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分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：20150635专业硕士学位论文狐源犬I型腺病毒感染狐狸的动物模型及荧光定量PCR检测方法的建立EstablishmentofAnimalmodelwithfoxsourcecanineadenovirustypeIandReal-timePCRfordetectioninfox作者姓名：赵辉学位类别：兽医硕士专业名称：兽医研究方向：动物传染病及其病原分子流行病学指导教师：闫喜军研究员所在学院：动物科学技术学院2017年6月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要犬I型腺病毒（CanineAdenovirusType1,CAV-1）能够引发犬类动物传染性肝炎、熊类和狐狸脑炎，在世界范围内大多数国家都有该病症发作的报道。该病毒致病性较强，感染宿主动物类别范围广，对特种经济毛皮动物危害极大，尤其是狐狸，病畜一旦发病，不易治愈，且感染该病的狐狸将会持续向外界排毒长达九个月，该病毒对外界抵抗能力较强，因此对犬I型腺病毒的研究则显得极其重要。为研究狐源犬I型腺病毒的致病性，采用透射电镜对该病毒进行鉴定，镜下可见病毒粒子结构完整、大小80nm左右；通过吸附法，采用犬肾细胞接毒，培养后发现细胞呈现典型葡萄串型聚集和变圆的细胞病变；犬I型腺病毒能够凝集鸡、人的“O”型血和豚鼠红细胞，通过不同pH值的PBS验证pH值对豚鼠红细胞的凝集效果，发现PBS的pH值为7.2时，豚鼠红细胞可发生更好的凝集。为了检验犬I型腺病毒感染动物致病性，使用犬I型腺病毒人工感染银黑狐，观察动物发病情况。通过设计相同攻毒剂量、不同稀释倍-4.63数的病毒原倍液的方法来确定犬I型腺病毒感染银黑狐半数致死量LD50为10/mL。犬I型腺病毒感染不同月龄的银黑狐，结果表明，随着银黑狐月龄的增加，机体的免疫机能对病毒的抵抗力逐渐增强，1个TCID50的F1301毒株对五月龄以上的银黑狐不能完全致死；从临床症状来看，银黑狐发病48小时内平均体温均会升高至39.7℃。厌食喜静，伴随有神经抽搐的症状；通过解剖发现发病动物的肝脏充血肿大、间质脆、呈现黄红色斑驳状相间，脾脏明显肿大、有出血点，肺脏有出血点；病理组织学检查发现肝细胞大多数都坏死。为了检测银黑狐体内CAV-1的含量，根据CAV-1独特的E3区设计引物，通过常规PCR方法扩增出CAV-1基因片段，与pEASY®BluntSimpleCloningKit载体相连接，转化到感受态细胞中，经过挑菌、摇菌等制备出标准质粒，并建立出相应的标准曲线。结果2显示，通过动力扩增曲线可见各个曲线彼此呈现较好的线性关系，相关系数R=1，表明该标准曲线线性很好；由动力扩增曲线与熔解曲线可见单一波峰，表明建立的曲线特异性较好；三次重复试验的变异系数（CV%）均不大于2%，表明该曲线重复性较好。通过建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测方法分别对临床样品进行检测，结果显示常规PCR检测方法检测结果的灵敏性要低于荧光定量检测方法所检测的结果。建立的荧光定量PCR检测方法可以有效快捷的对CAV-1病毒进行定量分析，为临床提供了便捷的检测方法。关键词：犬I型腺病毒，半数致死量，致病性，荧光定量检测方法I AbstractCanineAdenovirusTypeIcancausecanineanimalinfectioushepatitisbearandforencephalitis.Thisdiseasehasstrongpathogenic.Thediseasewhichhavebeenreportedinmostcountriesaroundtheworld.Thisdiseaseischaracterizedbystrongpathogenicity,infectingawiderangeofanimalsandthreateningfuranimalsseriouslylikefoxes.Oncethefoxesareinfectedbythediseasetheyarenoteasytobecuredandcontinuetoexpeltoxinuptoninemouths.Thisdiseasehasastrongabilitytoresisttheoutside.Therefore,researchonCAV-1isextremelyimportant.InordertoresearchforthepathogenicityofCanineAdenovirusTypeI,theviruswasidentifiedbyprojectionelectronmicroscopy.Wecanseethevirusparticlestructurecompletedaround80nmbyelectronmicroscope.Thenwecultivatecaninekidneycellswithcellcultureflaskbyadsorptionmethod.Wecanseethecellsappearatypicaltypeofcelllesionthataregrapebunchesgatheredandrounded.CaninetypeAdenoviruscanagglutinatechicken,humanO-typebloodandtheCanineAdenoviruscanagglutinateguineapig`sredbloodcells,soweverifieddifferentPHPBSonguineapigRBCaggregationeffect.TheresultiswhenPHvalueof7.2abetteraggregationcanoccur.InordertodetectthepathogenicofCanineAdenovirusType1.WeuseCanineAdenovirusType1artificiallyinfectsilverfoxandobserveincidenceofthe’animalsdisease.WedeterminedtheID50ofsilverfoxwhichinffectedCanineAdenovirusType-4.631Virusis10/mLbydesignedamethodthatusethesameattackdosebutdifferentdilutiontimesoftheoriginalvirustoattackthefox.WeusedCanineAdenovirusType1Virustoinfectthesilverfoxesofdifferentages.Theresultsshowedthatwiththesilverfoxesmonthsageincreasingtheimmunefunctionofthefoxesalsoenhanced.1TCID50doseofF1301strainscan`tmakesilverfoxeswhoseagearemorethan5monthscompletelydead.Fromtheclinicalsymptomsthesilverfoxes`averagebodytemperaturehasrisento39.7℃within48hoursofthe’onsetofillness,duringthistimetheyarequietanddonteatanythingandaccompaniedbythesymptomsofnervoustwitch.Itisdistinctlyseethelivercongestionswelling,interstitialbrittleandwithredandyellow,alternatingonthesurfarebyvivisection.Meanwhilewecanfindthespleenenlargementandsomehemorrhagicspotsonspleenandlungs.Mostoflivercellsarenecrosisbyobservethepathological.InordertodetectthecontendofCAV-1inSilverFox.WedesignedtheprimersaccordingtotheuniqueE3regionofCAV-1.TheCAV-1genefragmentwasamplifiedbyconventionalPCRmethodandLigatedWithpEASY®BluntSimpleCloningKitVector,theywereII transformedintocompetentcells.TheStandardwerepreparedbypickingbacteria,shakingthebacteriaandsoon,finallyweestablishedthecorrespondingstandardcurve.Theresultshowedthateachcurveappearsagoodlinearrelationshipwitheachotherthroughtheclimatic2amplificationcurve.ThecorrelationcoefficientR=1,itindictthatthestandardcurveislinearlygood.Asinglepeakcanbeseenfromthedynamicamplificationcurveandthemeltingcure.Itindictsthatabetterspecificityoftheestablishmentofthecurve.Thecoefficientofvariation(CV%)ofthethreerepeattestswasnomorethan2%.Thisindicatesthatthecurvewasreproducible.TheclinicalsamplesweredetectedbytheestablishedFluorescenceQuantitativePCRAssayandtheroutinePCRdetectionmethod.TheresultsshowedthatthesensitiveoftheroutinePCRdetectionmethodwaslowerthattheFluorescenceQuantitativePCRdetectionmethod.TheestablishedfluorescencedetectionmethodcanquantitativeanalyzeCAV-1viruseffectivelyandquickly.ItprovidesaconvenientmethodofdetectionCAV-1.Keywords:CanineAdenovirusType1,Halflethaldose,Pathogenicity,FluorescenceQuantitativePCRIII 