献攻读博士期间发表的学术论文及其成果 英文缩写词表英文缩写英文全称中文全称及注释肺泡微石症溶质转运蛋白家族成员表皮生长因子凝胶迁移率变动分析血清糖皮质激素激酶成纤维细胞生长因子甲状旁腺激素脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷三磷酸双蒸水乙二胺四乙酸对数优势计分支气管肺泡灌洗美国国立生物信息技术中心聚合酶链式反应限制性片段长度多态性单核苷酸多态性单链构象多态性三羟甲基氨基甲烷盐酸乙二胺四乙酸缓冲液碱基三羟甲基氨基甲烷 第章综述第章综述第部分肺泡微石症文献回顾肺泡微石症是一种罕见的缓慢进展的肺部疾病。于年首次将其命名为。本病的特征是中下肺野肺泡内出现广泛球形韩化灶磷酸韩盐或称为微结石的聚集。大多数病人在诊断时是无症状的，通常是在常规体检过程中偶然发现疾病的存在。在任何年龄均可发病从新生儿到岁的老年患者均有发病的病例报道。大多数病人可以持续几年甚至几十年无症状，一般是在三十到四十岁时才开始出现症状，症状主要表现为反复的咳嗽或渐进性呼吸困难。疾病的发生可以是散发的也可以是家族性的，有大约为是家族性发病的，属于常染色体隐性遗传病。“暴风雪”或“沙尘暴”样改变是典型的放射线表现。由于本病放射线改变与临床症状的轻重不相称，故该病的诊断多依赖于放射线改变，尤其对于己有确诊为患者的家庭中其他成员。是一种长期缓慢进展导致肺功能逐渐下降的疾病。其病因目前认为肺泡上皮内编码型磷酸钠协同转运蛋白的基因，溶质转运蛋白家族成员突变引起富含憐酸韩的微结石在肺泡内形成和聚集所致属于溶质转运蛋白家族的成员之一在人体内多种组织器官均有表达。对于维持体内无机磷的代谢平衡起着至关重要的作用。本文就的临床表现、病理、影像学变化等方面及其与基因之间的关系进行文献综述。流行病学调查在各大洲均有发现，并无特别明显的地区或种族分布差异。截止到目前根据全球文献共报道不足例。相对来说在欧洲更普遍一些， 吉林大学博士学位论文其次是亚洲、尤其是小亚细亚半岛，大多数病例出现在土耳其、意大利、日本等国。在中国关于的病例报道非常少散发的和家族性发病的均有报道，家族性发病中没有明显性别差异，散发病例中以男性发病为主，约占。，的发病年龄很难确定，因为绝大部分病例都是由于因其他原因行胸部放射线检查时偶然发现进而被诊断的。但是根据目前文献资料的描述认为本病可发生于各个年龄阶段，年龄最小的发病患者为一对周双胞胎早产儿。根据对例患者的研宄显示，的患者是在岁之前被诊断，的患者是在岁之前被诊断，一般来说诊断时的平均年龄为周岁’。遗传方面的家族性发病率在日本报道为【】，在土耳其是】，在意大利是，全球范围内家族性发病率平均约为表明了遗传因素在本病发病中的重要作用。当一个家系中有多名患者时，他们通常是兄弟姐妹，父母与子女之间垂直传播很少见几位不同的研宄者独立研究发现了导致的基因。研宄表明溶质转运蛋白家族的成员之一的基因的纯合突变是引起本病的重要因素，该基因主要编码型癖酸钠协同转运蛋白参与无机憐的代谢，，。基因突变可能会引起有缺陷的蛋白产生或者基因不表达，导致其编码的蛋白质丧失功能是引起家族性发生的病因。在对于一个有位成员的近亲结婚的家庭进行基因分析时，等人发现该家系中个被诊断为的孩子均存在基因的纯合突变，而他们的父母和病人的一位同胞则携带有相同基因的杂合突变。这些证据支持本病是一种具有高外显率的常染色体隐性遗传病，只是这种突变的发生非常罕见，人群中染色体发生这种基因突变的频率小于。基因的纯合突变形式目前 第章综述报道有很多种表，等人在一项对随机的名患者和一个近亲结婚患病家系的研宄中，总共发现了种不同的基因纯合突变，两种是移码突变，两种为链终止，一种是氨基酸替换，一种是跨越最小启动子和号外显子的碱基缺失的突变。等人在个患者中发现了种不同的基因纯合突变，其中人为同胞，其余人间无任何关系，有个病人的父母为近亲结婚。有个病人中被发现属于移码突变，另外个病人属于剪切位点突变引起拼接失败，导致蛋白质翻译过早终止。由于在不同的病人中均检测到了基因突变的发生，故考虑本病可能不存在遗传异质性。表患者中发现的基因的几种突变类型病例定位；对翻译的对■蛋白质合娜」影响成的预测启动子、外不合成蛋白显子外显子移码蛋白截断外显子蛋白截断外显子氨基酸替换外显子移码蛋白截断外显子蛋白截断外显子拼接失败蛋白截断外显子移码蛋白截断引自文献，引自文献发病机制基因在人体中多种组织均有表达，包括肺、小肠、乳腺、睾丸等，但主要是在肺和乳腺中表达，在肺内该基因仅表达在型肺泡上皮中。肺泡上皮的多种跨膜转运溶质组成了肺泡液。型肺泡上皮在肺内起着重要的作用，包括合成和分泌表面活性物质，维持肺泡顺应性；强大的液体转运能力对肺泡 吉林大学博士学位论文内液体的产生和清除具有重要意义以及免疫调节和抗炎的作用。型肺泡上皮中存在着几种类型的表皮转运方式，包括钠依赖的葡萄糖转运及通过钠运道进行的氨基酸、启动子及钠转运。这些及其他的跨膜转运提供了在型肺泡上皮细胞中合成肺表面活性剂所需的基本原料。型肺泡上皮细胞产生的肺表面活性物质，其成份是二棕榈酷卵磷脂，降解的憐脂释放出的憐酸盐应该从肺泡内被清除。野生型型憐酸钠协同转运蛋白在有钠离子存在的情况下可以转运憐酸盐，而突变型也不能。野生型的这种蛋白将钠与憐酸盐按〇的方式形成转运至细胞内，从而诱导产生内向的电流。基因突变可能会引起有缺陷的蛋白产生或者基因不表达，导致型磷酸钠协同转运蛋白功能失活，’，使型肺泡上皮细胞不能从肺泡腔内清理掉磷离子，导致细胞外液中憐酸韩微结石的形成，，是发生的主要原因。型碟酸钠协同转运蛋白虽然在多种上皮来源的组织中均有表达，但大多数病例中，肺是唯一受累的器官。在的病人的其他器官包括胸膜、胆囊、睾丸、精囊及尿道均可见到韩盐沉积病理肺泡内的韩盐沉积首先发生在下肺，经过多年的沉积，病灶逐渐扩展至中下三分之二的分布，进而向上肺蔓延。大体病理上肺组织失去弹性，变得很硬，肺表面呈颗粒状和不规则突起，触之有砂碌感，切面如砂纸，呈砂纸装纹理。在肺尖部偶可见肺大泡的出现到目前文献报道进行尸检的病例不足例报道中最重的肺组织达到’。目前活体病理标本的获得主要依靠纤支镜肺活检、胸腔镜肺活检、引导下经皮肺穿刺活检等。可于多个部位行肺活检，阳性率较高、创伤小、并发症少，易被患者接受，是目前临床主要采用的活检方式。镜下可见典型的病理特征是同心层状排列的丐化小体，其周围往往可见新月形光环，类似“洋葱皮”样外观主要存在于肺泡内，单个或多个微结石可被肺泡内巨嗟 第章综述细胞所吞嗟。微结石呈圆形或卵圆形，大小不等，直径约，平均为。射线能量色散光谱提示微结石中磷与韩离子的比例为，与憐酸韩和轻基磷灰石中的比例一致，某些病例证实还含有少量的铁，锌，错，挂，镁。发病初期肺泡及小叶间隔结构完整，气体交换不受影响，故肺功能正常，无临床症状。随着病情进展，微结石的逐渐增大，整个肺泡腔被填满，微结石对于肺泡壁的压力引起了肺泡的损伤，肺泡内幵始出现炎细胞浸润、肺泡壁增厚、间质纤维组织增生，引起了限制性通气功能障碍及弥散功能下降，同时由于肺大泡的出现还会引起复发性气胸。临床表现及实验室检査本病的放射线改变与临床症状的轻重不相称，这意味着大多数病人在诊断时是无症状的或仅有轻度的限制性通气功能障碍，只是由于因其他原因行胸部放射线检查时偶然发现肺部病变而被诊断的。在有症状的病例中，紫组和件状指一般为首发症状，其他常见的症状是劳力性呼吸困难，并伴有乏力、干咳、胸痛及略血但均无明显的特异性，也有患者病程中会有微结石咳出，部分患者合并有气胸。肺泡内微结石的直接刺激可以诱发支气管树及肺实质中的无髓纤维释放速激肽，具有较强的致炎作用并可激活其他受体引起咳嗽气在缓慢进展的病程中，微结石可能在儿童时期即开始形成，而临床症状的出现则是在很久以后。疾病早期因肺泡结构未被破坏，肺功能正常，故无症状。随着病情的逐渐进展，微结石占据的大量的肺泡并使肺组织变硬、失去弹性，引起肺限制性通气功能障碍、通气灌注比例失调，最终导致低氧血症、肺动脉高压及肺心病的出现。大多数病人血常规检查以及血丐、憐浓度、肝功、肾功的检查均未见明显异常少数病例报道有轻度的高韩血症和高憐血症的出现。最近有文献报道血清中肺泡表面活性物质相关蛋白和肺泡表面活性物质相关蛋白的浓度明显升高，和在肺泡蛋白沉着症、特发性肺纤维化的患者中亦明显升高。这可能是与患者肺实质弥漫 吉林大学博士学位论文性纤维化导致渗透性增加有关，故和浓度的增加与肺功能的恶化有关，因此可作为监测活动和进展的一项重要指标的肺外表现和并发症基因也在其他组织中表达，目前在肾脏、甲状腺，唾液腺、乳腺、胰腺、前列腺、子宫、卵巢、睾丸及主动脉瓣上均可检测到同时也有关于患者合并肺外其他组织化的报道，包括肾興质沉积症、肾结石胆结石、腰交感神经节和睾丸丐化也有合并附睾、尿道及精囊韩化导致梗阻性无精子症的报道，。心脏的并发症包括主动脉瓣、二尖瓣的丐化狭窄、心包韩化缩窄等出现心脏合并症的患者临床症状常出现的也较早。故认为肺外的丐化也与基因的突变有关。其他报道的与有关的并发症包括乳碱综合征骨干性软骨发育不全，常染色体无眼综合征肥大性骨关节病，漏斗胸】，淋巴细胞间质性肺炎及抗憐脂抗体综合征和盘状红斑狼疫。