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７８密级：分类号：Ｑ年ＵＤＣ：黑龍＞＊＞、＿農龛乂考２０１３届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文仔猪ＲＢＭ３重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ＰａｃｋａｇｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｔｏｒＩｎｓｅｒｔｅｄＲＢＭ３学科、专业：基础兽医学研究方向：生物化学与分子生物学研究生：李俭指导教师：李士泽教授２０１３年４月完成日期：中国大庆 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果一，也不包含为获得黑龙江八农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年〈月冴曰关于论文使用授权的说明本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存一、汇编学位论文。同意黑龙江八农垦大学可以用不同方式在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。保密的学位论文在解密后应遵守此协议（）研究生签名：时间：年＜月曰导师签名：时间：年＾月 摘要RNA结合基序蛋白3(RNAbindingmotifprotein3，RBM3)是Danno等于1997年首次在人类胎儿的脑组织中分离鉴定得到的一种富含甘氨酸的冷休克蛋白。RBM3蛋白是一种具有潜在研究价值的多功能蛋白质，它不仅能够在对抗缺氧、寒冷等有害刺激时提升表达量以保护细胞，而且它在预防肿瘤、癌症的发生和肌肉疾病的治疗上都具有开发价值。因此构建能够在细胞内表达的含有RBM3基因的慢病毒表达载体能够为研究RBM3蛋白的生理作用机制及RBM3蛋白在临床上的应用奠定基础。本实验的目的是应用分子生物学手段构建含有仔猪RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的慢病毒表达载体pLenti6/v5-RBM3，通过质粒转染技术让重组的慢病毒质粒进入293T细胞内产毒，用产生的重组慢病毒液感染ST细胞(猪睾丸细胞系)，应用荧光定量PCR方法和Westernblot方法从mRNA水平和蛋白水平评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果。本研究主要应用生物学手段扩增得到仔猪RBM3基因，然后将其连入入门载体pENTR-11中，应用Gateway技术将RBM3基因平行转移到慢病毒载体pLenti6/v5-DEST中，让重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3在感受态细胞DH5α中扩增培养，提取质粒pLenti6/v5-RBM3并对连入表达载体的RBM3基因进行测序鉴定，将重组的慢病毒质粒转染293T细胞，收获病毒液，用慢病毒pLenti6/v5-GFP感染ST细胞确定最佳感染复数MOI，根据所测得的最佳MOI值确定感染剂量，然后用慢病毒pLenti6/v5-DEST的病毒液和重组慢病毒pLenti6/v5-RBM3的病毒液分别感染ST细胞后提取细胞RNA和细胞蛋白样品，用荧光定量PCR方法检测RBM3mRNA在感染病毒的ST细胞中的表达，用Westernblot方法检测RBM3蛋白在感染病毒的ST细胞中的表达。结果表明：(1)构建的慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3经测序分析证实基因序列正确。7(2)慢病毒载体通过293T细胞包装后的重组慢病毒pLenti6/v5-RBM3滴度为2×108PFU/mL；慢病毒pLenti6/v5-DEST滴度为4.7×10PFU/mL；慢病毒pLenti6/v5-GFP滴度为83×10PFU/mL。(3)荧光定量PCR方法检测到RBM3基因在转录水平上均有表达，空载体组与空白对照组相比，RBM3mRNA表达量差异不显著；过表达组与空白对照组相比，RBM3mRNA表达量显著增加，差异显著(P＜0.05)。(4)Westernblot方法检测到RBM3蛋白在翻译水平均有表达。空载体组与空白对照组相比，RBM3蛋白表达量差异不显著；过表达组与空白对照组相比，RBM3蛋白表达量显著增加，差异显著(P＜0.05)。结论：本研究构建的含有重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的病毒液能够感染ST细胞，并使其RBM3蛋白表达量显著增加(P＜0.05)。关键词：冷休克蛋白；RNA结合基序蛋白3；慢病毒载体；荧光定量PCR；WesternblotI AbstractRBM3wasfirstidentifiedfromahumanfetalbraintissuecDNAlibraryin1936.RBM3proteinisamultifunctionalproteinthathaspotentialresearchvalue.Itdoesworkbyelevatingexpressionnotonlyinthefightagainstnoxiousstimuli,suchashypoxiaandcoldstress,toprotectcells,butalsointhepreventionofcancer,theoccurrenceofcancerandthetreatmentofmusclediseases.BuildingthelentiviralvectorincludingRBM3genewhichcouldexpressincellscouldlaythefoundationforthestudyofthephysiologicalmechanismofRBM3proteinanditsapplicationinclinical.Themethodofthisstudy:RBM3genewasamplifiedbyusingthemolecularbiologytechniques,andthenwasinsertedintothelentiviralvectorPlenti6/v5-DEST,pLenti6/v5-RBM3wasculturedandamplifiedintheDH5αcompetentcellsandRBM3genesequencewasidentified.The293TcellsweretransfectedwiththepLenti6/v5-RBM3.Thelentiviruswasharvested,andthenwasusedtoinfectSTcells,Real-time-PCRassaywasusedtoevaluatethemRNAexpressionofRBM3mRNAintheinfectedSTcells,andwesternblotwasusedtoevaluatetheproteinexpressionofRBM3intheinfectedSTcells.Experimentalresultsindicated:(1)ThesequenceofRBM3insertedintolentivirusvetorwasright.7(2)ThelentiviraltiterpLenti6/v5-RBM3was10PFU/mL;ThelentiviraltiterpLenti6/v5-88DESTwas4.7×10PFU/mL;ThelentiviraltiterpLenti6/v5-GFPwas3×10PFU/mL.Thelentivirusesproducedby293TcellswereefficienttoinfectSTcells.