目录摘要...................................................................IAbstract..................................................................II前言...................................................................1第一章文献综述............................................................21.1引言.................................................................21.2CAV-1流行病学........................................................21.3CAV-1生物学特性......................................................31.4临床症状与病理学变化.................................................61.5实验室诊断...........................................................71.6预防及治疗...........................................................81.7课题研究目的及意义...................................................8第二篇研究内容..........................................................10第一章狐源犬I型病毒鉴定及生物学特性.....................................101.1材料................................................................101.2方法................................................................111.3结果................................................................131.4讨论................................................................161.5小结................................................................16第二章狐源犬I型腺病毒感染银黑狐动物模型的建立...........................172.1材料................................................................172.2方法................................................................182.3结果................................................................202.4讨论................................................................292.5小结................................................................29第三章犬I型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立.............................313.1材料................................................................313.2方法................................................................313.3结果................................................................323.4讨论................................................................363.5小结................................................................37IV 全文总结..................................................................38参考文献..................................................................39作者简介..................................................................43致谢..................................................................44V 前言在目前已经了解的哺乳动物腺病毒中致病性最强的病毒是犬腺病毒，犬腺病毒在形态结构上是比较单一稳定的。犬腺病毒除了会引发犬类的发病，还能够感染貉子、熊、狼、狐狸等动物。作为哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种腺病毒属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。犬腺病毒有两个亚型，引起犬传染性肝炎和狐狸、熊脑炎病状的是I型腺病毒；犬类传染性喉气管炎和肠炎则是由Ⅱ型腺病毒引起的。[1]Green率先在美国的一个银黑狐养殖场中发现了狐狸脑炎，后续在波兰、法国、加拿大、荷兰、德国、挪威等国家均陆续有该病流行爆发的报道。我国于1988年在山东等地[2]区也爆发了这种疾病。1947年首次发现了犬传染性肝炎后，犬传染性肝炎病毒于1959年成功的分离并获得。鉴于在1984年我国首次分离并得到犬腺病毒病毒，由此验证了在[3]我国犬类动物中也有犬I型腺病毒的感染。可以导致哺乳动物发病的病毒有很多种，但是犬腺病毒却是其中致病性最强的病毒，而且犬I型腺病毒能够感染宿主动物非常广，涉及多种动物，常见的有犬类、经济毛皮动物狐狸、貉子等动物。由于犬腺病毒对外界抵抗力较强，所以诊治起来比较困难。犬腺病毒不论是通过自然接触宿主动物还是通过人工感染宿主动物的潜伏期都比较短，一旦感染，发病至死亡时间较短。该病的出现，导致我国的养殖犬业和毛皮经济动物的养殖带来了巨大的损失。到目前为止，犬腺病毒所引发的疾病仍然给养殖行业造成了巨大的亏损。以往研究中，没有系统的建立起犬I型腺病毒对于动物感染情况的表述，所以本篇文章采用人工感染银黑狐动物的方式来建立起犬I型腺病毒感染银黑狐的动物模型，这样为研究病毒的特性具有重要意义，同时建立起检测病毒的荧光定量检测方法，可以有效快速准确的检测犬I型腺病毒的存在，对于CAV-1的检测具有重要意义。1 第一章文献综述1.1引言腺病毒（Adenovirus,Ad），最起始是在一份牛结节性皮炎的病料所接种的鸡胚中分[1][2]离出来的，而人腺病毒是1953年由Rowe等科研人员从扁桃体的组织中分离出来的。腺病毒的血清型各异，而到目前为止，世界各国科研人员已经分离出超过100种的腺病毒[3][4]血清，腺病毒广泛存在于哺乳动物，腺病毒能够在两栖动物，鸟类及鱼类中，根据宿主的不同分为哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属，两属之间无交叉抗原。腺病毒能够增殖的宿主器官很多，通常在淋巴组织、咽、肠道、结膜等处繁殖，能够引起眼部上皮细胞、呼[5，6]吸道、消化道感染以及脑炎、胃肠炎、出血性膀胱炎、肝炎等症状。腺病毒科哺乳动物腺病毒属有很多成员，而犬腺病毒（CanineAdenovirus）是直属于其中的成员，同时也是腺病毒科中典型的成员，分为两型，犬I型腺病毒（CanineAdenovirusType1,CAV-1）为犬传染性肝炎病毒和犬Ⅱ型腺病毒（CanineAdenovirusType2,CAV-2）为犬传染性喉气管炎病毒，有很多科研专家认为，CAV-1的变异结果就是CAV-2型病毒[7]，虽然CAV-1与CAV-2在红细胞凝集、细胞感染范围、毒力等方面有所不同，但是CAV-2[8]的抗体不仅能够抵抗自身的攻击，还能够抵抗CAV-1强毒的攻击。犬腺病毒两型所引起的疾病也是不尽相同，其中犬I型腺病毒能够引起犬类动物急性败血性肝炎病状和熊、貉子、狐狸脑炎，而犬Ⅱ型腺病毒主要引起犬类动物传染性腹泻和传染性喉气管炎等症状。[9][10-14]CAV感染呈世界分布，在我国已有报道。犬I型腺病毒(CanineAdenovirusI)作为主要病原体是引起犬传染性肝炎的根本原因[15]。犬I型腺病毒由于可以感染多种宿主动物而分为不同种病毒，其中常见的是狐狸脑炎病毒(FEV)、犬传染性肝炎病毒(ICHV)和熊脑炎。犬腺病毒是双链DNA病毒，其感染宿主动物广泛，并且是感染哺乳动物最强的腺病毒。病毒感染范围广，世界多国已经有该病爆发的报道，已经引起了各国的高度重视。犬I型腺病毒所引起的疾病已经给世界范围内特种经济动物养殖业和犬类养殖业带来了巨大的危害。1.2CAV-1流行病学1.2.1宿主范围犬腺病毒除了能感染我们已知常见的犬类和狐狸外，还能感染臭鼬、山狗、狼、貉、黑熊和负鼠，感染的动物主要分为两种病症，其中表现肝炎症状的为犬、貉、臭鼬、山狗、[19，20，21]负鼠和狼，而主要表现为脑炎变化是狐狸和黑熊。目前已经有很多国家对该病的报道，貉子感染本病毒发生的症状和发病病理与犬类发病的情况大多相似。随着对犬腺病2 毒的不断探索，发现对犬腺病毒敏感的动物通过血清学调查还有刺猬、松鼠、马、兔子和[22][23]黑猩猩也是。1993年10月，李秦等又成功的从一群小型狮子犬中分离出一株犬腺病[24]毒。1994年Marinka等对我国四川保护地的大熊猫体内CAV抗体进行调查，发现大熊猫体内也存在抗体，说明大熊猫也是能够感染犬腺病毒。1.2.2传播模式本病传播的主要途径是经消化道感染，病毒能够通过多种渠道来污染病畜接触的环境、投喂的饲料以及其所接触的工具；作为传播该病的媒介为动物排泄的粪便、尿液、唾液、眼泪等分泌物，被感染动物通过接触病畜所产生病毒的媒介等而被感染。