肺外丐化的表现与基因突变的外显率不同有关，两者之间的关系尚有待于大量研究进一步阐明。影像学表现患者影像学改变十分明显且典型，且与临床症状不相称，这也是的一个重要特征。胸部线片提示双肺浸润性的细砂样小结节影，弥漫性分布，边界清晰锐利，形态不规则，部分融合成片，呈“沙尘暴”样改变。病变以中下肺野为主，肺尖区域通常很少受累。在疾病的进展过程中，细砂样小结节逐渐由稀疏变密集，密度逐渐增高，范围由下向上、自内而外增大，小结节密集沉积的部位形成肺妈化样实变。密集的韩化影往往使心影、膈肌的轮廓消失。高分辨率与线特征基本一致，但可以更清晰的显示细砂状结节的形态、大小、分布、密度及间质纤维化、继发性气胸的范围和程度等。上最常见的的表现是双肺呈弥漫性、对称分布的结节影及胸膜下线样韩化。断层扫描上显示病变以中下肺野、周边部和纵膈旁为著，病变主要沿小叶间隔、支气管血管束和胸膜下走行，边界清楚。韩化非常密集使肺呈白色，每个小叶 第章综述被细腻密实的轮廓包裹，给人的整体印象是石质一样的肺。胸膜下线样韩化的出现主要是由于胸膜表面的次级肺小叶的肺泡内韩盐沉积所致，。妈化的肺组织与侧胸壁之间偶可见狭长透亮带黑胸膜线，等证实其就是胸膜下排列成行的直径约的小囊肿。纵隔窗显示双肺内可见散在点状、条状软组织密度影，部分病灶韩化，在背侧胸膜、纵隔胸膜下聚集呈线样白描征）和或融合成火焰状火焰征；。其他的表现还包括肺野内结节影、胸膜下结节、小叶间隔妈化增厚、肺尖部的肺大泡及碎石路征】。碎石路征为在磨玻璃影背景上重叠有增厚的小叶间隔和小叶内线，类似不规则的碎石路。碎石路征区常与较正常的肺区分界清楚，呈地图样轮廓，其病理学基础是微结石在肺泡内的沉积，增厚的小叶间隔则是由于水肿和明显扩张的淋巴管所造成。同位素骨扫描追踪到锝亚甲基二憐酸盐在肺部有明显的吸收，主要是由于微结石中韩盐表面的化学吸附作用。锝标记的二磷酸盐对于软组织中的韩化灶有天然的亲和力，而且可以用来检测患者早期的肺韩化。肺功能检查肺功能检查、动脉血气分析、通气灌注比例及弥散功能在起病初期均正常。随着疾病的进展，可出现限制性通气功能障碍表现为肺活量和功能残气量下降，，，。、动脉血气分析提示静息状态下存在低氧血症，活动后恶化。肺泡动脉血氧梯度、静脉血掺杂及生理死腔与潮气量的比例在患者中均明显增加。由于肺泡内充满了大量的微结石，以及肺泡间隔的纤维化和增厚，使肺弥散功能明显下降，以致流经这部分肺泡的静脉血未经充分动脉化便掺杂入动脉血内。临床过程的发病年龄从早产儿到老人均有病例报道本病呈缓慢的发展过程，大多数病人在出现呼吸功能不全之前可没有任何自觉症状的持续很多年，一般是在三十到四十岁时才开始有症状，诊断时的平均年龄为周岁本病缓慢、渐进性的发展过程导致的临床症状的不均一性。某些病例中， 吉林大学博士学位论文病情一直很稳定；而另一些病例中，发病初期主要表现为劳力性呼吸困难，随着时间的推移，逐渐进展为肺纤维化、呼吸衰竭、肺心病伴有明显的呼吸困难，肺功能主要表现为限制性通气功能障碍和弥散功能减低。由于本病具有高外显率，增加上皮细胞代谢的因素如吸烟、炎症刺激等可能会加速疾病的发生、发展过程，因此，吸烟者相对非吸烟人群有着更重的临床症状。患者的长期生存情况并无明确的研宄报道，主要是由于本病长期、缓慢的临床发展过程，诊断时间并不能反映患者真实的发病年龄。大多数病例从最初诊断开始会持续生存年】，只有极少数病例会在诊断后生存超过年，。微结石对于肺泡壁的长期慢性刺激导致了肺纤维化和肺泡壁毛细血管的破坏，两者共同作用引起了肺动脉高压和肺心病的发生。的缓慢进展引起了肺解剖结构的破坏，导致了低氧血症和肺顺应性下降本病的病理改变同时累及了肺实质和肺血管，故预后较差。诊断和鉴别诊断是一种以典型的影像学变化即两肺弥漫分布的致密的细砂样化小结节，以下肺为著为特征的疾病。故胸部放射线检查是诊断最重要的工具。影像学变化与临床症状相分离也是本病重要的特征和诊断依据，即影像学异常程度明显重于临床表现。通过纤维支气管镜肺活检组织病理学检查发现微结石是由围绕着颗粒状内核的同心层状耗化小体形成，其周围往往可见新月形光环，主要存在于肺泡内，呈圆形或卵圆形，肺泡腔内的微结石可以引起慢性炎细胞的浸润并诱导肺纤维化形成。在痰中或支气管肺泡灌洗液中偶尔会发现砂粒样物质。肺组织的丐化可以由一系列全身或肺部疾病引起，因此鉴别诊断很复杂，包括粟粒性肺结核、结节病、尘肺、肺含铁血黄素沉积症、淀粉样变性、组织胞装菌病、病毒感染后钱化及慢性肾功能不全并发的转移性肺韩化。国外有文献报道，例患者有例最初被诊断为结节病或粟粒性肺结核。等的在对一系列病例研究指出，最初被误诊为粟粒性肺结核的个病例中，只有例最后明确合并肺结核。国内文献报道例最终被诊断为的患者中有例在发病初期被误诊为粟粒性肺结核。如果家庭中 第章综述有患者被诊断为，则其他的家庭成员均应行胸部放射线检查进行蹄査。治疗到目前为止，并无有效的治疗手段可以阻止的进展。肺泡内微结石长期慢性的形成引起间质性炎症、纤维化，导致肺容积减小进而发展为右心功能衰竭。本病的基础治疗主要是避免着凉、戒烟、预防呼吸道感染。家庭氧疗对于出现呼吸功能不全的病人是非常重要的。全身性糖皮质激素和支气管肺泡灌洗治疗均是无效的由于患者容易合并感染，糖皮质激素的使用可能会加重继发感染，故在临床上不推荐使用糖皮质激素。在患者中，是憐酸興沉积在肺实质内，不会被所清除，因此全肺灌洗并不像治疗肺泡蛋白沉积症—样对患者有效。依替膦酸二钠，一种骨代谢调节药，该药对体内磷酸韩有较强的亲和力，能抑制人体内异常韩化，降低血清碱性憐酸酶和尿轻脯氨酸的浓度。在某些病例的治疗过程中，显示出可以阻止肺内新的憐酸齊结晶形成并可溶解之前形成的丐化的作用。分别给予两名岁和岁的女性患者依替膦酸二钠每天治疗，一年后发现两名患者的症状和肺部影像学均有所改善。随后分别对她们进行了年和年的随访，发现依替膦酸二钠对于这两名患者肺功能的改善和影像学的变化上都有非常利好的效果；而另外一些研究则报道这种治疗手段没有或仅有很小的作用丨，】。由于报道的病例数少，缺乏循证医学证据证实依替膦酸二钠在患者治疗中的有效性，且长期应用有引起狗偻病样症状的报道，因此依替膦酸二钠在治疗中的有效性和安全性尚待研究。目前，唯一有效的治疗办法就是肺移植。肺移植对于出现严重呼吸衰竭和右心功能不全并依靠氧疗的病人是非常有益的。接受了肺移植后的患者右心射血分数增加，增大的右心室也逐渐缩小。国外报道了例患者成功行双肺序贯移植手术，例为岁中年患者合并有右心功能衰竭，术后天死亡。另例为岁患者，术前有低氧血症伴轻度的限制性通气功能障碍，右心室增大但心功能正常，术后肺功能恢复正常，血氧饱和度上升至，右心增大亦逐渐缓解，随访个月未见复发因此提示，为了获得最好的治 吉林大学博士学位论文疗效果，最佳的治疗时机应该是在出现严重的右心功能衰竭之前。目前关于患者行双肺移植的报道很少，肺移植后的生存率和复发的风险仍有待于长期大量病例的随访。同时，由于基因突变与发生之间关系的发现，有望发明基因治疗方法，由于这个基因主要编码必需的膜蛋白，类似于囊性纤维化跨膜调节基因的功能，因此囊性纤维化跨膜传导调节的治疗方法可能在将来被用于治疗患者。是一种由于基因突变引起的常染色体隐性遗传病。细胞外液中憐酸盐螯合丐形成了微结石。本病具有重要的临床放射线解离特征。大多数病人是无症状的，肺实质的变化是偶然发现的，而少数病例在诊断时就存在严重的症状。对于的诊断主要依赖于典型的影像学变化。由于肺功能的进行性下降、呼吸衰竭和肺心病的出现长期预后差。肺移植是目前唯一有效的治疗手段。 第章综述第部分基因的表达及影响因素在哺乳动物中共发现了三种憐酸钠协同转运蛋白：、和分别由、和基因编码，主要在肾脏、肝脏和小肠中表达，主要在肺内表达，且在肺部仅表达在型肺泡上皮顶端，分布较广泛，包括肾脏、肺部在内。基因位于号常染色体的短臂上，年等在小肠组织中把基因定位在人体，有个外显子第个为非编码外显子，其余个外显子共编码的和含有个氨基酸的憐酸钠协同转运蛋白为多次跨膜蛋白，在肺内仅表达在型肺泡上皮顶端，是肺内最重要憐酸盐载体。应用单克隆抗体检测结做图，由至少个跨膜螺旋组成，有个细胞内结构位点和个细胞外环状结构域。末端和末端均位于胞质侧末端富含半胱氨酸，大的外环上有个糖基化位点位于在胞质外，在胞质内和胞质外至少各有一处短环具有转运通路的重要功能。闻丨吹、棚糊赛—图播酸钠协同转运蛋白膜结构示意图基因的表达基因在肺组织中的表达基因主要在肺内表达，且在肺部仅表达在型肺泡上皮顶端。在对大鼠胚胎的研究中发现从胚胎的天开始就可以检测到的表达， 吉林大学博士学位论文并伴随胚胎的发育直至到成熟的肺，的表达逐渐增强。型肺泡上皮细胞产生的肺表面活性物质，其成份是二棕榈醜卵憐脂，憐酸盐是磷脂的重要组成成分，降解的碟脂释放出的隣酸盐在有纳离子存在的情况可被型憐酸钠协同转运蛋白以的形式转运至细胞内，与肺表面活性物质的代谢密切相关，是型肺泡上皮重要的标志物之一。且有研究指出在非小细胞肺癌中肺组织对的表达较正常肺组织明显下降，考虑其可能与肺癌的发生有一定关系，。基因在肠道中的表达肠道是体内无机憐吸收最重要的部位。肠道内无机憐的代谢主要依靠型憐酸钠协同转运蛋白。