遗传性痉挛性截瘫家系致病基因定位和基因突变的临床特点及遗传方式分析

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遗传性痙挛性截瘫家系致病基因定位和基因突变的临床特点及遗传方式分析柯新1梁永玲1刘奇迹2（1山东省威海市经济技术开发区医院骨科264205;2山东大学医学院遗传研宄所250012）【摘要】目的通过对山东省威海地区一个遗传性截瘫家系进行丫定位和基因突变的临床特点及遗传方式分析，确定该病的遗传类型及其发生机制。方法经家系调查及临床检查确定疾病类型；通过致病棊闵微卫星多态位点进行连锁分析。结果该家系的遗传性痉挛性截瘫常染色体显性遗传发现该家系屮患者在SPAST基因第15外显子存在一个14bp的缺失突变。结论遗传性痉挛性截瘫家系致病的突变为位于SPG4棊因第15外显子的一个14bp的缺失突变所致。【关键词】SPG4基因连锁分析突变分析临床特点遗传方式【屮图分类号】R74【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）20-0141-02家族遗传性截瘫是一种神经系统退行性变性疾病，是遗传性共济失调屮较多见的类型。我们在山东省威海市发现了一个人家系，所有患者呈典型的单纯性遗传性痉挛性截瘫症状。我们采用候选棊因分析方法对该家系进行了棊因定位和棊因突变分析。一、研究对象山东省威海地区发现Y—个遗传性截瘫大家系，健在的家系成员现有四代，核心成员23人，其屮患者4人。二、研究方法1.家系的临床调查：（1）家系调查：我们对家系屮所有能追溯到的成员进行直接的临床检查，并绘制家系的系谱图。（2>临床及体格检查：由当地医院相关科室临床医生对家系屮的成员进行病史采集和体格检查，并记录检查结果。（3> 辅助检查。1.家系成员的标本采集。根据知情同意原则，抽取家系中各成员的外周静脉血3〜5ml,加入0.2mlACD抗凝，充分混匀；提取各成员的基因组DNA。2.微卫星DNA多态位点的选择与引物合成。单纯型常染色体显性遗传性痉挛截瘫的最常见致病基因位点为SPAST,该基因在染色体上的位置为2p21-p24。3.候选基因SPAST基因的突变检测：4.1设计候选基因的引物。根据GeneBank数据库中提供的候选基因SPAST的基因组序列，利用PrimerPremier5.0软件设计。4.2PCR产物测序及测序结果分析。分别用上、下游引物对PCR扩增产物进行测序。4.3家系成员的突变检测。以家系中其余成员（113、115、118、1111、1114、1116、11110、11111、11112、IV1）的DNA为模板进行SPAST基因第15外显子的PCR扩增（373bp）、产物测序及结果分析。方法同上。三、结果1.家系调查与基本情况。该家系（图1）共冇四代，我们采集到11名家系成员（113、115、118、1110、1111、1114、1116、皿0、11111、11112、IV1）及1名配偶（1111）的血样，其中含有4名患者（113、118、1110、III1）的血样。将所采集的家系成员的外周静脉血提取基因组DNA,检测DNA纯度和浓度后放于-20°C冰箱保存。图1.山东地区发现的一个遗传性痉挛性截瘫家系2.家系的临床特征。家系中113、II10具奋遗传性痉挛性截瘫的典型症状；118则表现较轻微；III1刚到发病年龄，己经表现出明显的症状。家系中还有2名携带者（III6和IV1），尚无症状。3.家系的遗传特点。该家系中男女均有患病，女性患者多于男性。 1.基因型分析和计算LODScore值如图2:图2两STR位点与SPASTIN基因在染色体上的位置及SPASTIN的基因结构示意图5.1我们用扩增SPAST基因全部开放性阅读桐架序列以及外显子内含子剪切序列的引物对家系中先证者II10的DNA模板进行PCR扩增及正反向测序，并将测序结果与GenBank中SPAST(NM_000166)的基因序列进行比对，发现该家系中患者在SPAST基因第15外显子存在一个14bp的缺失突变(c.l630-1643delTACTCAGGAAGTGA)o5.2我们又以该家系成员的DNA为模板，扩增SPAST基因第15外显子及外显子内含子剪切序列并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段人小及亮度，随后利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分离突变条带并用银染法显示DNA条带。与sanger测序结果一致，我们运用冋样的方法未检测到该位点的突变，可以排除该突变为多态位点。6.人类基因突变数据库查询突变。经查询人类基因突变数据库(HGMD),证实SPAST基因第15外显子的(p.tyr544profsX28)突变为-新突变，国内外尚未见相关报道。四、讨论遗传性痉挛性截瘫是一类临床表型及遗传异质性均很复杂的神经退行性变性疾病，根据临床表现可以分为单纯型和复杂型两种类型。遗传性痉挛性截瘫具有高度的临床及遗传异质性，使之变得更为复杂，冋吋也给疾病的诊断带来了闲难。我们首先对该家系进行家系调查和临床分析，随后利用连锁分析、PCR和直接测序相结合的方法首先排除己知致病基因来寻找致病突变。连锁分析是定位疾病致病基因最常用的方法，连锁分析是利用连锁的原理研宄致病基因与参考位点(遗传标记)的关系。B前，多态性遗传标记一共有三代，其中微卫星DNA多态(STR＞标记位点具冇多态性高、信息量火、能够以PCR反应大规模扩增和DNA模板使用量较少等优点，所以己经成为很好的全基因扫 描的遗传标记位点。自1999年Hazan等兑隆SPG4基因以来，冇关该基因的研究越来越多。SPG4基因位于2p24-p21,该基因全长9.4kb,含有17个外显子，编码SPASTIN蛋白。我们通过连锁分析与sanger测序，发现该AD-HSP家系患者均存在一个位于SPG4基因第15外显子的14bp的杂合缺失突变c.l630-1643delTACTCAGGAAGTGA(p.tyr544profsX28)0该突变位于AAA盒内，故可能干扰了SPASTIN蛋白的结合或影响了ATP的水解。五、小结我们在山东地区发现了一个四代的常染色体显性遗传性痉挛性截瘫家系，现有4名成员发病，对该家系的先证者及其余成员进行了详细的临床及辅助检查。我们利用分子遗传学的方法为家系进行了基因诊断，寻找到导致家系致病的突变为位于SPG4基因第15外显子的一个14bp的缺失突变c.l630-1643delTACTCAGGAAGTGA(p.tyr544profsX28),接着我们又利用E.coli亚克隆技术进一步准确分离、鉴定了突变。这一新的致病突变的鉴定为家系患者下一步的遗传咨询和产前诊断奠定了基础，也是揭示疾病发病机制及进行治疗干预的关键。参考文献[1]HardingAE.CIassificaticationofthehereditaryataxiasandparaplegias.Lancet1983;1:1151-5.[2]DepienneC,StevaninG,BriceA.Hereditaryspasticparaplegias:anupdate.CurrOpinNeuro;2007;20:674-80.[3]StevaninG,RubergM,BriceA.Recentadvancesinthegeneticsofspasticparaplegias.CurrNeurolNeurosciRep2008;8:198-210.