然而本病最危险的感染源却是康复后的动物和病畜，病畜尿液中的病毒可向外界排放长达六至九个月。不论是动物的品种、年龄和性别在一年中均能感染犬腺病毒，但是在其中有25%～40%[25]的刚断乳至周岁动物的死亡率和发病率最高。犬腺病毒对外界的抵抗力强(病毒于固体污染物上可存活半个月左右，而在温度较低的环境中，病毒能够存活九个多月)，所以环[26，27]境(如病畜生活的场地、用过的建筑物以及用具等)很容易导致长期污染，成犬多在冬季发病。1.2.3我国发病情况我国夏咸柱院士于1984年首次分离到犬传染性肝炎病毒，证明了CAV-1在我国犬类[28][19]动物中也有感染的事实。钟志宏等在1989年从狐狸发病病料中分离得到CAV-1，证实为狐狸脑炎。新疫区发病死亡率很高，大多死亡时间较快；老疫区死亡率较低，大多会[29]有隐性发病的可能，但基本不致死。我国狐狸脑炎临床发病率平均为16.3%。1.3CAV-1生物学特性1.3.1腺病毒分类腺病毒属于腺病毒科，腺病毒根据感染宿主动物不同分为哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽类腺病毒属(Aviadenovirus)。人腺病毒有47个血清型，分为A、B、[30]C、D、E、F六个种。1995年，国际病毒分类委员会的报告中指出，人、猴、鸡、牛、[31]绵羊、小鼠、鸭、鹅、犬、山羊、马共有111个血清型。哺乳动物腺病毒中致病性最强的一种病毒是犬腺病毒，犬腺病毒分为两个型，其中引起狐狸脑炎、熊脑炎和犬传染性肝炎的是犬I型腺病毒；犬Ⅱ型腺病毒能够引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。第一次描述出[32，33，34]犬的传染性肝炎症状的是Rubarth于1947年提出的。1959年Kapasenberg从患脑[35]炎的狐病料中分离获得第1株CAVUtrecht株是CAV-1。1962年Ditchfield等经过分离[36]并获得能够引起单一呼吸症状的一组犬腺病毒，并命名为TorontoA26/21株，TorontoA26/21株与Utrecht株在基因鉴定和分析他们的结构蛋白抗原的组成方面有很高的[37，38，相似性，但在对各动物红细胞的凝集性、感染不同细胞的程度不同又存在较大的差异39]，应用引起犬传染性喉气管炎免疫保护的动物也会产生对犬传染性肝炎免疫的保护抗体，而且经研究发现犬I型腺病毒也可以单纯的引发呼吸疾病，所以认为Ⅱ型病毒是I型3 [40]病毒经过变异而演化的一株病毒，Hamelin报道出CAV-2还能够引发传染性腹泻症状，[41]CAV感染呈世界分布。1.3.2犬腺病毒形态结构通过电子显微镜观看结果显示犬腺病毒的两个形态都具有腺病毒粒子的典型形态结构特征，均为裸露的双链DNA病毒，基因组的衣壳呈现出20面体结构，直径为80至100纳米，全长大小约为36kb。双链DNA、蛋白质以及外壳组成了该病毒的核心，外壳上由240个六邻体与15个五邻体组成了壳粒。[42]犬腺病毒CAV-1的基因组约为30.5kb，CAV-2约为31kb。基因组两端各有长100～150bp的末端反向重复序列(Invertedterminalrepeatssequence,ITRs)，在其左端ITRs3`端为长约300bp的包装信号，它们作为腺病毒复制包装所必需的顺式作用元件是必不可少的[43]。病毒的复制可以根据基因转录时间，将基因分为早期转录和后期转录两部分，早期基因可分为E1a、E1b、E2a、E2b、E3和E4，这六个基因负责编码病毒的调节蛋白；后期基因由L1～L5组成，负责编码病毒的结构蛋白。腺病毒的每个编码区在病毒增殖过程中分别会产生不同的作用。负责腺病毒病毒包装、其他蛋白翻译表达和基因组的复制所必需的是早期表达的E1区蛋白和E2区蛋白，但E1区与E2区早期表达的蛋白能很强的感染[44]细胞。腺病毒感染后转录和表达的第一个基因是E1区(E1A和E1B)，E1区对于调控腺[45，46]病毒复制、转录并激活其他病毒基因表达等方面起着重要作用。为病毒DNA的复制提供相应蛋白质则需要E2区（包括E2A和E2B）的参与。唯一能够允许外源基因介入的是E3区，E3区是病毒复制的非必需区。E4区的基因产物对于阻止宿主细胞生物合成、参与病毒DNA的复制、RNA剪切和晚期基因表达等功能有关，对于关闭宿主基因的表达则取决于E4区所编码的蛋白质，该区蛋白质负责调节其他区的转录，对于病毒的繁殖是[47]有利的。1.3.3犬腺病毒的理化性质双链DNA、单分子线状组成了犬腺病毒的基因组。双链DNA、单分子线状组成犬腺33病毒基因组的分子质量大小为20×10ku～25×10ku；而犬腺病毒的分子质量大小约为犬腺33[48]病毒基因组大小的7倍，为150×10ku～180×10ku。犬腺病毒对外界的抵抗力较强，在56℃30分钟后生存的病毒仍然具有感染性，犬腺病毒在室温环境下仍然有70～91天的感染性，37℃下能够存活一个月的时间；在温度较低的深秋和冬季的环境下该病毒可存活9个多月，病毒冻干后置于室温或贮存在-70℃冰[49]箱中可以保持6年仍具有感染外界和感染动物的能力。在室外可长期处于污染状态。紫外线照射CAV可以导致病毒活性降低，由于核衣壳不含脂质，所以胆酸盐、氯仿、乙醚[50]等脂溶剂是无法将犬腺病毒灭活的。对pH适应条件不是很严格，最适pH为6.0～8.5。[51]但在pH3.0～6.0也可以存活。酒精是不能够对犬腺病毒灭活的，犬腺病毒对胰酶和皂甙不敏感，大多数病毒在0.5%的酚溶液中是不能够存活的，但是犬腺病毒在其中也可以4 存活好几天，对0.2%福尔马林的抵抗性也较强，需要24小时才能被灭活，50℃150分钟，60℃3至5分钟可将其杀灭。对0.64mg/L的臭氧抵抗性也较强，在臭氧作用66小时后也只有轻微的灭活作用。目前公认对犬腺病毒灭活效果最好的是次氯酸和碘，氢氧化钠、甲醛和碘酚对犬腺病毒的灭活性也较好。1.3.4病毒抗原性特异性抗原组成了哺乳动物腺病毒粒子表面，外衣壳由240个六邻粒，12个五邻粒组成。五邻粒由基部和纤突组成，腺病毒的特异性抗原位于纤突的远端部分，亚群特异性抗原在纤突的基部。病毒与细胞结合的部位位于纤突顶端一个4nm直径的球形物，犬腺病毒两个血清型在凝集红细胞的差异点就和纤突结构有关，彼此使用的表面受体不尽相同[52]。由于腺病毒拥有不同血清型的抗原特异性，所以导致氨基酸保守区，多个重复序列不保守。位于六邻粒外表面的是血清特异性抗原，而内表面的则是特异性抗原。犬I型腺病毒与犬Ⅱ型腺病毒在血清学上既有相同之处又有差异之处。Ditchfield通过实验证明，犬I型腺病毒与犬Ⅱ型腺病毒通过血清能够抑制同源病毒的血凝作用，但是对异源病毒血凝作用的发生却是无能为力的。同源反应滴度比异源交叉反应滴度高的结果通[53]过中和试验和补体结合试验也能够得到很好地证明。1969年Swango使用能够抗犬I型腺病毒和犬Ⅱ型腺病毒的高免兔血清和高免小鼠腹水对CAV-1和CAV-2进行了更为仔细的血清学比较研究，通过实验结论得出CAV-1和CAV-2之间彼此互相有抗原关系，但不能明确彼此是否为相同的关系。CAV-1的六邻体抗血清能够与同源病毒和异源病毒发生反应，但CAV-2的六邻体抗血清却只能与同源病毒相互作用。共同抗原决定簇的多少决定了病毒中和同源或者异源病毒的能力。CAV-1的含量多，而CAV-2的含量则较少。1.3.5病毒致病性对于哺乳动物腺病毒感染性最强的病毒是犬腺病毒，特种经济动物接触犬腺病毒能够导致其发病，刚断乳的狐狸和刚断乳的犬是特别容易感染犬腺病毒的。CAV-1主要引起犬传染性肝炎，还可以感染感染狐、狼、山狗、熊、臭鼬和豚鼠等动物并且其导致发病，病毒在血管内皮细胞上增殖；犬支气管炎是由于感染CAV-2所导致的，病毒在呼吸道上皮细胞大量增殖；部分狗发生腹泻其中一部分原因也是由感染CAV-2导致，病毒侵染消化道上皮细胞并进行复制增殖。1.3.6组织培养性CAV-1在组织培养上增殖最明显的细胞系是MDCK细胞，也可以在狗的睾丸细胞、肺细胞、肝细胞以及脾细胞上生长增殖，貉子的肾细胞，猪、豚鼠、仓鼠、水貂等与狗亲缘关系相关的动物的原代细胞都能够为CAV-1的增殖提供细胞系。CAV-1感染细胞产生独特的细胞变化，长满的细胞由彼此紧密挨着的梭型逐渐分离变圆，变圆缩聚成葡萄串样(CPE)，感染的终期会脱离细胞壁。接毒感染的细胞核内会有不被打扰的包涵体。5 1.3.7血凝性作为腺病毒重要的一个指标是能够凝集红细胞悬液。不同的温度和pH值对红细胞悬液的凝集效果是不同的，在4℃和37℃，pH6.0～9.0，CAV-1和CAV-2都能很好的与人的“O”型红细胞和白化病大鼠的红细胞发生相互结合。CAV-1能够结合豚鼠的红细胞悬液，而不会凝集鸡、小鼠、鹅、鸽、鸭、牛、羊、猪等的红细胞，凝集的机理是位于病毒粒子球形体上的血凝素与特定红细胞表面的受体结合并发生反应后而产生的凝集效果。1.4临床症状与病理学变化1.4.1临床症状CAV-1能够导致狐狸发生传染性脑炎，其中幼畜最易被该病毒所感染。本病自然选择宿主感染2～10天，人工感染2～6天即可发病，临床上分为三个类型，急性、亚急性和慢性型。急性型，患病动物通常食欲不振，身体蜷缩一团，体温升高、呕吐、腹泻，通常2天左右就死亡；亚急性型，精神低沉、体温也会升高、血液粘稠。个别动物单眼或双眼发生角膜炎，典型的表现是病畜整个眼睛被一层淡蓝色膜所遮盖，即“蓝眼”。另外可见眼睛有大量分泌物。该症状不经过治疗也能够恢复。病毒若继续扩散、病症加剧则会导致病畜发生其他病症。发病动物不喜欢站立，习惯趴卧，站立不稳、走路摇晃、后肢虚弱无力。个别病畜会出现神经症状，出现肌肉抽搐。慢性型，病畜症状不明显，无食欲、个体消瘦、体温有短暂的升高、管理饲养得当病畜会痊愈，不致死亡。CAV-1能够导致犬肝炎的发生，从接触动物至动物发病期时间非常短，人工感染2～6天发病，断乳的动物最容易被犬腺病毒所侵染，死亡时间也比较短。患病初期怕冷，有水样鼻涕眼泪，体温最高可致42℃，并高温会持续4～6天。随着感染天数的增加，疾病则会越来越严重，从采食饮水正常至不采食，个别动物可见淡黄色呕吐物，通过粪便拭纸的[52]采集可见有便血症状。一般在感染后2～12天死亡，死亡率为25%～40%。犬I型腺病毒不仅对狗引起急性传染性肝炎外，还能够发生其他的临床症状，如呼吸道疾病、慢性肝损伤、慢性肾病、间质性肾炎、新生犬疾病、虹膜睫状体炎等，该病毒还能够侵染怀孕母[12，49，53，54]畜，导致其流产和早产。1.4.2病理变化CAV-1侵染病畜机体主要症状是各大组织器官均有败血症的变化。内脏器可见出血点，多见胸腔、肠道和脑中。最为明显的症状是肝脏肿胀质脆，实质呈黄褐色，并杂有多数暗红色斑点，多数呈现黄褐色与红色相间，个别动物肝脏多数呈现黄褐色。腹腔内有血水，胆囊壁水肿，肥厚，伴有出血点；肾肿大，充血，黏膜有出血处，本色区坏死；肠系膜淋巴结水肿，脾脏水肿，质脆；心脏血管凸起，肺实变，出血点漫衍在肺上，个体肺大面积出血。通过肉眼可见肝小叶中央坏死，呈非化脓性脑炎的特性病变。可在肝细胞等多个细胞[55]中检测到核内包涵体的存在。