蛋白在小肠内呈节段性表达分布，免疫印迹的方法证明在回肠可大量检测到，在十二指肠检测到的比较微弱，而在空肠几乎检测不到。同样蛋白相关染色提示其在回肠刷状缘表达丰富，在十二指肠和空肠则很少或几乎检测不到，。在肠道内的活性受多种因素的调节，、雌激素、低憐饮食、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、糖皮质激素、成纤维细胞生长因子等。烟酸胺可抑制大鼠空肠刷状缘的表达，从而减少肠道对磷的吸收抗病毒药物憐甲酸在小肠上皮细胞与共同转运，竞争性抑制憐的吸收，使血憐水平下降。因此对于的研宄可为肾功能不全患者高憐血症的治疗提供一定帮助。基因在其他部位的表达除在小肠和肺部有表达外，在肝脏和胆管细胞中也有表达。成年大鼠肝细胞和胆管细胞中憐的重吸收主要由介导完成，从而保持肝细胞和胆管细胞中憐的浓度。有研究表明大鼠胆汁中憐的浓度比血衆中低倍，提示介导的胆管内磷的重吸收可有助于清除胆汁中的憐，胆结石的主要成分是磷酸盐，因此认为功能的正常发挥可有效防止胆结 第章综述石的形成。此外，在甲状腺、附睾等组织中也有的表达，并且可能与睾丸微石症的形成有关系。影响基因表达的因素基因表达和信号转导的调控基因是溶质转运蛋白家族的成员之一，编码型磷酸钠协同转运蛋白，主要参与无机憐的代谢，而憐的代谢主要是在肠道中。真核细胞中，初始转录产物需经转录后加工修饰才能成为有功能的成熟，并由细胞核转运至细胞质，对这些转录后加工修饰以及转运过程的控制也是该基因表达的重要方式。在基因表达的过程中，有一些调控基因影响着该基因的转录过程。核因子家族是与启动子相作用的反式作用因子，蛋白已被和验证了存在于小肠上皮细胞等多种上皮细胞中，基因是蛋白调控的基因，己有研究表明，对转录蛋白基因即的启动具有活化作用。另外，凝胶迀移率变动分析和功能启动子研究发现基因序列上游的对激活基因的表达是至关重要的。表皮生长因子表皮生长因子，是一种能促进表皮细胞生长的人体内小分子蛋白，在基因水平上能够降低基因启动子的活性，其作用区域位于启动子的至的范围内，参与转录的过程。可能通过激活了蛋白激酶、蛋白激酶和有丝分裂原活化蛋白激酶信号转导途径，从而降低了蛋白与基因的亲和力而致蛋白合成的下降。等研宄己证实，通过应用的激活 吉林大学博士学位论文剂的抑制剂，可以使启动子的活性部分得到恢复。血清糖皮质激素激酶与哺乳动物雷帕奪素紀向基因（血清糖皮质激素激酶能够刺激的表达，该激酶通过哺乳动物雷帕霉素祀向基因这个转录调节酶对转运子进行调节从而促进的表达。实验研究证明，与对照组相比较，与的共同表达或者与的表达同样可增加憐内流。和调节的功能是重叠的，理论上位于的上游区，对转运子的功能可能是通过刺激而达到的，二者是互为作用，共同促进的表达的另外，对细胞的容积和很多激素都敏感，故至少是有几种激素通过途径调节转运子的功能继而影响的表达。泛素连接酶与受很多激素的调节，其信号转导机制研究的较少，目前能够查阅到的机制为激素对的转运的调节。泛素连接酶连接泛素和相应的蛋白，通过启动清除机制来启动蛋白的降解，决定了细胞膜上蛋白含量的变化。其作用是能够被和所拮抗，和通过磷酸化来执行其功能，能够刺激的表达，和其受体共同表达在肠细胞，故应用治疗的肠细胞，的表达增加、磷酸化上调，活性增加。激素水平的调控的活性受多种激素水平的调控：成纤维细胞生长因子、甲状旁腺激素、、降韩素、糖皮质激素、雌激素、胰岛素样生长因子等。成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子，是体内存在的一‘ 第章综述种重要的磷调节激素，被称为调憐因子。能够降低肾脏蛋白的表达，影响，生成。与家族其他个成员共同拥有一个由个氨基酸残基组成、序列高度保守的相对核区的过度表达可导致血憐酸盐过少，抑制了在刷状缘膜上的转运，从而抑制了肾脏经化酶和蛋白的表达。在骨细胞中产生，参与调节憐和维生素的代谢，对憐的调节受的干扰，因此在磷平衡中有重要的调控作用。。甲状旁腺激素甲状旁腺激素是甲状旁腺主细胞内首先合成的第一前身物质，成为前甲状旁腺激素原，含个氨基酸，以后这一前身物质在细胞内裂解为含个氨基酸的第二前身物质甲状旁腺激素原，后者进而在细胞内裂解为含个氨基酸残基组成的蛋白质，即，其主要作用祀器官是骨和肾，其次是小肠勸膜等。刺激骨细胞的活化，促进骨盐溶解，使血韩和血磷增高。作用于祀细胞膜，活化腺昔酸活化酶系统，增加胞质内及焦憐酸浓度，促进肾小管对韩的重吸收，抑制对碟的吸收，从而导致尿碟浓度的升高。同时还可以刺激，的形成，从而间接地促进小肠对丐、憐的吸收。并且的实验已经证明，非洲蟾餘卵细胞的正常生理条件下，是活性的抑制剂，这个调节作用可能是通过和或途径实现的。免疫检测和电生理两项研究均发现可能通过憐酸化过程或者某些修饰因素的作用导致该蛋白动力学改变或者灭活机制发生。为维生素的活化形式，对机体韩和磷吸收和代谢起着极其重要的作用，，对韩磷代谢作用的主要祀器官是小肠和骨。与小肠點膜细胞特异的胞质受体结合后，进入细胞核，发挥其生 吉林大学博士学位论文理作用，一方面可直接作用于小肠刷状缘，改变膜磷脂的结构，增加憐脂酰胆碱和不饱和脂肪酸含量，增加两的通透性，同时隣的吸收也随之增加。另一方面可加快转录为、刺激基底膜腺苷环化酶的活化。而对于促进转运吸收的机制存在以下两种学说：一是基因调控学说，可能提高了动物肠道内与磷转运载体结合位点的数量，或是改变了载体蛋白的表达量并己有大鼠的实验研宄证明，磷酸钠协同转运蛋白表达增加，为，促进憐吸收的原因。二是非基因调控学说，认为可能通过憐转运过程中的动力学指标，如小肠细胞顶膜组成的变化、膜流动性的提高等，参与了肠道对体内环境中憐浓度的调节降韩素降丐素，是甲状腺细胞合成的由个氨基酸残基组成的多肽，可降低血液中韩、磷的浓度，抑制韩磷的吸收，是甲状旁腺激素的措抗物，从而通过甲状旁腺激素间接调控载体蛋白的表达量，继而影响体内拳丐、磷代谢。糖皮质激素糖皮质激素属于肾上腺皮质激素的一种，等己证实，糖皮质激素能抑制小鼠肠道中蛋白及其基因的表达，减少小肠的钠离子依赖的憐的重吸收，这种减少与蛋白表达下调呈正相关。雌激素雌激素可以调节丐离子、骨密度以及的代谢，它激活大鼠肠道和蛋白的表达水平，提高肠道转运效率。并且实验研究显示，雌激素治疗组小肠组织刷状缘的钠离子依赖的隣的重吸收增加了和分别提的表达量和 第章综述在小肠刷状缘表达量增加。而且相关的体外实验亦提示小肠中的有大幅度的增加约为，这种效应是可以通过其抑制其转录而终止的。张越等在转染了启动子的细胞中显示启动子对雌激素是敏感的，故雌激素很可能是通过对基因转录的激活继而影响体内憐代谢。体液酸碱度的调控值机体的体液是存在酸碱度的，并维持在一个稳定的水平。正常状态下，机体有一套调节酸碱平衡的机制，其中最主要的就是有酸碱平衡对的存在。和就是其中一种缓冲对。有研宄表明，当代谢性酸中毒发生时，能够刺激钠离子依赖型的磷酸盐的吸收和在小肠的表达，继而发挥其补偿代酸的作用。研究发现代谢性酸中毒可导致肠基底膜蛋白的大量增加，进而导致小肠内磷的吸收增加。蛋白表达的增加，通常在代谢性酸中毒天后幵始，分析结果显示此时钠离子依赖的憐吸收增加了倍，随着时间的延长，憐酸钠转运子的高表达逐渐出现变化，大多数实验动物的这种高表达状态己经结束。 第章家系旳遗传特征、临床特点第章家系的遗传特征、临床特点肺泡微石症是一种罕见的缓慢进展的肺部疾病。特征是中下肺野肺泡内出现广泛球形韩化灶憐酸韩盐或称为微结石的聚集。大多数病人在诊断时是无症状的，通常是在常规体检过程中偶然发现疾病的存在，症状主要表现为反复的咳嗽或渐进性呼吸困难。疾病的发生可以是散发的也可以是家族性的，有大约为是家族性发病的，属于常染色体隐性遗传病。随着分子生物学技术的迅速发展，关于其病因的研究己经取得了显著进展，目前认为肺泡上皮内编码型磷酸钠协同转运蛋白的基因溶质转运蛋白家族成员突变引起富含憐酸韩的微结石在肺泡内形成和聚集，是本病发生的主要原因。属于溶质转运蛋白家族的成员之一，在人体内多种组织器官均有表达。对于维持体内无机磷的代谢平衡起着至关重要的作用。在各大洲均有发现，并无特别明显的地区或种族分布差异。截止到目前根据全球文献共报道不足例。相对来说，在欧洲更普遍一些其次是亚洲，大多数病例出现在土耳其、意大利、日本等国。在我国关于的病例报道非常少而且主要是临床特点和影像学变化的病例报道，缺乏基因方面的研究，因此对于中国肺泡微石症家系进行调查并开展致病基因的研究意义重大。在临床工作中，发现了中国吉林省松原市一个典型的肺泡微石症家系，该家系为近亲结婚家庭，共有代人，患病人人已去世，患者人为同胞兄弟姐妹，具有明显的家族聚集性和遗传稳定性，是研究致病基因理想的家系。家系病例调查本家系第一代为亲表兄妹近亲结婚，均健在，第二代直系子女人，男女，全部患病，死亡人，第三代人，未见发病家系图谱见图。据中华 吉林大学博士学位论文人民共和国《医疗机构管理条例》及《医疗机构管理条例实施细则》，在本研宄开始前将研究方案和可能存在的风险告知本研宄纳入成员，同时遵照年《医学遗传学与遗传服务伦理问题的建议国际准则》，与家系成员签署知情同意书后，对于家系成员进行详细的病史采集。