(3)RBM3geneexpressionwasdetectedatthetranscriptionallevelbyquantitativePCRmethod.Emptyvectorgroupcomparedwiththeblankcontrolgroup,RBM3mRNAexpressionlevelsclosedtothesame;Overexpressiongroupcomparedwiththecontrolgroup,RBM3mRNAexpressionlevelwassignificantlyincreased,theyhadasignificantdifference(P<0.05).(4)ProteinRBM3expressionwasdetectedattheproteinlevelbyWesternblotmethod.TheproteinRBM3expressionbetweenEmptyvectorgroupandtheblankcontrolgrouphadnosignificantdifference,TheproteinRBM3expressionbetweenoverexpressiongroupandthecontrolgrouphadasignificantdifference(P<0.05).Conclusion:RBM3expressioninSTcellscanbeeffectivelyup-regulatedbyinfectedwithrecombinedpLenti6/v5-RBM3lentivirus(P＜0.05).Keywords：Coldshockprotein;RNAbindingmotifprotein3(RBM3);Lentiviralvector;Real-time-PCR;WesternblotII 英文缩写词表英文缩写英文全称中文全称AmpAminobenzylpenicillin氨苄青霉素Arg-Gly-Glyarginine-glycine-glycine精氨酸-甘氨酸-甘氨酸RBM3RNA-bindingMotifProtein3RNA结合蛋白3CSPsColdshockproteins冷休克蛋白CIRPColdinducibleRNA-bindingprotein冷诱导RNA结合蛋白UCPUncouplingProteins解耦联蛋白RRMRNArecognitionmotifRNA识别基序RNP1Ribonucleoprotein1核蛋白1DMEMDulbecco'smodifiedEagle'smediumDMEM培养基DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯E.coliEscherichiacoli埃希氏大肠杆菌dsoligodoublestrandedoligo双链寡核苷酸dNTPDeoxybrbonuclesidetriophosphate三磷酸脱氧核苷EBEthediumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸钠FBSFetalbovineserum胎牛血清GFPGreenfluorescentprotein绿色荧光蛋HuRhumanantigenR人类抗原RLVLentivirus慢病毒LVVLentiviralvector慢病毒载体PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PEGPolyethyleneglycol聚乙二醇RNaseARibonucleaseARNA酶ARNAiRNAinterferenceRNA干扰cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸RNARibonucleicacid核糖核酸miRNAmicroRNA微小RNAsiRNASmallinterferingRNA小干扰RNALBLuriaBertanimediumLB培养基YTyeastextractandtryptone酵母提取物和胰蛋白胨SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵TEMEDN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamineN,N,N’,N’-四甲基乙二胺TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷RT-PCRReversetranscription-polymerasechainrection逆转录-聚合酶链式反应III GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶ssecond秒hhour小时minminuite分钟bpbasepair碱基对mLmilliliter毫升μLmicroliter微升rpmrevolutionperminute每分钟转速KDaKilo-dalton千道尔顿ODOpticaldensity吸光度IV 目录前言.........................................................................................................................................1第一章文献综述.................................................................................................................21.1冷应激对机体的伤害........................................................................................................21.2冷应激反应中相关基因的变化......................................................................................31.3RNA结合基序蛋白3的生物学功能............................................................................51.4本实验中涉及的主要技术................................................................................................8第二章重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的构建...................................102.1材料.....................................................................................................................................102.2方法......................................................................................................................................112.3结果.....................................................................