核内包涵体的形成是CAV-1重要的微观显现的特性，包6 涵体变现为圆形或者卵圆形，脾脏膨大的网状细胞可以发现包涵体，在肝坏死灶的四周可以发现有包涵体病变的肝细胞。肾小球膨大的内皮细胞核内有包涵体，在脑的各处小血管[49，56-59]内皮细胞核内有包涵体等。1.5实验室诊断因为CAV-1能够引发犬传染性肝炎和狐狸脑炎等疾病，除了肉眼可见发病动物“蓝眼”这种明显的病变外，其他的体温升高、厌食发冷、神经症状等不足以证明是由CAV-1引发的症状，这些只是可以作为初步诊断，最后的确诊还要有必要的病原学、血清学以及分子生物检测的方式进行确诊。1.5.1病原学检查可以取发病期病畜的粪便拭子、血液或者死亡动物肝脏、脑、肾脏、脾等病料进行充分磨匀，配置好悬液，离心取上清，接种于犬肾细胞（MDCK）中，待细胞出现CPE葡萄串型病变可以做出诊断。或者将细胞悬液用0.5%磷钨酸负染，通过电镜手段进行分析，也可做出判断。1.5.2血清学检查（1）少量补体联合实验：可以通过少量补体联合实验，使用豚鼠的抗CAV抗体和CAV-1侵染犬肝浸出液为抗原，采取少量补体联合实验的方法检测出动物的脏器中的病毒抗原。（2）微量血凝和血凝抑制试验：血凝和血凝抑实验能够对脏器悬液中的抗体进行检[60，62]测，还能够对病畜血液中的抗体进行验证。九零年，夏咸柱凭借CAV-1可以凝聚人的“O”型红细胞悬液，CAV-1的血清可以抑制这种凝聚作用，但CAV-2抗血清却可以增强这种凝聚作用，由此创设出了微量血凝和血凝抑制试验的实验办法。（3）中和试验：中和抗体大约于侵染一周后呈现，并可长久存在于血液中，是以中[62，63]和试验能够对动物感染情况的监测和疫苗接种效果的评价。（4）琼脂扩散试验：通过琼脂的扩散来检验出感染组织块中的特异性沉淀原、酶联免疫吸附试验及间接血凝也可用于本病的免疫力测定与抗体调查，免疫组化能够检验出病[64]理组织切片中的抗原。1.5.3荧光抗体检查利用不同抗原对CAV可以产生不同的荧光抗体，该方法能够检测肝、脾、肺等病理[65]组织切片、印片或组织悬液中的CAV抗原，从而检测出该病原，明确病毒在机体内的分布。1.5.4分子生物学诊断传统的手段检测CAV-1主要凭借病毒的分离、病理学以及血清学等方法，但这些方法费时、灵敏性、特异性差，无法做到及时确认。随着近年来犬腺病毒生物分子学研究日渐频繁，为CAV-1和CAV-2的辨别供给了分子生物研究的基石。将病毒的同源性进行对比，7 [66]可在其基因序列的E3区设计出能对所有腺病毒进行扩增的特异性引物，利用PCR扩增技术将腺病毒与从其他病毒中辨别开来。扈荣良在犬腺病毒复制期筛选出恰当的特异性引[68]物，扩增出的产物大小不同，从而能够区分开来。王雷设计不同的引物使得扩增出产物的强弱度大小不同。1.6预防及治疗对本病进行防控的根本方法是人工接种疫苗，最早使用的疫苗是通过病毒人工接种动物，动物死亡后将病死动物的脏器制作疫苗，然而该方法保护期短，只能维持10个月左右的时间，其后又培育出CAV-1弱毒苗，但这种弱毒苗可以使部分接种的动物发生“蓝眼”的表象，使得如今已经日渐使用为CAV-2弱毒疫苗。CAV-1与CAV-2彼此间有相互保护的作用，CAV-1疫苗不能完全保护CAV-2引发的病症，但是CAV-2疫苗却能够彻底免疫CAV-1所引起的疾病，而且还不会出现免疫动物“蓝眼”的症状，所以目前市场所用的保护动物免疫的是CAV-2弱毒疫苗。CAV-2弱毒苗的保护性非常好，而且产生能够免疫的抗原时间早。因为该病常与犬瘟热、细小等病毒性疾病一起爆发，因此在现实保护中，经常与犬瘟热、副流感、细小病毒性肠炎等弱毒株制成差异的弱毒疫苗配合使用。实验结果发[25]现，各个毒种之间并没有出现彼此滋扰的征象。紧急预防时，可应用高免血清。防治本病最好的方法就是定期给动物做健康免疫，由于本病感染的一个重要特点是病畜康复后仍可以向外排毒6～9个月，所以康复期的病畜一定要单独隔离饲养。经过疫苗免疫的母畜或者康复的母畜体内均有免疫CAV疾病的抗体，所以母畜通过哺乳的方式可以将自身母源抗体传递给仔兽，这样仔兽如果感染或者即将受到感染可以获得暂时性的被动免疫；动物场坚持自繁自衍，如果需要从外地或外场引进新的牲畜，一定做好隔离检疫，并做好本厂的环境卫生的安全，防止病毒的传入，加强饲养管理。1.7课题研究目的及意义犬腺病毒作为哺乳动物中侵染机体最强的病毒之一，犬I型腺病毒能够侵染的宿主动物十分多，涉及犬类、特种经济动物。该病抵御外界能力强，自然发病和人工攻毒感染后发病的时间都不是很长，从表现该病病症至病畜死亡时间较短，所以防治困难。犬腺病毒侵染病畜机体已经给我国的养殖业带来了巨大的损失。从发现犬腺病毒至得到犬腺病毒已经研究多年，各国国家科研人员都在致力于研究其发病机制，目前为止，该病的有效预防和治疗都是迫在眉睫。因为该病致病性强，对大多消毒剂都不敏感，所以为不感染该病毒最有效的方式就是提前接种，防护治理相联合。目前对犬腺病毒防护的疫苗产品较多，但均为CAV-2疫苗，CAV-2疫苗对CAV-1病毒有交叉保护的作用，但怎么评定其保护的效果，最有效的方法，便是在生产疫苗过程中，通过对接种实验动物进行人工强毒感染后的保护效果来判定疫苗的好坏。目前也没有明确的CAV-1强毒的标准，因此，采取人工侵染的方式来创建动物模型对于该病毒的研究具有重要意义。对该病毒采取人工侵染动物模型、判定及动物被侵染后的情况研究有利于未来对疫苗产品的品质进行鉴别，所以对犬腺8 病毒强毒标准的创建是迫在眉捷的，同时为校检强毒标准提供了参考和依据。同时，对该病毒的检测方法的创建也是迫在眉睫的，通过对GeneBank中公布的几株CAV-1毒株序列分析比对，针对犬I型腺病毒特有的E3区，设计特异性引物，对引物浓度、退火温度、扩增体系等条件进行优化，建立犬I型腺病毒荧光定量PCR检测方法。最后利用该方法，对感染得到的有差别的组织样品进行检测，为以后的犬I型腺病毒检测的研究提供了检测方法。9 第二篇研究内容第一章狐源犬I型腺病毒鉴定及生物学特性犬I型腺病毒在我国已经广泛存在，对犬、貉子、狐狸等毛皮经济动物均有一定的致病性，本实验采取传统的病毒扩增和鉴定的方法，对本实验室分离得到的毒种进行复增和采取电镜观察、常规PCR和分子生物方法鉴定CAV-1病毒，证明本实验室分离得到的病毒为一株纯的CAV-1型强毒，鉴定完毕后用于日后的实验使用。1.1材料1.1.1参考病毒与细胞犬I型腺病毒（CanineAdenovirusType1,CAV-1）F1301株，由特种经济动物疫病防7控实验室分离得到，效价为1×10TCID50/mL。MDCK传代细胞系（传至第二代），由特种经济动物疫病防控实验室保存。1.1.2实验主要试剂DMEM培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，购自gibco公司；病毒DNARNA提取试剂盒、pH7.4的PBS，Trans2KDNAMarker、RNasaA、ProteinaseK、琼脂糖Agarose购自北京全式金生物技术有限公司；阿氏液自行配制；1%猪红细胞悬液；0.45μm、0.22μm针头式过滤器，购自上海生工生物工程股份有限公司。1.1.3主要仪器本课题所用主要仪器及型号、厂家如表1-1所示。10 仪器名称型号厂家超净工作台SW-CJ-1F苏州安泰空气技术有限公司生物安全柜BSC-1300IIA2苏州安泰空气技术有限公司PCR仪070851Biometra公司小型离心机1-14EDSigma公司凝胶成像系统ImageQuant300GE公司恒温水浴锅DK-8D上海景宏实验设备有限公司高压蒸汽灭菌器HVE-50南昌天添有限公司低温离心机CF16RXIIHITACHI公司纯水仪RD0E06000Rephile公司电子天平YP202N上海精密科学仪器有限公司电泳仪EPS601北京六一仪器厂电热恒温培养箱500A龙山市先科仪器公司超高速离心机41665873ThermoFisherScientific公司病毒纯化柱R5BA63842Merck公司表1-1主要仪器及相关信息Table1-1Themajorinstrumentandrelevantinformation1.2方法1.2.1电镜观察将本实验室分离得到的CAV-1病毒接种MDCK细胞，37℃静置培养，待80%出现CPE（腺病毒典型的葡萄串状病变）后，进行冻融收毒，收毒后进行纯化，将细胞毒放于15mL离心管中，先12，000×g离心30min，离心后经0.22μm过滤，放于纯化柱中10，000×g离心15min，离心后置于纯化膜上的液体用移液枪反复冲洗，冲洗后将病毒吸出。配制25%的蔗糖溶液加2mL至超速离心管中，再将病毒液沿管壁距液面上1cm的位置缓慢加到蔗糖溶液上层，加病毒液时动作要缓慢，不能破坏蔗糖溶液和病毒液之间的分界面。加完病毒后用STE缓冲液配平各管，最终使液面加到距离管口上沿约2～3mm的位置的时候即可，小心盖上离心管的盖子。开启超速离心机，抽真空30min后放入病毒液，12，000×g离心2h。离心完成后，取出离心管小心倒掉上清液。然后用1mLSTE缓冲液小心的吹打两个离心管的底部，两管并一管。将悬浮好的病毒液加入1.5mL的EP管中，放置于冰上。制备好病毒后，进行电镜观察，首先取少量病毒液滴在铜网上，滤纸吸去多余病毒液，再在铜网上滴加2%磷钨酸，滤纸吸去多余染料，然后置于干燥箱里面，待干燥后置于电子显微镜下观11 察。1.2.2试纸条检测参考快灵生物一步法胶体金快速检测卡使用说明书。1.2.3单克隆抗体间接免疫荧光将培养好的MDCK细胞铺于96孔板或单层MDCK细胞，每孔100μL，24小时后接入CAV-1病毒，每孔50μL，37℃于温箱中作用2小时后，添加细胞液至200μL，待看见细胞病变后用固定液（丙酮：乙醇=3：2）固定，每孔100μL，固定后PBS反复洗，加入一抗（小鼠抗CAV），37℃作用1～2小时，PBS洗涤三次，加入二抗（山羊抗小鼠）和伊文思蓝（注意避光），伊文思蓝终浓度为1/500，37℃作用1小时后，用PBS洗涤三次，最后镜检。1.2.4PCR检测鉴定引物设计：根据GeneBank中发布的CAVI型和Ⅱ型序列，由于犬腺病毒E3区序列能够允许外来基因的插入，通过软件设计出其特异引物，分别鉴定CAV-1，2型(CAV-I/II-P1:5'-GGCATTACTACCTTGTCTATAT3'，P2:5'-TGGTGAACGGGAAGCTGT-3')及CAV-1强、弱毒株(CAV-1-V/A-P1:5'-AGCATGGCCAAAGCTGCAAT-3'，P2:5'-CATCTGGTGGCAGTTCTCAT3')。其中CAV-1，2型扩增出PCR产物的大小分别为[22]462bp和982bp。