同时全面询问了既往史、家系史、婚姻史、孕产史、个人史、用药及毒物接触史等各种可能的发病相关原因。并进行详细的体格检查，和辅助检查。具体临床资料如下：先证者：男，牧场工作。最近一次就诊于我院是在年，于年在家中去世。该患于年因咳嗽、气短症状就诊我院，行胸部检查，根据其特征性的胸部改变明确诊断为肺泡微石症，给予对症治疗后出院回家。此后患者反复出现咳嗽、气促症状，活动后明显，并呈进行性加重，期间曾因剧烈咳嗽出现过次自发性气胸，经胸腔闭式引流术后好转。岁开始吸烟，每日包，一生未戒烟。年就诊时查体：心率次分，血压口唇发甜，双侧颈静脉怒张，右上肺叩诊呈鼓音，听诊双下肺可闻及爆裂音。心电图提示：心电轴右偏，右心房肥大，右心室肥大。胸部两肺内散在小结节状及斑片状高密度影，值约，以双侧背侧肺野为著，左侧胸腔见弧形气体样密度影。两肺上叶肺尖部见囊状透光区。肺功能提示：常规通气功能以中度限制型改变为主，弥散功能重度障碍。肝功、肾功、血糖、离子均未见异常。动脉血气分析提示型呼吸衰竭，指脉氧。入院后给予吸氧、抗感染、静脉用糖皮质激素治疗。患者病情略有好转后出院。先证者父亲：男，岁，指脉氧无咳嗽、气促症状，胸部线检查正常。先证者母亲：女，岁，指脉氧无临床症状，胸部线检查正常。先证者姐姐，女，岁，患者。于年前行胸部线检查，发现双肺弥漫性分布细砂样小结节影，因当时无任何不适症状，故未在意、也未行进一步检查明确肺部病变性质。无吸烟史。年患者开始出现呼吸困难 第章家系的遗传特征、临床特点症状，就诊于我院，根据家族史及典型的影像学改变确诊为肺泡微石症。此后患者呼吸困难症状进行性加重，伴有反复发作的刺激性咳嗽，出院时嘱患者口服拨尼松片每日一次，但由于对于症状的改善缺乏疗效，年后患者自行停药。年月患者因合并肺部感染致呼吸困难明显加重就诊于我院，检查提示双肺可见散在大片状高密度影，以双下肺为著，脏层胸膜广泛韩化呈细线状白描征）（图。心脏彩超提示：右心增大，三尖瓣重度返流，肺动脉高压中重度。肺功能提示：常规通气功能以中度限制型改变为主，弥散功能重度障碍。血气分析提示型呼吸衰竭，指脉氧。肝、胆、胰、脾、肾彩超及肝功、肾功、血糖、离子均未见异常。期间行引导下经皮肺穿剌活检，病理改变见图。入院后给予积极的抗感染、抗炎、呼吸机辅助通气及对症支持治疗，病情好转出院。于年底在家中去世。丈夫：男，岁，与无血缘关系，为正常人。女儿：女，岁，无临床症状，胸部线检查正常。先证者哥哥：男，岁，患者。与—起在年前行胸部线检查，发现双肺弥漫性分布细砂样小结节影，因当时无任何自觉症状，故同样未行进一步检查明确肺部病变性质。无吸烟史。无咳嗽，日常活动无呼吸困难症状。查体：口唇无紫甜、双侧颈静脉无怒张，听诊双下肺可闻及爆裂音。心率次分，血压。指脉氧。胸部线片提示双肺浸润性的细砂样小结节影，弥漫性分布，边界清晰锐利，形态不规则，部分融合成片，呈“沙尘暴”样改变。肺功能提示：常规通气功能以中度限制型改变为主，弥散功能中度障碍。心电图正常。肝、胆、胰、脾、肾彩超及肝功、肾功、血糖、离子均未见异常。儿子：男，岁，无临床症状，胸部线检查正常。先证者弟弟：男，岁，患者。年行胸部线检查，发现双肺弥漫性分布细砂样小结节影，无明显自觉症状，未行诊治。吸烟史年，每周包。无咳嗽、气促症状，日常体力劳动不受影响。查体：口唇无紫组、 吉林大学博士学位论文双侧颈静脉无怒张，听诊双下肺可闻及爆裂音。心率次分，血压。指脉氧。检查提示：双肺可见弥漫性分布大片状高密度影，以双侧背侧肺野为著，背侧胸膜下融合成火焰状火焰征图。肺功能提示：常规通气功能以轻度限制型改变为主，弥散功能轻度障碍。心电图正常。肝、胆、胰、脾、肾彩超及肝功、肾功、血糖、离子均未见异常。女儿：女，岁，无临床症状，胸部线检查正常。：‘‘‘“□□键教女技老穷枝楚本女往子本钱图家系图谱图患者胸部双肺可见小结节状及斑片状高密度影，以双下肺为著，脏层胸膜广泛转化呈细线状 第章家系的遗传特征、临床特点纖圓图患者引导下经围患者胸部双肺可见皮肺穿剌活检病理结果，正常肺泡组弥漫性分布大片状高密度影，以双侧织已受到明显的破坏，可见较多微结背野为著，背侧胸膜下融合成火石箭头幽临床特点讨论肺泡微石症是一种罕见的缓慢进展的肺部疾病。于年首次将其命名为〖。本病的特征是中下肺野肺泡内出现广泛球形化灶磷酸盐或称为微结石的聚集。该家系为近亲婚配家庭，根据发病特点，符合常染色体隐性遗传病规律，后续测序结果也支持这一遗传特点。的发病年龄从早产儿到老人均有病例报道，呈缓慢的发展过程，大多数病人在出现呼吸功能不全之前可没有任何自觉症状的持续很多年只是由于因其他原因行胸部放射线检査时偶然发现肺部病变而被诊断的。在有症状的病例中，紫组和刺激性咳嗽一般为首发症状，其他常见的症状是劳力性呼吸困难，并伴有乏力、胸痛及略血等，但均无明显的特异性，也有部分患者合并有气胸。肺泡内微结石的直接刺激可以诱发支气管树及肺实质中的无髓纤维释放速激肽，具有较强的致炎作用并可激活其他受体引起咳嗽在缓慢进展的病程中，微结石可能在儿童时期即开始形成，而临床症状的出现则是在很久以后。疾病早期因肺泡结构未被破坏，肺功能正常，故无症状《随着病情的逐渐进展，微结石占据的大量的 吉林大学博士学位论文肺泡并使肺组织变硬、失去弹性，引起肺限制性通气功能障碍、通气灌注比例失调，最终导致低氧血症、肺动脉高压及肺心病的出现。该家系的临床过程与上述描述类似，主要是在行常规胸部线检查时发现存在诊断时年龄在岁，除先证者是因为合并气胸就诊外，其余患者在诊断时均无自觉症状。由于起病隐匿。进展缓慢，故人具体发病年龄无从知晓。随着病程的进展，部分患者开始出现反复的咳嗽、气促、劳力性呼吸困难等症状。名患者中先证者和其弟弟均有吸烟史，但的吸烟量大每日包，长达年，他的病情进展最快，症状最严重，两侧肺尖部有肺大泡存在，病程中出现过次自发性气胸，肺动脉高压和肺心病出现早，并逐渐进展为呼吸衰竭，提示吸烟在加速疾病进展方面有重要的作用。的一个重要特征是影像学改变十分明显且典型，且与临床症状不相称。典型的胸部线片表现是双肺浸润性的细砂样小结节影，弥漫性分布，边界清晰锐利，形态不规则，部分融合成片，呈“沙尘暴”样改变，病变以中下肺野为主，肺尖区域通常很少受累。在疾病的进展过程中，细砂样小结节逐渐由稀疏变密集，密度逐渐增高，范围由下向上、自内而外增大】，小结节密集沉积的部位形成肺销化样实变。密集的韩化影往往使心影、膈肌的轮廓消失。上最常见的的表现是双肺呈弥漫性、对称分布的结节影及胸膜下线样妈化，以中下肺野、周边部和纵膈旁为著，病变主要沿小叶间隔、支气管血管束和胸膜下走行，边界清楚转化非常密集使肺呈白色，每个小叶被细腻密实的轮廓包裹，给人的整体印象是石质一样的肺。胸膜下线样妈化的出现主要是由于胸膜表面的次级肺小叶的肺泡内齊盐沉积所致【丨，纵隔窗显示双肺内可见散在点状、条状软组织密度影，部分病灶药化，在背侧胸膜、纵隔胸膜下聚集呈线样白描征，图和或融合成火焰状火焰征，图。其他的表现还包括肺野内结节影、胸膜下结节、小叶间隔化增厚、肺尖部的肺大泡及碎石路征’碎石路征为在磨玻璃影背景上重叠有增厚的小叶间隔和小叶内线，类似不规则的碎石路。碎石路征区常与较正常的肺区分界清楚，呈地图样轮廓，其病理学 第章家系的遗传特征、临床特点基础是微结石在肺泡内的沉积，增厚的小叶间隔则是由于水肿和明显扩张的淋巴管所造成。由于肺泡内充满了大量的微结石，以及肺泡间隔的纤维化和增厚，使肺弥散功能明显下降，以致流经这部分肺泡的静脉血未经充分动脉化便掺杂入动脉血内。肺功能改变是以限制性通气功能障碍和弥散功能障碍为主，动脉血气分析提示静息状态下存在低氧血症或型呼吸衰竭，活动后恶化。该家系名患者血韩、憐浓度、肝功、肾功的检查均正常。诊断依据一般是根据上述典型的影像学变化即两肺弥漫分布的致密的细砂样丐化小结节，以下肺为著。其他诊断标准还包括：症状与影像学相分离，即影像学变化程度明显重于临床表现；肺组织病理学检查发现肺泡内有同心层状丐化小体形成，呈圆形或卵圆形，其周围可见新月形光环，类似“洋葱皮”样外观，，微结石直径约。对于家系中已有其他人诊断为时，往往根据影像学资料即可明确诊断。目前，并无有效的治疗手段可以阻止的发展。本病进展缓慢，可长期保持稳定，无自觉症状，但病情的逐渐进展，肺泡内微结石长期慢性的形成占据了大量的肺泡并使肺组织变硬、失去弹性，引起间质性炎症、纤维化，导致肺容积减小进而发展为肺动脉高压和肺心病。本病的基础治疗主要是避免着凉、戒烟、预防呼吸道感染。家庭氧疗对于出现呼吸功能不全的病人是非常重要的。患者在出现呼吸困难症状后曾口服拨尼松片治疗，但由于缺乏疗效，最终停止用药，提示糖皮质激素在治疗中是无效的，％。在患者中，是憐酸韩沉积在肺实质内，不会被支气管肺泡灌洗所清除，因此全肺灌洗并不像治疗肺泡蛋白沉积症—样对患者有效。唯一有效的治疗办法就是肺移植。肺移植对于出现严重呼吸衰竭和右心功能不全并依靠氧疗的病人是非常有益的。接受了肺移植后的患者右心射血分数增加，增大的右心室也逐渐缩小。国外报道了例患者成功行双肺序贯移植手术，例为岁中年患者合并有右心功能哀竭，术后天死亡。