................................................................192.4讨论.....................................................................................................................................222.5小结.....................................................................................................................................23第三章重组慢病毒的制备及滴度测定...............................................................243.1材料.....................................................................................................................................243.2方法.....................................................................................................................................253.3结果.....................................................................................................................................283.4讨论.....................................................................................................................................313.5小结.....................................................................................................................................33第四章重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定......................................................................................................................................344.1材料.....................................................................................................................................344.2方法.....................................................................................................................................354.3结果.....................................................................................................................................414.4讨论.....................................................................................................................................474.5小结.....................................................................................................................................48第五章结论....................................................................................................................49参考文献.................................................................................................................................50致谢............................................................................................................................................54附录......................................................................................................................................55作者简介.................................................................................................................................58V ContentsIntroduction.............................................................................................................................1Chapter1LiteratureReview....................................................................................21.1Injuryofcoldstressonanimals......................................................................................21.2Geneticchangesincoldstress.........................................................................................31.3BiologicalfunctionsofRBM3.........................................................................................51.4Themaintechnicalintheexperiments.........................................................................8Chapter2ConstructionofpLenti6/v5-RBM3............................................102.1Materials.............................................................................................................................102.2Methods................................................................................................................................112.3Results.................................................................................................................................192.4Discussions.........................................................................................................................222.5BriefSummary.................................................................................................................23Chapter3Preparationofrecombinantlentiviralandtiterdetermination......................................................................................................................243.1Materials.............................................................................................................................243.2Methods...............................................................................................................................253.3Results.................................................................................................................................283.4Discussions.........................................................................................................................313.5BriefSummary.................................................................................................................33Chapter4ExpressionandIdentificationofpLenti6/v5-RBM3inSTcells.....................................................................................................................................344.1Materials.............................................................................................................................344.2Methods...............................................................................................................................354.3Results.................................................................................................................................414.4Discussions.........................................................................................................................474.5BriefSummary.................................................................................................................48Chapter5Conclusions...............................................................................................49References..............................................................................................................................50Acknowledgements...........................................................................................................54Addendaum..........................................................................................................................55IntroductionofAuthor..................................................................................................58VI 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文前言前言环境温度对动物的影响一直受到研究者的关注，环境温度的过高或是过低都能够直接影响动物的生产性能、免疫能力和所提供的产品质量。因此，环境温度刺激成为制约畜牧产业发展的重要因素之一。猪对寒冷比较敏感，尤其是初生仔猪，当外界环境温度超过34℃时，[1]机体无法进行自我体温调节。