模板的提取：（1）取病毒接种MDCK细胞培养物的冻融上清液200μL样品置于1.5mL离心管中，向其中加20μLProteinaseK；（2）加入200μLBB5（包含5.6μgCarrierRNA），涡旋混合15秒；（3）56℃孵育15分钟；（4）加入250μL无水乙醇（此时有可能会出现絮状物沉淀），涡旋混合15秒，室温放置5分钟；（5）将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12，000×g离心1分钟，弃掉废液；（6）加入500μLWB5，12，000×g离心1分钟，弃掉流出液；（7）重复步骤6一次；（8）室温12，000×g空离1分钟，目的是彻底除掉残留的乙醇，在室温放置5分钟以便晾干离心柱；（9）将离心柱转入一个新的无菌灭活1.5mL的EP管中，并向离心柱中央加40μLRNase-freeWater，室温静止一分钟；（10）室温12，000×g离心1分钟，将DNA洗下来，将提取好的DNA置于-40℃中保存待用。PCR扩增反应体系：取上述模板1μL，2×EasyTaqPCRSuperMix25μL，上游引物、下游引物各1μL，补加超纯水至总体积50μL。PCR反应参数为：95℃预变性3min，95℃变性3min，51℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环，最后72℃再延伸10min，取5μLPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析扩增，并观察结果。1.2.5犬I型腺病毒F1301株生物学特性12 1.2.5.1复苏细胞将本实验室传代的MDCK细胞系从液氮罐中取出，放进提前升温到37℃的水浴锅中，待冻存细胞瓶内液体都融化后，放入小型离心机中，1000rpm离心10分钟，离心后，弃掉上清，用细胞培养液吹打细胞沉淀，混匀后加细胞培养液放入细胞培养瓶，放入37℃恒温温箱中培育。1.2.5.2犬I型腺病毒扩增培养将长满细胞培养瓶瓶底的MDCK细胞，用灭菌的PBS洗2次，然后细胞用胰酶消化下来，按一传三扩瓶培养，每瓶加入含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液30mL，待细胞长满后，弃掉细胞培养液，将由本实验室分离得到的CAV-1按比例每瓶分别加入500μL，加入含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液10mL，置于恒温培养箱35℃先感作2h，2h后补齐含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液至30mL，每天观察细胞的贴壁成长情况和细胞病变呈“葡萄串”样（CPE）情况。细胞病变后反复冻融3次，收获CAV-1细胞毒，用于日后实验，然后检测CAV-1的TCID50。1.2.5.3血凝（HA）检测微量法在96孔“V”形微量板上，从第1孔至11孔，使用移液枪每孔加入pH7.4的PBS50μL，用移液器吸取待检样品50μL，从第一孔起，每孔做倍比稀释，至最后一个倍数孔，弃去移液器内50μL液体（稀释倍数依次为2，4，6，8，16，32，...2048），12孔为红细胞对照，每孔加入不同宿主动物（人的“O”型红细胞悬液、豚鼠、鸡、大鼠、猪、羊）红细胞悬液50μL，立即在微量板振荡器上摇匀30s后4℃、37℃放置60min，判定结果。1.3结果1.3.1电镜观察结果将CAV-1的细胞毒做电镜负染观察，可见病毒粒子有明显立体对称结构，呈六角型，结构完整，大小约80nm，如图1.1。图1.1电镜负染CAV-1病毒粒子Fig1.1ElectronmicroscopynegativeexposuretovirusparticlesofCAV-113 1.3.2试纸条检测结果应用快灵生物一步法胶体金快速检测卡检测扩增的CAV-1病毒，结果如图1.2，显示为阳性。图1.2检测呈阳性Fig1.2Positivetest1.3.3单克隆免疫荧光结果根据单克隆免疫荧光结果可见，应用CAV-1荧光抗体检测出了细胞培养物中的CAV-1抗原，由此可以确定，结果见图1.3和1.4。图1.3免疫荧光图1.4阴性对照Fig1.3ImmunofluorescenceFig1.4Negativecontrol1.3.4PCR鉴定结果根据文章设定的引物，对该病毒进行常规PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳的鉴定，结果发现与最初设计的片段大小462bp几乎一致，从而在分子生物学方面验证了本实验室分离得到的毒株为CAV-1毒株。见图1.5。14 图1.5目的片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1.5AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsoftargetfragments1.3.5犬I型腺病毒F1301株生物学培养特性将本实验室保存的MDCK细胞进行复苏后，采用吸附法进行接毒，细胞病变后反复冻融三次收毒，通过显微镜观察可见典型的“葡萄串”病变，对细胞培养物进行分子鉴定。如图1.6与图1.7。图1.6正常MDCK图1.7病变MDCKFig1.6NormalcellsofMDCKFig1.7DiseasedcellsofMDCK1.3.6犬I型腺病毒F1301株生物学血凝特性通过血凝结果发现除了鸡、豚鼠和人“O”型红细胞发生了凝集，其余宿主动物红细胞均不发生凝集结果。由于CAV-1可凝集豚鼠红细胞悬液，应用不同pH值PBS（pH分别为6.4；6.6；6.8；7.0；7.2；7.4）对豚鼠红细胞悬液进行凝集，通过结果发现：当pH-6值为7.2时，红细胞凝集效果最好，凝集效果为2，如图1.8。15 图1.8豚鼠红细胞凝集效果Fig1.8Guineapighemagglutination1.4讨论目前在自然界中可以提取出的腺病毒分为CAV-1和CAV-2，而发病较多、感染种类多的则是CAV-1。犬I型腺病毒引起的狐狸脑炎发病较快、败血型、接触型传染疾病，本病具有发病急、传染迅速、危害严重等特点（郑海发），死亡率高。CAV-1可在多种细胞系上进行传代，在犬的组织细胞系上传代明显，尤其是MDCK细胞，被感染的细胞呈现典型葡萄串型病变，CAV-1可以在人肾细胞上增殖，但CAV-2却不同，不能在人、牛、猴等原代细胞上增殖传代。通过电镜观察发现本实验室分离得到的病毒结构完整，呈立体对称结构。CAV-1的双股DNA包于衣壳内，纤突和基底部组成了五邻粒，CAV-1凝集红细胞的血凝素就位于纤突顶部的球型物上，根据腺病毒特定的凝集图谱，结果发现除了鸡、豚鼠和人“O”型红细胞发生了凝集，其余宿主动物红细胞均不发生凝集结果。本实验分别通过不同pH值来凝集豚鼠红细胞悬液，结果显示当pH为7.2时CAV-1凝集豚鼠红细胞效果最佳。短时间内确定犬I型腺病毒最快的方法就是应用一步法快速检测试纸条。试纸条能初步检测病毒，但是最终的确诊还是需要通过分子生物学的手段。近年来随着疫苗的普及，已经少见流行性大规模的发病病例，但是不按时接种疫苗的个体和养殖场中仍有CAV-1感染的病例。CAV-1感染宿主动物普广泛，而且该病对外界抵抗力较强，并且呈现全世界范围内流行发病，CAV-1不可能完全被消灭。因此本章实验通过验证和鉴定本实验室分离得到的病毒，进行下一步实验，感染动物模型，这样可以为以后疫苗在研制的过程中有一定的标准。1.5小结本章通过实验验证发现了本实验室分离得到的腺病毒毒株经电镜观察发现其具有腺病毒的典型六角形形态；与豚鼠红细胞发生凝集反应，且该毒株感染MDCK细胞后，可引起典型的葡萄串型病变，证明该毒株具有腺病毒的生物学特性，鉴定为腺病毒。采用区分1型和2型的特异性引物，结果与最初设计的片段大小462bp几乎一致，证实为犬I型腺病毒。16 第二章狐源犬I型腺病毒感染银黑狐动物模型的建立狐狸脑炎是由犬腺病毒侵染机体引起的一种急性、败血性、致死性传染病。病畜喜静、肌肉抽搐、共济失调为主要特征，发病动物有腹泄，且直肠内有血便等症状。该病一旦发生，多转归死亡，给养殖狐业带来巨大损伤。犬腺病毒分为两个型，犬I型腺病毒（CanineAdenovirusType1，CAV-1）为犬传染性肝炎病毒和犬Ⅱ型腺病毒（CanineAdenovirusType2，CAV-2）为犬传染性喉气管炎病毒，从临床发病的情况和对该病流行病学研究来看，CAV-1毒株感染在我国比较常见的，由此可以得知，犬腺病毒侵染狐狸在我国是很重要的传染病。CAV-1毒株感染主要发生于狐狸，发病率通常不会大于5%，一旦感染上该病毒大多会死亡，而且该病可每年反复流行，持续多年有着感染能力，给养殖者带来巨大损失。防治CAV-1侵染的主要办法是人工接种疫苗。CAV-1弱毒疫苗被广泛使用，预防该病的发生产生了较好的效果，但是该疫苗也会产生一些副作用，蓝眼病和局部间质性肾炎。CAV-2引起的感染不能通过接种CAV-1疫苗进行免疫，但CAV-2疫苗却可以完全免疫保护由CAV-1引起的疾病，并在免疫和安全性都很好，产生机体免疫力时间短，目前在犬、狐狸等动物中取得较为满意的预防效果。然而在狐狸中由于匮乏狐狸动物模型，缺少明确的CAV-1强毒的标准，因此，用人工感染方法来创建动物模型来研究病毒的特征具有重要意义。本实验通过建立银黑狐动物模型，对CAV-1毒力进行评估，建立该病毒的强毒标准，为校检强毒标准提供了参考和依据，同时为狐狸腺病毒基因工程疫苗的研究提供理论的支持和技术根据。2.1材料2.1.1毒种和细胞犬I型腺病毒（CanineAdenovirusType1,CAV-1）F1301株，由特种经济动物疫病防7控实验室分离保存，效价为1×10TCID50/ml。MDCK传代细胞系（传至第二代），由特种经济动物疫病防控实验室保存。2.1.2实验动物银黑狐、北极狐由中国农业科学院特产研究所实验动物基地提供。2.1.3实验仪器参考1.1.3的实验仪器；一次性使用配药注射针1mL、2mL规格，购自河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司。17 2.2方法2.2.1犬I型腺病毒F1301株的培养和测定2.2.1.1复苏细胞将本实验室传代的MDCK细胞从液氮罐中取出，放进提前升温到37℃的水浴锅中，待冻存细胞瓶内液体融化后，1000rpm离心10min，弃掉上清，用细胞培养液吹打细胞沉淀，混匀后加细胞培养液于细胞培养瓶，放置37℃恒温培养箱中培养96h。将形成细胞单层的MDCK细胞，用无菌的PBS洗2次，然后细胞用胰酶消化后按照1：3的比例传代培养备用。2.2.1.2病毒培养与观察将MDCK细胞在100mL培养瓶中传代，每瓶加入含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液10mL，待细胞长满单层后，弃掉细胞培养液；取CAV-1F1301株病毒液500μL，与含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液500μL混合后加入细胞单层充分摇匀，置于恒温培养箱35℃先感作2h，2h后补齐含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液至10mL于35℃培养，每天观察细胞病变，待细胞出现“葡萄串样”病变（CPE）收获病毒，-20℃保存备用。