另例为岁患者，术 吉林大学博士学位论文前有低氧血症伴轻度的限制性通气功能障碍，右心室增大但心功能正常，术后肺功能恢复正常，血氧饱和度上升至，右心增大亦逐渐缓解，随访个月未见复发因此提示，为了获得最好的治疗效果，最佳的治疗时机应该是在出现严重的右心功能衰竭之前。但本家系的患者由于经济条件有限，无法行肺移植手术。 第章家系致病基因的研究第章家系致病基因的研究等人在一项对随机的名患者和一个近亲结婚患病家系的研究中，利用连锁分析，将致病基因定位于，利用优势对数计分法法评估连锁分析的结果，值达到，在此区域由于编码憐酸盐转运蛋白且在肺内高效表达，被认为是致病基因。等人利用基因芯片全基因组扫描的方法，在个患者中发现了种不同的基因纯合突变，其中人为同胞，其余人间无任何血缘关系，有个病人的父母为近亲结婚。有个病人被发现属于移码突变，另外个病人属于剪切位点突变引起拼接失败，导致蛋白质翻译过早终止。基因突变引起有缺陷的蛋白产生或者基因不表达，导致型磷酸钠协同转运蛋白功能失活，，，使型肺泡上皮细胞不能从肺泡腔内清理掉碟离子，导致细胞外液中憐酸韩微结石的形成被认为是发生的主要原因。本实验首先排查已知致病基因是否突变，针对基因全部外显子设计引物，通过克隆和基因测序进行判定和蹄查，查看该家系是否存在表型基因型共分离突变，并与以往中英文献报道的突变位点相比较，发现是否为新的突变位点，如果有突变位点的存在，再构建基因的真核表达载体，并转染肺泡上皮细胞，验证该突变位点是否引起该基因编码蛋白质的功能发生变化。如果不是该基因突变致病，则使用芯片进行全基因组扫描，寻找新致病基因，并进行动物模型构建和功能验证等。 吉林大学博士学位论文第部分家系的提取和突变位点的蹄查材料与方法研宄对象经受试者的同意，对该家系所能联系到的位家庭成员在严格无菌操作下采外周血，抗凝，采用家系编号标记血样，于°冰箱保存。另选取例体检健康的无关正常人外周血作为对照。主要实验仪器聚合酶链反应仪（仪）（北京东胜创新生物科技公司）低温超速离心机（美国）台式高速离心机（上海跃进仪器厂）海尔实验室冰箱，青岛海尔集团）水平电泳仪（天津因赛科技发展有限公司）凝胶电泳成像分析系统（天津因赛科技发展有限公司）超净工作台（苏州净化设备有限公司）恒温水浴箱（武汉格莱莫检测设备有限公司）电子恒温培养箱（上海跃进仪器厂）移液器（…，美国）超微量紫外分光光度计北京凯幕生物技术有限公司）高压蒸汽消毒器（，日本）主要实验试剂‘基因组提取试剂盒，德国）引物（上海生工生物工程公司合成）聚合酶：大连宝生物工程 第章家系致病基因的研究公司）超纯琼脂糖粉（大连宝生物工程公司）大连宝生物工程公司）凝胶回收试剂盒（大连宝生物工程公司）溴化乙徒美国）缓冲液：、、硼酸溶解于双蒸水中定容至缓冲液：的实验步骤标本基因组的提取及纯度测定应用提取试剂盒，具体操作流程如下：取受试标本的抗凝血加入的离心管中，加入的蛋白酶用液补足至加入的缓冲液充分震荡°水浴■化加入的（的酒精，充分混勾；转移步骤中的所有混合液至离心柱，柱子放在的收集管上，离心分钟。弃收集管液；将离心柱放在一个新的收集管上，加缓冲液，离心分钟。弃收集管液；将离心柱放在一个新的收集管上，加缓冲液离心分钟。弃收集管液；将离心柱放在一个新的离心管上，吸的缓冲液在吸附膜上，室温放置分钟，离心分钟，将溶液收集到离心管中备用。’纯度测定：取提取加入蒸馆水到比色杯中。蒸馆水作为空白，在、和处调零。加入稀释液。使用紫 吉林大学博士学位论文外分光光度仪，分别在、和三个波段测定提取样品的值并记录。浓度（稀释倍数。引物设计基因位于号常染色体的短臂上，在人体位于有个外显子，第个为非编码外显子，其余为编码外显子，针对所有编码外显子设计引物进行扩增。引物序列见表扩增片段包括外显子及’和’两侧的部分内含子序列。表基因外显子引物序列外显子引物序列’’扩增片段长度丁丁 第章家系致病基因的研究扩增反应体系基因组上游引物沖下游引物总体积补足）反应条件°预变性°变性，°退火，°延伸，共个循环；最后°延伸。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶配制取的电泳缓冲液于锥形烧瓶中，加蒸馆水至，用天平称量琼脂糖，微波炉加热至琼脂糖完全溶解，冷却至，加入溴化乙淀，轻轻混匀，倒入电泳槽模具中，插入加样梳，冷却备用。电泳在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，取？产物，加入电泳加样孔，加入恒压电泳约分钟。将电泳后凝胶水平放置在凝胶分析仪上，打开紫外光源，观察并拍照记录，确定电泳条带与设计的是否一致。产物的回收及纯化应用大连宝生物工程公司的凝胶回收试剂盒，具体操作流程如下： 吉林大学博士学位论文将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外灯台上，切取含有目的片段的凝胶，置于离心管中，称重。将凝胶在离心管内用枪头揭碎。加入等体积的溶液溶胶液，即凝胶加溶胶液，颠倒混勾。水浴分钟至凝胶充分溶化，期间需颠倒混匀次，加速溶解。凝胶彻底溶解后，加入到纯化柱内，室温放置分钟后，离心分钟，倒掉收集管中的液体。在纯化柱中加入溶液洗涤液，室温放置分钟。，离心分钟，洗去杂质，倒掉收集管中的液体。再加入溶液洗漆液，，离心分钟，进一步洗去杂质，倒掉收集管中的液体。离心分钟，充分除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。将纯化柱置于干净的离心管上，取的溶液洗脱液至管内柱面上，使液体被纯化柱吸收，室温放置分钟。离心分钟，即得纯化的：保存备用。产物测序分析将扩增的全部外显子序列送北京华大基因公司进行测序。测序结果用阅读，在上进行比对。 第章家系致病基因的研究结果各样本于紫外分光光度计下分析样本浓度（表表各样本于紫外分光光度计下分析结果编号浓度（在进行扩增时，为获取理想的扩增片段，应介于。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图该家系位家庭成员的基因号外显子均扩增成功，经琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物与设计的目的基因片段大小一致，图为最终测序时发现存在纯合突变的号外显子的电泳图谱。 吉林大学博士学位论文一图基因号外显子琼脂糖凝胶电泳结果道为道为道为，道为道为，道为道为道为道为，道为正常对照。扩增产物测序分析结果对于该家系位家庭成员的基因全部个编码外显子均进行扩增测序，查找突变位点。分别在号外显子和号外显子发现了核苷酸改变。号外显子在名患者、和的号外显子均发现了纯合突变，从而使编码的氨基酸由苏氨酸突变为赖氨酸，属于氨基酸替换。、、、、测序结果均为杂合突变，和名正常人的测序结果均正常图。 第章家系致病基因的研究了八鍾舰了“了議 吉林大学博士学位论文■幼了八八：图基因号外显子扩增产物测序结果图号外显子在对于该家系全部家庭成员进行号外显子测序时发现了种核苷酸改变：一个是在全部家庭成员及一名健康受试者中均发现的〗纯合，在 第韋家系致病基因的研究的数据库中查到为图八：丁八 吉林大学博士学位论文八八，■？丁了敎‘个撒图基因号外思子扩增产物测序结果图 第章家系致病基因的研究另外一个核苷酸改变是在、、、、、发现的〉纯合突变，在、中为杂合突变，和正常人测序结果均正常。此突变使密码子由变为，但这两种密码子均编码甘氣酸，未发生氣基酸的变化图。、八八” 吉林大学博士学位论文八了，舰▲咖減图基因号外通子扩增产物瀾序结果图 第章家系致病基因的研究讨论已有的研宄结果表明，基因在人体中多种组织均有不同程度的表达，包括肺、小肠、乳腺、辜丸等，但主要是在肺和乳腺中表达，在肺内该基因仅在型肺泡上皮中表达。基因主要编码型磷酸钠协同转运蛋白，参与无机憐的代谢型肺泡上皮细胞产生的肺表面活性物质，其成份是二棕榈酰卵磷脂，降解的憐脂释放出的憐酸盐应该从肺泡内被清除。野生型型磷酸钠协同转运蛋白在有纳离子存在的情况下将钠与磷酸盐按的方式形成转运至细胞内，从而诱导产生内向的电流。基因突变可能会引起有缺陷的蛋白产生或者基因沉默，导致型憐酸钠协同转运蛋白功能失活，，使型肺泡上皮细胞不能从肺泡腔内清理掉憐离子，导致细胞外液中磷酸韩微结石的形成目前被认为是发生的主要原因。目前用于家族性遗传病致病基因研究的方法主要包括、、产物测序分析、连锁分析、基因芯片全基因组扫描等技术。聚合酶链式反应限制性片段长度多态性法用扩增目的，根据该特异性切入位点选择特异性限制性内切酶，将扩增产物消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的片段条带，通过比对这些条带发现目的片段基因序列的不同。目前国外对于基因的纯合突变形式的报道有很多种，很难选取特定的突变位点进行酶切蹄查家系点突变情况。聚合酶链式反应单链构象多态性法是将扩增后的片段经变性成单链单链其核苦酸顺序的不同在中性聚丙炼酷胺凝胶中电泳时可以产生不同的立体构象，直接影响泳动速率，产生不同的泳动带。