2.2.1.3病毒含量测定将MDCK细胞用胰酶消化后加入含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基，制备成MDCK细胞悬液。用无血清的DMEM细胞培养基进行10倍系列稀释CAV-1病毒液，将-1-810~10的稀释度的病毒液分别加入到96孔细胞板中，第九列孔加细胞培养液，作为MDCK细胞对照，每个稀释度做八个重复，每孔加入100μL细胞病毒液，再加入含10%胎牛血清的细胞悬液混匀后，放置于细胞培养箱中培养，逐日观看细胞的变化。最后记录细胞发生病变的孔数，采用Reed-Muench方法计算MDCK的TCID50。2.2.2狐源犬I型腺病毒F1301株对银黑狐传代驯化2.2.2.1病毒对银黑狐感染试验将狐源CAV-1F1301株接种2-3月龄健康银黑狐3只，1mL/只（每毫升病毒含量为71.0×10TCID50）；取接种后出现典型临床症状的银黑狐1只扑杀，无菌采集肝脏，用于病毒分离，另外两只银黑狐继续观察其临床症状。2.2.2.2病毒分离和培养将无菌采集的肝脏30g，加入120mLPBS充分研磨，-20℃冻融2次后，4℃8000r离心30min，取上清，经0.45μm滤器过滤除菌，分装于5mL离心管中备用；按照2.2.1.2方法进行病毒分离和培养，收获出现典型细胞病变的培养物-20℃保存备用，即为F1代。18 2.2.2.3病毒传代将狐源CAV-1F1301株经银黑狐传代的F1代细胞毒再接种2-3月龄健康银黑狐；按照2.2.2.1和2.2.2.2方法在连续将病毒通过银黑狐传4代进行毒株驯化，每代观察银黑狐临床症状及出现典型症状时间。2.2.3狐源犬I型腺病毒F1301株对银黑狐LD50测定将30只健康的银黑狐分成6组，每组5只。用不含血清的DMEM将肝脏传代第五代毒株7-1-5F1301株病毒液（每毫升病毒含量为1.0×10TCID50）进行10倍系列稀释，将10~10五个稀释度分别肌肉注射银黑狐，1mL/只；对照组肌肉注射1mLDMEM。每天观察各组银黑狐临床发病情况和神经症状等，连续观察14d，计算LD50，并对发病动物临床症状进行记录。2.2.4狐源犬I型腺病毒F1301株对银黑狐人工感染试验2.2.4.1临床症状观察取1个TCID50的F1301株第5代培养物接种2-3月龄银黑狐5只，每天上午分别对银黑狐进行体温的测定和粪便拭子的采集，同时每天需分别观察银黑狐饮食饮水的情况，精神状态，粪便排泄，并且每天要监测体温的变化及粪便拭纸的采集，采集好的样品放在-20℃冰箱内保存备用。注意观察是否出现神经症状，最后观察记录动物发病死亡情况。2.2.4.2病理学检查仔细剖检，观察银黑狐的病理变化，用无菌解剖剪和镊子以及开骨钳分别采集银黑狐的各个组织脏器（心、肝、脾、肺、肾、肠道、脑）进行组织学的观察；同时取出采集的部分组织内脏组织用10%甲醛溶液固定，用于病理组织学检查。2.2.4.3病毒在动物体内分布规律取发病死亡动物的不同脏器，每个脏器分别取1g左右，放入5mL离心管中，每个离心管加入2mLPBS，用自动研磨器进行充分研磨后8000×g离心，取上清，一部分上清用CAV-1试纸条进行检测；另一部分取上清进行DNA的提取，应用常规PCR方法进行验证；同时取上清接毒于正常MDCK细胞，进行病毒分离。2.2.5毒株对不同日龄银黑狐的致病性选取2、3、4、5、6月龄的银黑狐，每个组别接种1mLF1301株，分别按表2-1进行攻毒实验，每组设置3只对照，对照组银黑狐使用生理盐水。保证在实验过程中每组实验动物彼此之间都没有交叉感染的可能。19 组别数量攻毒种类攻毒剂量攻毒部位1组（2月龄银黑狐）4CAV-11mL/只后肢肌肉2组（3月龄银黑狐）4CAV-11mL/只后肢肌肉3组（4月龄银黑狐）4CAV-11mL/只后肢肌肉4组（5月龄银黑狐）4CAV-11mL/只后肢肌肉5组（6月龄银黑狐）4CAV-11mL/只后肢肌肉6组（各组对照）15生理盐水1mL/只后肢肌肉表2-1攻毒银黑狐分组及安排Table2-1Groupingandarrangementposionofattacksilverfoxes2.2.6银黑狐感染犬I型腺病毒临床标准CAV-1F1301株感染银黑狐动物模型，通过对发病动物的体温变化、临床典型症状、脏器组织学检验、病理剖检检验及肝脏试纸条检测等方面制定出临床标准。2.2.7狐源犬I型腺病毒F1301株对北极狐的致病性狐源CAV-1F1301株第5代接种2-3月龄健康北极狐5只，1mL/只（每毫升病毒含量7为1.0×10TCID50），同时设3只接种生理盐水的北极狐对照组。接种后每天观察记录北极狐临床症状。2.3结果2.3.1F1301株TCID50结果通过实验测得，应用Reed-Muench方法计算MDCK的TCID50的值，病毒效价为71.0×10/mL。2.3.2F1301株传代驯化结果通过F1301株对银黑狐接种感染结果可知，CAV-1F1301株在感染银黑狐后，通过对其驯化至第五代各组银黑狐均表现出CAV-1典型的症状，各组银黑狐均死亡说明F1301株有稳定的毒力，致使银黑狐发生典型的病理症状，各传代驯化的毒株对银黑狐感染情况如表2-2。20 表征数量（只）发病出现典型36-48h后体温变化死亡率症状时间（天）（℃）代次133-439.93/3233-539.73/3334-539.63/3434-539.53/3534-539.53/3表2-2F1301传代驯化结果Table2-2resultofF1301subculturedomestication2.3.3犬I型腺病毒F1301株对银黑狐LD50测定结果攻毒后银黑狐出现了厌食、神经抽搐的症状，少量银黑狐出现呕吐以及腹泻，个别动-4.63物表现多种症状，采用Spearman-Karber方法测定该毒株对银黑狐LD50为10/mL。结果见表2-3；表现各临床症状的动物数量见表2-4。接种动物稀释滴度接种剂量接种数量结果（死亡比（mL/只）（只）例）AnimalDilutionDoseTotalNo.Results-1银黑狐10155/5silverfoxes-210155/5-310155/5-410152/5-510151/5表2-3CAV-1F1301株对银黑狐的LD50结果Table2-3TheresultsofLD50forCAV-1F1301onsilverfoxes21 表2-4临床症状统计Table2-4Clinicalsymptomsstatistics2.3.4狐源犬I型腺病毒F1301株对银黑狐人工感染试验2.3.4.1临床症状及体温变化CAV-1感染银黑狐后，银黑狐出现了典型的临床发病特征。攻毒24小时后开始食欲不振、少动、精神沉郁、应激性强，受到刺激后会出现神经症状，肌肉痉挛。抽搐后，躺在地上不采食不喝水，直至死亡，临床症状如图2.1所示，体温变化规律如表2-5。图2.1银黑狐感染CAV-1后神经症状Fig2.1NeurologicalsymptomsafterCAV-1infectedsilverfoxesA：银黑狐在不停抽搐；B：银黑狐抽搐后反应，A;Thesilverfoxwasconvulsing；B：Thereactionaftersilverfoxsconvulsion22 表2-5体温变化规律Table2-5Changesofbodytemperature2.3.4.2组织学与病理学检查银黑狐接种CAV-1后，脏器的病理剖检变化明显。肝脏肿大、有出血处、呈现淡红色和黄色相间、质脆；肾肿大；脾脏肿大；脑部血管充盈，有出血点；肺部有大量出血点。如图2.2所示（A～D）。银黑狐死亡后，剖检动物取出内脏组织脏器，用10%甲醛固定，用于病理组织切片制作。通过切片可以看出，CAV-1感染银黑狐后，肠绒毛脱落；脾脏白髓的淋巴细胞减少；肝脏大量的肝细胞变性、坏死，肝组织结构模糊；肺出现轻度的肺泡壁增厚；脑皮质内多量的小胶质细胞散在性浸润；肾部分肾小管上皮细胞的核浓缩，如图2.3。对照组的组织结构正常，见图2.4。23 图2.2银黑狐感染CAV-1后组织病理变化Fig2.2HistopathologicchangesafterCAV-1infectedsilverfoxesA：脾脏肿大；B：肺部出血；C：肝脏肿大、质脆、黄红相间；D：脑部出血A:Spleenswelling；B：Pulmonaryhemorrhage；C:Red-and-yellowonthesurfaceofliver；D：Brainhemorrhage24 图2.3CAV-1感染银黑狐脏器组织切片A：肠绒毛脱落；B：脾脏白髓的淋巴细胞减少；C：肝脏大量的肝细胞变性、坏死，肝组织构造模糊；D：肺轻度的肺泡壁增厚；E：脑皮质内大量的小胶质细胞散在性浸润；F：肾部分肾小管上皮细胞的核浓缩Fig2.3OrgantissuesectionsofCAV-1infectsilverfoxA:Intestinalvillishedding；B:Spleenwhitepulplymphocytesreduction；C：Awild-ranganddiffuselivercellsaredegenerativeandnecrosishepatictissuehaveafuzzystructure；D：Pulmonarymildalveolarwallthickening；E：Therearealargenumberofscatteringgittercellsinfiltrateinpallium；F:Somerenaltubularepithelialcellsappearnuclearenrichment25 图2.4对照组银黑狐脏组织切片Fig2.4TissuesectionofsilverfoxcontrolgroupA：肠；B脾脏；C肝脏；D：肺部；E：脑；F：肾A:Intestinal；B:Spleen;C；Liver；D:Lung；E:Brain；F:Kidney2.3.4.3动物内脏病毒检测通过剖检死亡的5只动物，收集组织脏器，充分对各个组织脏器（心、肝、脾、肺、肾、肠、脑）进行研磨，将各组织脏器研磨液通过吸附接毒的方式，接入长满单层的MDCK细胞中，结果发现只有肝脏研磨液使细胞呈现“葡萄串”型病变，其余脏器研磨液均未引起MDCK细胞发生病变；将研磨液分别采用CAV-1试纸条检测，检测结果发现肝脏和脑研磨液中CAV-1呈阳性，其余脏器研磨液CAV-1呈阴性；通过动物内脏研磨液分别提取各脏器DNA，经普通PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳的鉴定，结果显示各脏器均检测出与最初设计的理论值462bp大小相当的片段，证实存在CAV-1。如图2.5，三种方法比较结果如表2-6。