但其影响因素较多，如凝胶的组成、电泳的温度、离子的浓度、突变的位置及勒序列的长度等，一般对长度不超过的待测片段的检出率只有容易出现假阴性或者假阳性结 吉林大学博士学位论文果，灵敏性和特异性均有较大局限，所以同样没有被采用。故本实验选用的对基因全部个编码外显子直接进行扩增测序，再与正常序列对比，检测序列是否存在碱基突变。为提高实验的准确度，达到理论上的准确，本研宄中，我们对于每个外显子均进行了正反向分别测序，只有在两个序列结果完全一致时，才认为是可靠的测序结果，保证了实验结果的准确度。本研究一共在个外显子上发现了处碱基改变。第个是在对号外显子扩增产物测序时在名患者中均发现了纯合突变，从而使编码的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸属于氨基酸替换。而在患者父母和子女的标本中该位点测序结果均为杂合突变，患者的配偶和名正常人的测序结果均正常，属于表型基因型共分离突变，也符合该家系的遗传特点，故认为是本家系致病的遗传学基础。第个碱基改变是在对号外显子扩增产物测序时在全部家庭成员患者及其父母、子女、配偶和一名健康受试者中均发现的纯合，在的数据库中检索到为。单核苷酸的多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的序列多态性，形成的遗传标记，是人类可遗传的变异中最常见的一种。其变异形式为转换和颠换。根据在基因中的位置，可分为编码区、基因周边以及基因间三种，后两种变异率较高。本研究中的发现属于目前的报道此的变异频率为，虽然其整体变异频率很低，但考虑到有典型的地域性差异，且本家系所有家庭成员及名健康受试者均有，并未表现出表型基因型共分离，故不认为与本家系发病有关。第个碱基改变同样发生在号外显子上，是在患者及其父母还有其中名子女的标本中发现的纯合突变，在另外名子女中为杂合突变，患者的配偶和正常人测序结果均正常。对于此突变的分析：第一，〉使密码子由变为，但由 第章家系致病基因的研究于生物的遗传密码子存在简并现象，突变前后的密码子均编码甘氨酸，并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列和功能，属于同义突变；第二，根据对于本家系临床资料的收集，该突变在家系中的作用同样未表现出表型基因型共分离。故亦不认为与本家系发病有关。综上，发生在号外显子的纯合突变考虑是本家系的致病因素。目前对于亚洲人基因突变的报道是号和号外显子有突变，，本研宄首先在亚洲人家系中发现了号外显子出现碱基突变，且查阅到目前为止发表的所有关于突变研宄的中英文献，尚无此外显子碱基突变的报道 吉林大学博士学位论文第部分家系基因的功能研究本研宄的第一部分通过对本家系所有家庭成员的基因全部外显子产物测序，在名患者中均找到纯合突变（，并且在患者父母和子女的标本中存在该位点的杂合突变，既属于表型基因型共分离突变，同时也符合该家系的遗传特点。为进一步证实纯合突变引起了该基因的功能发生变化进而导致的发生。本研宄第二部分拟构建基因的真核表达载体，并转染人肺泡上皮细胞中，观察有突变的基因和正常基因在肺泡上皮中表达时，对细胞外液中韩、憐代谢的影响，从而推断家系基因的功能。第节基因的真核表达载体的构建材料和方法组织标本正常肺组织取自我院一肺大疱切除患者外科手术中肺组织取自本家系中患者在引导下经皮肺穿刺活检主要实验试剂质粒（上海天呈科技有限公司）大肠杆菌菌株（北京克劳宁生物科技有限公司）总提取试剂盒大连宝生物工程公司）逆转录试剂盒（大连宝生物工程公司）质粒小提试剂盒，北京天根生化科技有限公司）快速连接试剂盒（大连宝生物工程公司）引物（上海生工生物工程公司合成）聚合酶：大连宝生物工程公司） 第章家系致病基因的研究大连宝生物工程公司）凝胶回收试剂盒（大连宝生物工程公司）限制性内切酶和大连宝生物工程公司）溴化乙锭（，美国）超纯琼脂糖粉（大连宝生物工程公司）大连宝生物工程大连有限公司）主要实验溶液的配制缓冲液：的缓冲液：、、硼酸溶解于双蒸水中定容至去离子水中加入，搅拌均匀，°过夜，备用液体培养基：酵母浸提液，蛋白腺，氯化钠，混合后加去离子水，待充分溶解后加水定容至调节值至。闻压灭菌：°后备用。固体培养基：配制方法同液体培养基，在高压灭菌之前，加入琼脂粉，灭菌后，戴手套取出培养基，摇动三角瓶是琼脂充分混勾，待冷却至°左右时，加入摇匀后铺制平板，°避光保存。主要实验仪器梯度仪（公司，德国）低温超速离心机（，美国）台式高速离心机（上海跃进仪器厂）海尔实验室冰箱，青岛海尔集团）电泳仪（公司，美国）凝胶电泳成像分析系统（天津因赛科技发展有限公司）超净工作台（苏州净化设备有限公司） 吉林大学博士学位论文恒温水浴箱（武汉格莱莫检测设备有限公司）电子恒温培养箱（上海跃进仪器厂）移液器（，美国）超微量紫外分光光度计北京凯幕生物技术有限公司）高压蒸汽消毒器（，日本）组织研磨仪（德国）实验方法以下实验方法针对正常肺组织和肺组织分别进行）肺组织总的提取应用总提取试剂盒，具体操作流程如下：使用水处理过的镊子及剪刀，剪取约肺组织样本。将其放入无的离心管中，加入粒锆珠，用莱驰型研磨仪将组织研碎，加入，室温放置。°离心小心吸取上清液，移液到一个新的离心管，加入氯仿，盖紧离心管盖，强力震荡至溶液呈乳白状，无分相现象后，再室温放置。°离心小心吸取上清液，移液到一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混合均匀，再室温放置。°离心，弃上清，向沉淀中加入的乙醇。°离心，弃去乙醇，室温放置，干燥沉淀。向沉淀中加入水溶解沉淀，用紫外分光光度计在、波段测定提取样品的值，在之间适用于进行逆转录反应。逆转录合成取总以此为模板逆转录合成，反应体系及反应条件如下：总 第章家系致病基因的研究°后立即冰浴冷却；向上述反应体系中按顺序加入以下成分进行。，°，冰浴冷却。试验所用引物及载体构建根据收录的序列（—，设计两条引物，在上、下游引物的’端分别加入相应的限制性内切酶识别位点和保护性碱基，引物由北京华大基因公司合成并纯化，斜体字为内切酶识别序列，上游引物含内切酶识别位点和个保护性碱基；下游引物’，含酶切识别位点。目的基因片段大小为。下图为所构建的载体示意图图 吉林大学博士学位论文图重组质粒示意图其目的片段大小为，基因序列为： 第章家系致病基因的研究目的基因扩增的反应以逆转录的为模板，利用基因的上下游特异性引物进行扩增，具体反应体系及反应条件如下：上游引物明下游引物含氯化镁）雄总体积补足）°预变性°变性°退火，°延伸，共个循环；最后°延伸。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行成像分析，观察并拍照记录，确定电泳条带与设计的是否一致。扩增产物回收纯化用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，正常目的基因扩增条带大小应在紫外灯下切下含有目的基因的凝胶块，放入一洁净的小离心 吉林大学博士学位论文管中，按凝胶回收纯化试剂盒说明书所描述的方法对目的基因条带进行回收纯化。（具体步骤与第一部分相同）质粒载体丨（和产物的酶切分别以和双酶切产物和质粒载体酶切反应体系为：产物（总体积补足）…。酶切过夜后，回收并纯化酶切产物。连接反应将酶切后的基因片段与载体按快速连接试剂盒操作进行连接。连接反应体系：载体基因片段都。反应。大肠杆菌感受态细胞的培养和制备将大肠杆菌菌液接种在固体培养板上，°过夜培养；次日挑取单菌落接种于液体培养基中，°振荡过夜培养；将菌液转接到液体培养基中，°振荡培养小时至，此时细菌处于对数生长期；将菌液转移至预冷处理过的无菌离心管中，冰上放置，°离心，弃上清； 第章家系致病基因的研究向细菌沉淀中加入预冷处理过的溶液悬浮细菌，冰上放置°离心弃上清；向沉淀中加入预冷处理过的含有甘油的溶液悬浮细菌；将感受态细胞每装入个管中，保存。重组质粒的转化和筛选取上述连接反应体系加入感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴放置，°水浴放置，取出后立即冰浴，之后加入不含抗生素的液体培养基，放置于摇床上，振荡培养。取转化后的菌液用灭菌的涂布玻璃棒均匀涂布于含有氨节青霉素的平板固体培养基表面，°倒置平板培养过夜。次曰，用接种环挑取固体培养基表面的白色菌落，将阳性菌接种于液体培养基，°摇床振荡培养过夜。转化子的质粒提取按照质粒小提试剂盒提取挑取的转化子的质粒：平衡吸附柱：向吸附柱中加入平衡液吸附柱放于收集管中，离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；将过夜培养的菌液加入离心管，室温离心，收集菌液，用移液器尽量吸除上清；向离心管中加入已加入的溶液，用移液器彻底悬浮细菌沉淀；向离心管中加入溶液，上下翻转次，室温放置分钟；向离心管中加入溶液上下翻转次，充分混勾至出现白色絮状沉淀，室温放置分钟，室温离心收集上清转移至吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 吉林大学博士学位论文向吸附柱中加入已混合无水乙醇的漂洗液离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，此步骤重复操作次，室温放置将吸附柱置于干净的收集管中，向吸附膜中间部位滴加…洗脱液，室温放置，离心，此步骤重复操作次；将洗脱液全部转移至离心管中。