26 图2.5目的片段PCR产物凝胶电泳图Fig2.5AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsoftargetfragmentsM：DNA标准DL2000；1：心脏研磨液PCR产物；2：肾脏研磨液PCR产物；3：肝脏研磨液PCR产物；4：脾脏研磨液PCR产物；5：肺脏研磨液PCR产物；6：肠研磨液PCR产物；7：脑研磨液PCR产物M:DL2000DNAMarker；1：ProductofHeartgrindingfluid；2：ProductofKidneygrindingfluid3：ProductofLivergrindingfluid；4：ProductofSpleengrindingfluid；5：ProductofLunggrindingfluid；6：ProductofIntestinalgrindingfluid；7：ProductofBraingrindingfluid方法病毒培养试纸条检测PCR检测阳性病例心脏研磨液005脾脏研磨液005肝脏研磨液555肺脏研磨液005肾脏研磨液005肠脏研磨液005脑脏研磨液055表2-6三种检测方法比较结果Table2-6Comparisonofthreedetectionmethods2.3.8毒株对不同日龄银黑狐的致病性银黑狐2、3、4、5月龄的狐狸全部死亡，6月龄的银黑狐死亡1只，对照组全部存活，由此证明，随着银黑狐月龄的增加，机体的免疫机能对病毒的抵抗力逐渐增强，1个27 TCID50的F1301毒株可使五月龄以下的银黑狐全部致死，但是不能使五月龄以上的银黑狐完全致死，如表2-7。组别数量死亡数量1组（2月龄银黑狐）44/42组（3月龄银黑狐）44/43组（4月龄银黑狐）44/44组（5月龄银黑狐）44/45组（6月龄银黑狐）41/46组（各组对照）150/15表2-71个TCID50的F1301毒株对不同日龄银黑狐致病性Table2-7PathogenicityoftheF1301strainwith1TCID50concentrationtodifferentagesilverfox2.3.9银黑狐发病临床标准2.3.9.1临床症状评分标准临床症状评分标准主要依照体温变化、神经症状、肝脏剖检变化、食欲情况作为评分标准，分值越高，病症越严重，见表2-8。评分体温变化℃神经症状肝脏病变面积食欲0≦38.3无正常正常138.4-39.0轻微病变面积≤30%减少239.1-40.0稍微30%＜病变面积≤70%厌食340.1-41.0严重70%＜病变面积废绝表2-8狐狸感染CAV-1临床症状评分标准Table2-8TheclinicalsymptomsgradingofthefoxesinfectedCAV-12.3.9.2发病判断标准使用CAV-1试纸条或间接免疫荧光对肝脏研磨液的检查，试纸条检测出阳性或间接免疫荧光检测为阳性，则判定为发病。2.3.10犬I型腺病毒F1301株对北极狐致病性CAV-1F1301株感染北极狐后，北极狐表现兴奋、口渴，攻毒24小时普遍体温升高，28 24小时后至96小时之间体温在39.5℃～41.0℃之间，攻毒72h后采食明显下降。北极狐接种后对CAV-1F1301株的抵抗力明显高于银黑狐，所以CAV-1F1301株对银黑狐敏感。2.4讨论CAV-1腺病毒可以感染犬、经济动物，狐狸一旦发病，即使通过治疗死亡率也是极高，目前还没有一个明确的标准，建立银黑狐CAV-1感染动物模型有助于对狐狸腺病毒即狐狸脑炎的研究，而且可以为研发新的狐狸脑炎疫苗提供一定标准和模型。应用本实验室分离得到的CAV-1F1301株进行攻毒实验，建立感染银黑狐的动物模7型。实验通过肌肉注射后肢肌肉来进行感染。F1301毒株病毒效价为1.0×10/mL；通过对F1301株传代驯化结果可知驯化至第五代时，银黑狐仍能发生CAV-1典型的厌食、神经抽搐的症状，驯化一至五代银黑狐均死亡，36h～48h之间平均体温为39.5℃，表明F1301株有稳定的毒力。通过分别攻入不同稀释倍数、相同剂量来确定出CAV-1F1301株感染银-4.63黑狐半数致死量，当LD50为10/mL时，可使50%的银黑狐发生死亡。攻毒第二天起，从临床症状可见银黑狐开始食欲不振、体温升高、喝水频繁、不喜动。剖检时发现各脏器都会出现不同程度病变，脾脏充血、肿大；肾肿大；小肠内出血、肠绒毛脱落；肺部、脑均有出血点；其中肝脏病变最为严重，肝脏明显呈现黄红色斑驳状，质脆，通过病理切片可以看出肝细胞坏死极多。通过对病死动物的脏器研磨液进行相应的检测，结果显示肝脏脏器的研磨液可以使MDCK细胞发生典型腺病毒病变；试纸条检测中只有肝脏研磨液和脑研磨液使试纸条呈现阳性，其余脏器研磨液CAV-1呈阴性；但是用分子生物学普通PCR检测各脏器研磨液，发现均可以检测出CAV-1的存在，说明银黑狐感染CAV-1后肝脏携带病毒含量高，CAV-1感染银黑狐后主要攻击肝脏器官，在48h～72hCAV-1在肝脏靶器官中大量扩增，对肝脏造成严重的损伤，导致机体衰竭，最后死亡。试纸条检测不足以作为检测CAV-1的有效方法，只可作为初步判定的一项手段。通过F1301毒株对不同月龄的银黑狐感染发现，随着银黑狐月龄的增加，机体的免疫机能对病毒的抵抗力逐渐增强，1个TCID50的F1301毒株对五月龄以上的银黑狐不能完全致死。通过临床发病症状评分标准发现银黑狐对CAV-1感染程度更加明显。2.5小结7（1）通过TCID50实验测得CAV-1的病毒效价为1.0×10/mL。（2）通过银黑狐半数致死量实验得出CAV-1感染银黑狐半数致死量LD50为-4.3810/mL；银黑狐对CAV-1的感染更敏感。（3）狐源CAV-1F1301株对银黑狐传代驯化至第五代时银黑狐仍能表现出CAV-1典型的临床症状，说明F1301株能够产生稳定的毒力。（4）人工感染银黑狐、北极狐均可见不同程度厌食厌水、神经性抽搐，剖检可见肝脏质脆、呈实质变黄、脾脏肿大；病理切片CAV-1可见肝脏大量的肝细胞变性、坏死，肝29 组织结构模糊，并且成功建立出CAV-1感染银黑狐的动物模型。30 第三章犬I型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立CAV-1属于腺病毒科动物腺病毒属，是哺乳动物腺病毒中致病性最强的病毒，本病对外界抵抗力较强，感染呈世界分布。目前针对CAV-1的检测和鉴定的方法有很多，如组织培养特性、病原学电镜观察、荧光抗体检查、免疫组化、普通PCR方法，这些方法操作麻烦，所需时间长，不能进行定量分析且灵敏性不高。荧光定量技术具有特异性强、敏感[69]度高、省时省力等优点，已经成为当前病毒核酸快速高效检测的主要方法。本实验通过对GeneBank中公布的几株CAV-1毒株序列分析比对，针对犬I型腺病毒特有的E3区，设计特异性引物，对引物浓度、退火温度、扩增体系等条件进行优化，创建犬I型腺病毒荧光定量PCR检测方法，可用于CAV-1的快速诊断与监测。3.1材料3.1.1毒种及实验动物CAV-1毒株、MDCK细胞均由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病防控创新团队提供；银黑狐由中国农业科学院特产研究所左家实验动物基地提供。3.1.2主要实验试剂和仪器EasyPureViralDNA/RNAKit、EasyTaqSuperMix、TransStartTopGreenqPCRSuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；SuperScript®FirstⅢ-Strand购自美国英杰生命技术有限公司；ThermoScientificFastDigestKpnlNotl3.2方法3.2.1病毒DNA的提取CAV-1病毒的提取参考实验一1.2.6提取方法。3.2.2引物设计与合成通过对GeneBank中公布的几株CAV-1毒株序列分析比对，针对犬I型腺病毒特有的，E3区，设计特异性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。上游：5，，，-CTATGACTGAGGAAAGCGTGG-3，下游5-CACAGGACCCAGAAGTCTTGAC-3，片段大小为659bp。3.2.3普通PCR扩增采用50μL的体系，2×EasyTaqPCRSuperMix25μL，上下游引物各1μL，CAV-1DNA31 1μL，ddH2O补齐至50μL。PCR反应条件：95℃3min；95℃30s，53℃30s，72℃20s共35个循环，72℃终延伸10min。待扩增结束后，取8μLPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。3.2.4标准质粒的构建选取普通PCR进行胶回收和纯化，凝胶回收产物与pEASY®BluntSimpleCloningKit载体相连接，连接产物转化到Trans5α感受态细胞，挑取单克隆菌落接于LB中培养，将培养好的菌落经质粒试剂盒提取质粒，并经过判定准确后，测出质粒浓度并换算成拷贝数，10倍稀释好后用于绘制标准曲线。3.2.5反应条件的优化在其余条件不变的情况下，通过比较熔解曲线引物二聚体是否出现、Ct值、荧光的强弱来确定该方法的退火温度。在优化后的退火温度确定情况下，对引物的浓度进行优化，最后对反应各个时间进行优化。3.2.6标准曲线的建立-1-2-3-4-5-6-7将构建好的标准质粒进行10倍倍比稀释，按10、10、10、10、10、10、10、-810八个浓度进行荧光定量检测，用LightCycler96荧光定量仪自动生成标准曲线。3.2.7特异性、重复性和敏感性实验根据荧光定量PCR产物结果标准曲线的熔解曲线进行分析，来验证该方法的特异性；制备好的标准质粒进行10倍倍比稀释，选取标准品分别稀释为3个浓度的质粒样本，每个稀释度进行3个重复，将结果进行分析，确定其重复性；制备的标准质粒进行10倍倍-1-10比稀释，10～10梯度进行荧光定量检测，由此鉴定该方法的敏感性。3.2.8临床样品检测选取40份病料，应用建立的检测方法，对其进行荧光定量检测，另做一组普通PCR方法进行检测，进行对比。3.3结果3.3.1标准质粒的构建提取CAV-1病毒DNA后，经PCR扩增，PCR产物经胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒后，经PCR扩增鉴定，结果成功构建出标准质粒（图3.1），浓度为103.7×10copies/μL。32 图3.1目的片段PCR产物Fig3.1PCRproductoftargetfragment3.3.2优化反应条件实验前，先做预实验，根据预实验的结果对反应条件进行优化。引物OD值为1，浓度为55pmol/μL，退火温度为53℃时有最低的Ct值和最高的荧光强度。荧光定量反应总体系为20μL：2×TransStartTopGreenqPCRSuperMix10μL，上、下游引物各0.4μL，模板1μL，ddH2O8.2μL。在LightCycler96荧光定量PCR仪中进行反应，反应程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，53℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。3.3.3标准曲线的制作-3-4-5-6-7-8标准质粒稀释浓度选择10、10、10、10、10、10六个浓度作为模板，用优化好的条件和反应程序对标准样品进行荧光定量PCR扩增，LightCycler96荧光定量仪器自带软件分析得到标准质粒的动力扩增曲线（图3.2）和标准曲线（图3.3），标准曲线斜率2为-3.6989，轴截距为40.72，相关系数R为1.00，表明线性很好。图3.2荧光定量扩增动力学曲线Fig.DynamiccurvesofQ-PCR76541：3.7×10拷贝/μL；2：3.7×10拷贝/μL；3：3.7×10拷贝/μL；4：3.7×10拷贝/μL；325：3.7×10拷贝/μL；6：3.7×10拷贝/μL76541：3.7×10copies/μL；2：3.7×10copies/μL；3：3.7×10copies/μL；4：3.7×10copies/32μL；5：3.7×10copies/μL；6：3.7×10copies/μL33 图3.3荧光定量PCR标准曲线Fig.StandardcurveofQ-PCR3.3.4特异性、重复性和敏感性实验通过动力曲线和熔解曲线（图3.4）综合判定，标准品表现出特异性单峰，非特异性产物的峰值和引物二聚体并没有出现，表明该方法具有较好的特异性。图3.4标准品荧光定量PCR熔解曲线Fig.3.4Meltingcurvesofstandardbyreal-timePCR-4-5-6选取10、10、10三个稀释倍数作为模板进行荧光定量扩增，每个稀释倍数重复三次，结果显示每个样本重复性基本统一（图3.5），变异系数都小于2%（表1）。654图3.5荧光定量PCR重复性实验1：3.7×10拷贝/μL；2：3.7×10拷贝/μL；3：3.7×10拷贝/μL654Fig.3.5RepeatabilitytestsofQ-PCR1:3.7×10copies/μL；2：3.7×10copies/μL；3：3.7×10copies/μL34 样品重复性实验Ct值CtvalueofrepeatabilitytestsSampleCt1Ct2Ct3⎯XSCV(%)617.0017.1116.970.150.89%3.7×1016.813.7×10520.8920.9721.3321.060.231.11%3.7×10424.9625.0025.0024.990.020.09%表1标准品重复性实验Table1Repeatabilityexperimentofstandard81选取3.7×10拷贝/μL～3.7×10拷贝/μL稀释液，分别进行荧光定量PCR和普通PCR，3发现在37拷贝/μL时荧光定量仍会出现扩增曲线（图3.6），而常规PCR只能检测出3.7×10拷贝/μL的质粒模板（图3.7），所以建立的CAV-1荧光定量检测方法敏感程度要大于常规PCR检测的浓度，敏感程度为100倍。876图3.6荧光定量PCR灵敏性检测1：3.7×10拷贝/μL；2：3.7×10拷贝/μL；3：3.7×10拷贝5432/μL；4：3.7×10拷贝/μL；5：3.7×10拷贝/μL；6：3.7×10拷贝/μL；7：3.7×10拷贝/μL；18：3.7×10拷贝/μL8Fig3.6DetectionsensitivityofQ-PCRamplificationcurvesofthestandadrs1：3.7×10copies/μL；2：3.7×107copies/μL；3：3.7×106copies/μL；4：3.7×105copies/μL；5：3.7×104copies/μL；6：3213.7×10copies/μL；7：3.7×10copies/μL；8：3.7×10copies/μL35 87图3.7常规PCR灵敏性检测M：DNA标准；1：3.7×10拷贝/μL；2：3.7×10拷贝/μL；3：65433.7×10拷贝/μL；4：3.7×10拷贝/μL；5：3.7×10拷贝/μL；6：3.7×10拷贝/μL；7：3.721×10拷贝/μL；8：3.7×10拷贝/μL8Fig3.7DetectionsensitivityofConventionalPCRM：StandardofDNA1：3.7×10copies/μL；2：3.77654×10copies/μL；3：3.7×10copies/μL；4：3.7×10copies/μL；5：3.7×10copies/μL；6：3.7×103copies/μL；7：3.7×102copies/μL；8：3.7×101copies/μL3.3.5临床样品检测采集实验基地的40份银黑狐动物模型的粪便拭子，对其提取基因组，分别用建立的荧光定量检测方法与常规PCR方法进行查验。结果显示，常规PCR方法检测出23份阳性病例，荧光定量检测方法检测出39份阳性病例（见表2），两种方法检测结果重复率为100%，表明荧光定量检测方法比较常规PCR方法更加灵敏。荧光定量PCR检测出阳性份数常规PCR检测出阳性份数阳性病例3923阳性率97.5%57.5%表2两种方法检测结果比较Table2Comparisonoftwodetectionmethods3.4讨论犬I型腺病毒的DNA可以通过与病毒结合编码着一些蛋白质，其基因组中存在着可以增强腺病毒感染传播性的末端蛋白。跟据腺病毒自身的一些特点，可以通过该病的临床症状、流行病学以及剖检变化可以做出初步的判断，但是这些方法费时繁琐，特异性、重复性以及灵敏性均较差，不能够完全确诊。随着生物分子技术的不断成熟，PCR检测方法、核酸杂交、内切酶分析技术已经不断的应用于检测中，自1996年由美国AppliedBiosystems公司推出日臻完善的荧光定量PCR检测技术，对PCR产物进行精确定量分析已成为PCR技术发展的重要方向(傅占江，2002；金振华等，2000，1996)。犬I型腺病毒在病毒复制过程中，其E3区所编码的蛋白质可以识别病毒，并且能够降低机体识别被感染的细胞，病毒的感染却与E3区是否存在没有必然的关系，所以根据E3区这一特点，通过基因保守36 区设计出引物，用于荧光定量PCR方法的建立。本研究通过E3区设定特定引物，采取SYBRGreenI荧光定量PCR检测CAV-1基因2的表达量。所建立的方法斜率是-3.6989，相关系数R是1，说明该方法扩增的质量很高、标准曲线有着较好的线性关系；通过熔解曲线与动力曲线综合判定，该方法具有独立单峰，无引物二聚体和特异性产物的出现，说明该方法特异性较好；变异系数均小于2%、Cq值彼此接近，重复性较高，说明重复性较好；通过稀释标准品为模板，从动力曲线可以看出该方法最低检测浓度为37拷贝/μL，而普通PCR最低检测浓度为3700拷贝/μL，灵敏性比普通PCR方法高100倍，说明灵敏性较高。荧光定量PCR检测方法检测出结果只需要1小时，相比其他检测方法更加的快捷，特异性、敏感性、重复性高，对于CAV-1的检测具有重要的意义。为CAV-1分子流行病学调查、早期诊断，以及对CAV-1快速诊断方法的研发提供了一定的基础。3.5小结本章成功的建立了检测CAV-1病毒的荧光定量PCR检测方法，为CAV-1病毒分子诊断检测技术和快速诊断检测方法的研究提供了一定基础。37 全文总结1.通过电镜观察、试纸条检测、分子生物学常规PCR方法鉴定了本实验室分离得到的F1301株病毒为CAV-1，通过培养特性、血凝特性验证了犬I型腺病毒F1301株生物学特性。2.成功建立狐源犬I型腺病毒感染银黑狐的动物模型，F1301株病毒病毒效价为71.0×10TCID50/mL，毒株驯化至第五代仍能使银黑狐发生犬I型腺病毒典型症状，犬I型-4.38腺病毒F1301株有稳定的毒力，CAV-1感染银黑狐半数致死量LD50为10/mL，制定出银黑狐感染CAV-1临床发病标准。3.应用SYBRGreenI荧光染料建立出CAV-1荧光定量检测方法，该方法相关系数2R为1，CV（%）值均小于2%、灵敏性最小可以检测到37个拷贝、Cq值彼此接近，建立方法与常规PCR方法重复性为100%，临床样品检测合格率为97.5%，所以该方法具有很好的应用性，成功的建立了CAV-1荧光定量PCR检测方法。38 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作者简介姓名赵辉性别男民族汉吉林省敦籍贯政治面貌团员入学时间2015.9化市申请学位类别硕士学位论文答辩日期2017.5授予学位年月2017.6就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2010.9-2014.6就读于吉林农业大学动物科学技术学院动物科学专业2010.9-2014.6吉林农业大学动物科学技术学院，10级动科一班班长，学习部部长2011.5-2014.6长春市“科技兴农、校地对接”第十三服务团团员2015.9-2017.6就读于吉林农业大学研究生学院兽医专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名署名单题目刊物名称（级别）发表情况(刊出时间/录用)次序位发表学术论文获奖项目及专利43 致谢转眼间硕士学习生涯即将结束，在此论文完成之际，我想对帮助我的老师、朋友以及家人表示深深的感谢。在这两年的生活里，内心充满了感激。两年的时光，有为做出了满意的实验结果而欣然大笑，也有为实验的繁琐不解而情绪低落。但这两年的生活也锻炼了我，让我收获了知识、友情以及丰富了我人生经历。本篇论文是在我的导师闫喜军研究员的指导下完成的。闫老师渊博的知识、丰富的阅历以及对待科研严谨的工作态度让我学到了大量的专业知识。在生活上，闫老师待人和蔼、为人师表，给予了我这个在外求学的学子倍感亲切的关怀。硕士生涯这两年不论我在科研上还是生活上，各方面的能力都有了质的提高，这每一步都离不开闫老师的谆谆教诲，所以，请允许我向我最尊敬的老师致以最真诚的谢意，祝闫老师在以后的工作生活里，身体康泰、平安喜乐。感谢薛向红老师帮助我设计实验并指导我顺利的开展实验。在实验的进程中，遇到过很多的疑惑，薛老师都是耐心的为我解惑。感谢薛向红老师、朱言柱老师和刘昊老师安排我毕业论文的撰写和在论文修改的方面提供了专业的建议和修改，并在学习和生活中给予我关心和帮助，祈愿薛向红老师的小公主能够健康快乐的成长。还要感谢中国农业科学院特产研究所经济动物疫病防控团队的所有成员。感谢胡博老师、吕爽老师、白雪老师、鲁荣光老师、史宁老师、张海玲老师、张蕾老师、赵建军老师、邓效禹老师在实验过程中给予的建议和帮助；感谢廉士珍老师和徐淑娟老师在实验中为我提供的便利条件。感谢王洋师兄、杜翔师兄、马凡舒师姐、李欣彤同学、范思宁同学、吕娇师妹、孙杰师弟、秦飞燕师妹以及2015级14班的同学在生活上的关心、实验中的帮助；感谢我的室友李家伟同学在生活上的陪伴，祝我的朋友们前程似锦。感谢我的父母二十多年来如一日的关心和照顾，感谢你们抚育我长大，你们是我在外拼搏的动力、是我幸福的港湾，祝愿父母身体健康，万事如意。最后，再一次感谢帮助我的老师、朋友、家人们，祝福你们一帆风顺、锦绣前程。研究生生涯很快就要过去，迎接我的将是另外一番广阔的天地，我将会以实际行动来感谢所有关心帮助过我的人，希望自己能够继续少年时的梦想，永不放弃。44