重组质粒的酶切鉴定将提取出重组质粒用和双酶切，具体酶切反应体系为：重组质粒总体积补足）于水浴锅中°酶切过夜。取重组质粒体系，酶切后的反应液分别加上样缓冲液，用琼脂糖凝胶电泳检验酶切效果。目的基因测序经酶切鉴定含有目的基因的重组工程菌甘油保种，并送北京华大基因公司进行测序。结果基因的结果以正常人和患者肺组织中提取的总为模板，利用基因特异性引物进行反应扩增基因，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行成像分析。结果显示正常人和患者的基因扩增片段均在约左右的位置，与预期片段大小相符图。 第章家系致病基因的研究士；：正常肺组织患病肺组织二图基因扩增结果重组质粒的构建和鉴定将纯化的基因酶切后与质粒连接，转入到大肠杆菌感受态细胞中，在含有的平板琼脂培养基中培养，挑选白色阳性菌落后，利用质粒小提试剂盒提取质粒。；质粒长度为，在扩增基因时加入了的保护性碱基，长度为，重组质粒长度应为。被限制性内切酶和双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳产生个片段，大片段在约的位置出现，同；质粒酶切后大小一致为，小片段在约的位置出现，同产物酶切后大小一致为说明该基因片段已经成功连接在载体上图。（由于重组质粒为环状超螺旋结构，电泳时跑的较快，出现在同线性的位置。 吉林大学博士学位论文團酶切结果：正常肺组织重组质粒电泳结果：正常肺组织重组质粒双酶切后电泳结果：肺组织重组质粒电泳结果肺组织重组质粒双酶切后电泳结果⑴重组质粒核苷酸序列分析结果北京华大基因公司测序结果显示：正常质粒的测序结果与—中报道的标准基因序列完全一致同源性为质粒的测序结果与第一部分实验个外显子单独测序结果相比总体一致，存在纯合突变，以及：八和：；八改变。以上测序结果均无碱基错配或移码现象出现。 第章家系致病基因的研究第节基因转染人上皮细胞对无机磷代谢的影响材料和方法细胞株细胞由本实验室保存。主要实验试剂培养基公司，美国）胎牛血清公司，美国）胰蛋白酶消化液北京索莱宝科技有限公司）去内毒素质粒大提试剂盒，北京天根生化科技有限公司）脂质体公司，美国）大连宝生物工程公司）引物（上海生工生物工程公司）逆转录试剂盒（大连宝生物工程公司）聚合酶：大连宝生物工程公司）大连宝生物工程公司）凝胶回收试剂盒（大连宝生物工程公司）超纯琼脂糖粉（大连宝生物工程公司）突光定量试剂盒（大连宝生物工程公司）全培养基：培养基中加入胎牛血清及青霉素和链霉素主要实验仪器梯度仪（公司，德国）台式高速离心机（上海跃进仪器厂）超净工作台（苏州净化设备有限公司） 吉林大学博士学位论文恒温水浴箱（武汉格莱莫检测设备有限公司）全自动生化分析仪恒温细胞培养箱（，日本）超微量紫外分光光度计北京凯幕生物技术有限公司）实时定量仪（实验方法细胞培养及传代细胞的复苏：从液氮中取出细胞株冻存管，°水浴中迅速融化，离心，在超净台中用移液器吸取上清弃去，加入培养基吹打细胞，使细胞悬浮起来，移至装有培养基的培养皿中，轻轻摇晃，使细胞均勾分布，于°、中培养，小时后更换新培养基，随后一周更换培养基次，至细胞贴壁，进行传代；细胞的传代：预热培养皿、培养液、培养基、、胰蛋白酶消化液，培养皿用酒精灯灭菌，缓慢倒掉培养液，用冲洗，加入胰蛋白酶消化液，倒置显微镜观察细胞，消化好后弃去消化液加入新培养液，吹打已消化好的细胞成悬液，移至离心管中，离心，弃上清，力口入培养基，吹打细胞，将细胞悬液分装至个培养瓶中，加入适量培养基。细胞的计数：吸取滴细胞悬液至离心管中加入滴台紛蓝染色，区分活细胞和死细胞活细胞不会被染色。将细胞悬液吹打均匀，吸取悬液沿盖片边缘滴入。在显微镜低倍镜下计数四大格中没有被染色的细胞数目。原细胞悬液中细胞数四个大格字细胞数质粒提取取含质粒、正常）质粒和质粒的菌液分别接种于加的培养基中，过夜培养小时；按照去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒： 第章家系致病基因的研究平衡吸附柱：向吸附柱中加入平衡液吸附柱放于收集管中，离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；将过夜培养的菌液加入离心管，室温离心，收集菌液，用移液器尽量吸除上清，同时用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴；加入已加入的溶液，用移液器彻底悬浮细菌沉淀；加入溶液，上下翻转次，室温放置分钟；加入溶液上下翻转次，充分混勾至出现白色絮状沉淀，室温放置分钟，室温离心，将溶液全部倒入过滤器中，滤液收集在干净的收集管中；向滤液中加入异两醇混匀，倒入吸附柱中；离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入己混合无水乙醇的漂洗液；离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，此步骤重复操作次；向吸附柱中加入无水乙醇，离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，离心将吸附柱置于干净的收集管中，向吸附膜中间部位滴加洗脱液，室温放置，离心，此步骤重复操作次；将洗脱液全部转移至离心管中。脂质体介导的细胞瞬时转染本研究分为以下组：质粒对照组：进行空载体质粒转染的细胞正常对照组：利用正常基因连接的重组质粒转染的细胞组：利用患者的基因连接的重组质粒转染的细胞转染前准备取对数生长期细胞按的密度在孔培养板接种细胞，于°、中培养过夜，细胞要达到融合。 吉林大学博士学位论文转染液制备：在管中制备以下两种溶液为转染每孔细胞用量：液：无血清培养基吨质粒液：无血清培养基脂质体将液与液混合后轻轻摇匀，室温放置将孔板中待转染的细胞用无血清培养基冲洗两遍，加入无血清培养基；将混合好的质粒脂质体混合物逐滴加到三组细胞上，于°、中培养小时；小时后弃染液，更换含有血清的全培养基，于°、中继续培养；法提取将培养小时后的孔中培养液移至管中，加入，用移液器反复吸打，室温放置加入氯仿，用力振荡，室温放置低温离心，此时样品分为三层，在上层水相中；将上层水相转移至新的管中，加入异丙醇室温放置，低温离心弃去上清，用乙醇洗漆沉淀，低温离心弃去上清，室温放置，干燥沉淀，加入水，用移液器反复吹打几次，°放置使溶解。取加入水，用紫外分光光度计在、波段测定提取样品的值，应在之间。总浓度稀释倍数。逆转录合成取总，以此为模板逆转录合成，反应体系及反应条件如下：总都 第章家系致病基因的研究°后立即冰浴冷却；向上述反应体系中按顺序加入以下成分进行°冰浴冷却。护增以逆转录的为模板，利用基因的上下游特异性引物进行扩增，具体反应体系及反应条件如下：雄都上游引物邑下游引物含氯化镁）总体积补足）°预变性°变性，°退火，°延伸，共个循环；最后°延伸。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行成像分析，观察并拍照记录，确定电泳条带与目的条带大小是否一致。全自动生化分析仪检测培养液中无机磷浓度于成功转染小时以后，收集细胞培养上清，利用全自动生化分析仪检测其中无机憐浓度。目前釆用无机磷浓度检测的方法是憐钽蓝比色法，结果用±表示，并进行检验，统计结果均运用数据软件包进行统计学处理。 吉林大学博士学位论文结果重组质粒转染细胞的结果于重组质粒转染入细胞培养小时后提取的为模板，利用基因特异性引物进行反应扩增基因，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行成像分析。结果显示正常对照组、组基因扩增片段均在约左右的位置，与预期片段大小相符，质粒对照组因不含有基因，故无电泳条带出现。十二：：正常对照组丽组：质粒对照组图重组质粒转染细胞结果细胞培养上清中无机磷浓度的测定质粒对照组、正常对照组、组分别于质粒转染小时后，收集细胞培养上清，利用全自动生化分析仪检测其中无机憐浓度，结果见表。表三组细胞培养上清中无机碟浓度±质粒对照组正常对照组组无机隣浓度±土±正常对照组细胞上清中无机憐的浓度明显下降，分别与质粒对照组和组相比，差异均有显著性。组细胞上清中无机憐的浓度也 第章家系致病基因的研究略有下降，与质粒对照组相比，差异均有显著性。讨论基因的真核表达载体的构建本研宄从正常肺组织及肺组织中提取，经逆转录得到，构建了真核表达重组载体，并成功转染入人肺泡上皮细胞中，使正常肺组织和病变组织中基因均成功表达，通过进行表达产物对无机憐代谢影响的功能研宄，进一步证实了家系发病的遗传学基础。由于基因有个外显子，基因片段长，在对目的基因提取时选用的扩增的办法，即从肺组织中直接提取总，以其中的作为模板，采用逆转录得到，再进行扩增，从而获得目的基因。这样可有效去除内含子序列，保留完整的编码序列，利于下一步构建真核表达载体。质粒的’端带有巨细胞病毒强启动子，复制的起始部位带有启动子，可在哺乳动物细胞内使外源基因得以高效表达，同时具有的氨辛青霉素和新霉素抗性基因利于转化后阳性重组载体的筛选。本研究中我们选取了质粒上和两个酶切位点同时进行，在设计基因引物是将相应限制性内切酶识别序列连接在引物上，然后使用和限制性内切酶分别切割目的基因及质粒，是之产生粘性末端，在连接酶的作用下形成重组质粒。将重组质粒转化的大肠杆菌细胞在含有氨节青霉素的培养基上培养过夜，含有质粒的大肠杆菌感受态细胞因存在氨青霉素抗性基因，可成功存活进而被蹄选出来。为进一步鉴定质粒重组效果，裂解蹄选出的转化菌提取重组质粒，再次使用和限制性内切酶切割重组质粒。如果质粒重组成功，在进行电泳时将得到个片段，即⑴质粒片段和基因基因片段，如果不成功，贝 吉林大学博士学位论文只会得到质粒片段。如图所示酶切后进行电泳，得到了和两个片段，证实质粒重组成功。接下来将：正常质粒和质粒分别进行测序，以验证经扩增的基因序列的正确性，我们同样对于目的基因均进行了正反链共同测序，只有两个序列结果完全一致，才认为是可靠的测序结果，结果显示正常）质粒的测序结果与中报道的标准基因序列完全一致，质粒的测序结果与第一部分实验个外显子单独测序结果相比一致，存在纯合突变，以及和改变。通过以上实验，我们成功构建了重组表达载体，并经测序验证，基因序列准确，可以进行人肺泡上皮细胞转染，研究患者基因的功能，以明确其发病的遗传学基础。基因编码的型憐酸钠协同转运蛋白主要是在肺泡表面活性物质代谢过程中参与憐酸盐的转运，，，因此为研究基因的功能我们选取了可以模拟正常型肺泡上皮细胞分泌肺表面活性物质的人肺腺癌细胞系细胞，该细胞既具有肺癌恶性肿瘤细胞的特性，又具有肺泡型上皮细胞的特性和表型，常用于正常人肺泡型上皮细胞的发生、分化及其结构和功能的研究。阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的憐酸根通过静电作用将分子包裹入内，形成脂质体复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用以及直接渗透作用，将传递至细胞内部，形成包涵体，其中一部分能从包涵体内释放，进入细胞核内进行转录、表达。脂质体介导的真核细胞转染效率高、技术成熟，是目前应用最广泛的转染技术。本实验通过阳离子脂质体包裹重组表达载体转染入细胞进行表达，提取、对重组质粒进行鉴定图正常对照组和组均在左右 第章家系致病基因的研究的位置出现基因扩增片段，与预期片段大小相符，证实了重组表达载体在细胞中得到完整表达，可以进行下一步的功能研宄。基因转染人上皮细胞对无机磷代谢的影响于重组质粒成功转染小时后，分别收集质粒对照组、正常对照组、组的细胞培养上清，利用全自动生化分析仪测定其中无机憐的浓度。测定原理是采用磷银蓝比色法：无机磷与销酸鞍在酸性条件下生成黄色磷结杂多酸，然后用硫酸甲基氨基酸将黄色的憐销杂多酸还原成磷钼杂多蓝，通过测定此浅蓝色的吸光光度值计算被测样本无机憐的浓度。在对于患者肺泡内微结石的研究中，利用射线能量色散光谱提示微结石中磷与韩离子的比例为，与憐酸韩和轻基憐灰石中的比例一致证明了微结石的主要成分就是磷酸韩。基因主要编码型憐酸纳协同转运蛋白在体内参与无机憐的代谢，，〗。人体内无机憐代谢最重要的部位是肠道，肠道内无机憐的代谢主要依靠型碟酸钠协同转运蛋白。蛋白在小肠内呈节段性表达分布，在回肠刷状缘表达最为丰富，而在十二指肠和空肠则很少或几乎检测不到，。烟酰胺可抑制大鼠空肠刷状缘的表达，从而减少肠道对憐的吸收抗病毒药物憐甲酸在小肠上皮细胞与共同转运，竞争性抑制憐的吸收使血憐水平下降。在对大鼠胚胎的研究中发现，从胚胎的天开始就可以检测到的表达，并伴随胚胎的发育直至到成熟的肺，的表达逐渐增强。在肺内基因仅表达在型肺泡上皮中。型肺泡上皮细胞产生的肺表面活性物质，其成份是二棕榈酸卵憐脂，碟酸盐是憐脂的重要组成成分，降解的磷脂释放出的憐酸盐在有钠离子存在的情况可被型憐酸钠协同转运蛋白以的形式转运至细胞内。即肺泡中磷的代谢主要依靠功能正常的 吉林大学博士学位论文在第一部分实验研宄中，我们通过测序发现基因号外显子的纯合突变通过第二部分构建基因真核表达载体并成功转染细胞中表达，对于基因进行了功能验证。实验结果表明正常的基因重组质粒转染细胞中表达后，可有效转运细胞培养上清中的磷酸盐，使细胞上清中无机磷的浓度明显下降，分别与质粒对照组和组相比，差异均有显著性。利用患者肺组织构建的基因重组质粒在转染细胞中表达后，实验结果表明其尚具备一定的转运磷酸盐的生理功能，在利用全自动生化分析仪测定时，组细胞上清中无机磷的浓度有所降低，与质粒对照组相比较，差异具有显著性，但同正常对照组相比差异同样具有显著性，分析结果考虑为本家系的患者由于基因号外显子的纯合突变，使原来编码的苏氨酸变为赖氨酸，导致功能下降，使其正常的碟酸盐转运功能受损，因而不能完全的从肺泡腔内清理掉憐离子，使碟酸盐在肺泡内大量沉积，与丐离子结合形成磷酸韩微结石，但其功能尚未完全丧失，因而本家系患者幼年及青年时期并未出现症状，推测其当时肺泡腔内尚无微结石存在或由于微结石十分微小，肺泡及小叶间隔结构完整，气体交换不受影响，故肺功能正常，无临床症状，随着病情进展，憐酸妈的沉积越来越多，微结石的逐渐增大，整个肺泡腔被填满，微结石对于肺泡壁的压力引起了肺泡的损伤，肺泡内开始出现炎细胞浸润、肺泡壁增厚、间质纤维组织增生，引起了限制性通气功能障碍及弥散功能下降，导致了肺功能逐步恶化。目前，并无有效的治疗手段可以阻止的发展。本病进展缓慢，可长期保持稳定，无自觉症状，但病情的逐渐进展，微结石占据的大量的肺泡并使肺组织变硬、失去弹性，引起间质性炎症、纤维化，导致肺容积减小进而发展为肺动脉高压和肺心病。全身性糖皮质激素和支气管肺泡灌洗治疗均是无效的，。唯一有效的治疗办法就是肺移植。国外有病例报道接受肺移植后 第章家系致病基因的研究的患者，增大的右心室可縮小、右心功能也可在一定程度上得到纠正。对于引起的基因的确定使对于散发病例进行基因诊断提供了便利。同时通过基因检测的方法对于有患者的家庭中其他无症状家庭成员的早期诊断也提供了便利条件。根据的分子生物学理论目前的几种传统治疗方法是无效的。根据现有的理论有望发明基因治疗方法，由于这个基因主要编码必需的膜蛋白，类似于囊性纤维化跨膜调节基因的功能，因此囊性纤维化跨膜传导调节的治疗方法可能在将来被用于治疗患者。 结论该家系为一典型的常染色体隐性遗传肺泡微石症家系，隐匿起病，主要是在行常规胸部线检查时发现存在。根据基因测序研宄发现基因号外显子存在纯合突变，从而使编码的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸，属于表型基因型共分离突变，也符合该家系的遗传特点，故认为是本家系致病的遗传学基础。本研宄首先在亚洲人家系中发现了基因号外显子出现碱基突变。通过构建基因的真核表达载体，并转染人肺泡上皮细胞中，对基因的功能进行研宄发现由于号外显子纯合突变的发生，导致该家系患者体内由基因编码的蛋白功能下降，使其正常的憐酸盐转运功能受损，因而不能完全的从肺泡腔内清理掉憐离子，使磷酸盐在肺泡内大量沉积，与韩离子结合形成憐酸韩微结石，导致了疾病的发生。 参考文献参考文献，，，，，，，，，，，，，—，丁，，，； 吉林大学博士学位论文，，，，，，，，，，，，，，，，，；，，， 参考文献，，，，，，，，，，，，，，，， 吉林大学博士学位论文，，—，，—，，，，—，， 参考文献人，，，，，，，，，，，，，，，，，杨光钊，宓沛朝，李森华肺泡微石症的影像学表现及随访观察中华放射学 吉林大学博士学位论文杂志，，，，，，，周翠兰，黄夏，于楠等肺泡微石症两例报告并综合国内例分析中华结核和呼吸杂志，，，，— 参考文献，，—，，，，，，，，—，，，；，，，，，， 吉林大学博士学位论文，，，，，，，，，，，，，，，，；：，， 参考文献，，，，，，，，，，，，，，， 吉林大学博士学位论文，，，张越基因真核表达载体的构建及其转染人肺泡上皮细胞的实验研宄博士学位论文吉林；吉林大学，，卢圣栋主编现代分子生物学实验技术北京高等教育出版社，，， 攻读博士期间发表的学术论文及其成果攻读博士期间发表的学术论文及其成果发表文章 .? 1?致谢借此企丈完成之际，忠办感謝尊敌的导师马忠森教援对式学此上的丰勤敉海和严格要求。此论丈的顺利免成，也舍着导师的悉心培养和殷切教导，导师精湛的医术、高尚的医德及严谨的治学态灰让我终生灸益丨并将激场式在今后的工作中积权进取，勇子开拓！感谢吉林大学第二医光呼吸内科的所有老师铪予式的指导和帮助，在此向呼“及科全体老师及栌人员玫以最真挚的感谢和最真成的祝福！感谢各位专农在忙之中参加式的论丈评申和答辨，感谢各位专象提出的圭音意见！最后，感谢我的東人一直以東对式的关爰与支持！：：