在出生后72h内受冻而死的仔猪占很大比例，同时寒冷也能[2]够导致猪的生产性能降低、睾丸损伤等疾病。这种现象对我国畜牧业的损失不容估量。冷应激能够引起多种蛋白的表达发生变化，研究人员发现当动物机体受到寒冷刺激时，大多数[3]蛋白质的转录、翻译受到抑制，但是冷休克蛋白的表达量却显著升高，冷休克蛋白功能的研究是未来科学研究的发展方向。RNA结合基序蛋白3(RNAbindingmotifprotein3,RBM3)是人们在哺乳动物体内发现最早的冷休克蛋白之一，1997年Danno等人在人类胎儿的脑组织中发现了RBM3的存在，并[4]且对这个冷休克蛋白进行了分离鉴定，RBM3蛋白是一种具有潜在研究价值的多功能蛋白[5-6]质，它不仅在对抗缺氧、寒冷等有害刺激时表达量升高用以保护细胞，而且它在肿瘤、[7][8]癌症的发生、肌肉疾病的治疗上都具有开发价值。RBM3蛋白是哺乳动物体内重要的冷休克蛋白,研究者发现当动物机体内RBM3蛋白含量升高时，动物对抗外界有害刺激的防御[9]能力就会增加。WellmannS等人的研究指出,RBM3蛋白在细胞快速生长过程中扮演着至关重要的角色,当细胞遇见缺氧和其他不利条件时,它会通过补充翻译效率来挽救不利微环境下的细胞生存优势.但是,在动物正常生理状态下细胞内的RBM3蛋白含量很少。因此本实验希望通过构建含有RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的重组慢病毒表达载体，并将构建成功的质粒转染入293T细胞,制成了复制功能不全但是包含目的基因的慢病毒,然后将获得的病毒颗粒感染ST细胞，应用荧光定量PCR方法和Westernblot方法在mRNA水平和蛋白水平两方面综合评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果，本实验的研究成果为后续研究RBM3在组织细胞中的功能及应用奠定了基础。1 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述第一章文献综述1.1冷应激对机体的伤害1936年，加拿大生理学家Hansselye提出应激这一概念。应激是指非特异性有害因子[10]的刺激作用于动物机体，从而引起的机体机能障碍和防御反应。它是生命体为了生存和发展所必需的机体防护机制的重要组成部分，它的根本目的是动员机体的全部防御机制，去克服有害因子对机体产生的伤害，保护机体在受到不良环境影响下的稳态。当机体受到强度不高的自然应激时，能够通过一系列的反应机制适应这种应激，从而提高机体本身的生产性能，这种能够维持机体生理平衡的应激即为生理性应激。动物体长期处于高强度的应激刺激时，机体就会产生严重的不良反应，可导致机体出现一系列机体机能、代谢紊乱和结构损伤，甚至死亡的反应，这种对动物机体产生严重伤害的应激即为病理性应激。生理性应激反应的发生能够提高机体的免疫机能，有利于机体在外界环境温度及其他条件发生改变事维持机体正常的稳态，增强机体对环境的适应能力。病理性应激反应由于其过于强烈或者持续时间过久，超出机体所能够承受能力的极限，从而使机体内环境稳态发生变化，如猪的PSS应激综合症，PSS猪肉就是猪在宰前由于收到惊吓等应激因素的刺激影响了宰后猪肉的品质，使宰后的猪肉呈现肌肉苍白、柔软和渗出物增多等状态，被人们称为白肌肉(PSE)。应激因素即应激原有很多，对机体的任何刺激，只要达到一定的强度，即可作为应激原而引起应激反应。例如紫外线刺激、冷刺激、热刺激等物理性刺激，病原微生物、寄生虫等生物性刺激，创伤刺激、神经紧张及惊吓等生理性刺激，缺血、缺氧、血压升高等机体内在因素刺激。环境温度对动物的影响一直受到研究者的关注，环境温度的过高或是过低都能够直接影响动物的生产性能、免疫能力和所提供的产品质量，因此，环境温度刺激成为制约畜牧产业发展的重要因素之一。不同动物对寒冷刺激的表现各不相同，寒冷应激的作用强度也有所不同。动物短时间暴露于寒冷环境中产生报警反应，此现象在冷刺激作用机体后迅速出现，能够快速动员机体的防御机制对细胞进行保护。动物在长时间冷暴露的情况下，冷应激首先产生报警反应，经过一段时间反应消逝后，动物体内的代谢反应发生特异性变化，持续的冷刺激能够使机体内的儿茶酚胺和甲状腺激素分泌增多，能量代谢持续升高，产生气候适[11]应的现象。机体适应不了过度的冷刺激就会破坏机体的适应机能，许多重要的机能衰竭，严重影响动物的健康。气候是影响我国畜牧业的重要因素，气候因素包括空气中的温度、湿度、气压等。其中气温对动物的影响最大。我国北方地区春冬寒冷季节气候条件相当恶劣，白天和夜晚的温差非常大，环境低温能够引起动物机体的冷应激反应，但是气温骤降的现象降低了动物机体本身抵御自然灾害的能力，从而引起机体生长缓慢、生产性能降低、发病率高甚至死亡等问题。虽然畜禽养殖人员就对抗冷刺激做出了许多防御措施，例如改善饲养管理，加强营养调控等举措，但是对于气温的骤降，饲养者并不能做出及时的防护。怎样能够降低冷刺激对畜禽的2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述伤害是研究者们关注的一个重要问题。1.2冷应激反应中相关基因的变化寒冷条件下，动物机体内与抗冷应激相关的基因被启动，使得组织细胞内某些特异性抗体或与这些抗冷应激相关蛋白的表达量升高，从而提高机体对抗冷应激或适应冷环境的能力。迄今为止，研究人员发现的与冷应激相关的基因有21种。研究较多的基因是热休克蛋白基因(HSPs)、解耦连蛋白基因(UCPs)、冷休克蛋白基因(CSPs)、金属硫蛋白基因(MT)。热休克蛋白(heatshockprotein，HSPs)是Ritossa于1962年在非致死性热处理后果蝇的唾液腺复合染色体中发现的蛋白质，它包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小HSP(相对分子量为22000-32000)和泛素(相对分子量为7000-8000)，其中和冷应激相关的最主要热休克蛋白就是HSP70，它能够和细胞内的其他生物分子的不稳定结构相结合，恢复细胞内功能构象并对细胞进行保护作用。HSP70在细胞蛋白合成的过程中通过新生蛋白肽链的可逆性结合保持蛋白结构的稳定性，并在肽链的延伸完成后协助靶蛋白形成正确的构象。细胞处于正常状态时，HSP70的表达量很低，但当机体受到应激刺激时它的表达量就显著升高，因此它被研究学者作为评价机体、组织细胞处于危险状态的一个分子标志物。研究发现，寒[12]冷刺激能够诱导小鼠在棕色脂肪组织中合成HSP70mRNA，还能够大幅度提高仔猪肝脏、[13]脾脏、肌肉和血淋巴细胞内的HSP70蛋白的表达量。这些研究表明，动物机体在受到冷刺激时各组织器官充分发挥其调节作用，HSP70蛋白表达量增加，从而适应环境温度的改[14]变。HSP的表达被复杂的调控因素所控制，在低温环境中，体温、血液、皮肤温度都会随环境温度的降低而降低，从而刺激机体下丘脑体温调节中枢，活化神经系统而引起神经系统、呼吸系统、循环系统和内分泌系统的改变。冷刺激能够引起细胞损伤或坏死，从而引发机体的氧化应激反应，加重生物膜损伤等现象。有研究表明，应激产生的蛋白能够有效的调[15]节免疫细胞的激活和细胞因子的产生。细胞内蛋白(包含被诱导大量产生的HSP70)被释[16]放，引起免疫系统的迅速反应。解耦联蛋白(UncouplingProteins，UCP)是最早在啮齿动物棕色脂肪(brownadiposetissue，BAT)的线粒体膜上发现的转运蛋白，能够通过解离呼吸链氧化磷酸化耦联将机体代[17-18]谢用于合成能量物质ATP的能量转化为机体产热。UCP基因家族的主要成员包括UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5(或称BMCP1)和UCP6。1978年，Gillian和Rob在仓鼠棕色脂肪组织中发现UCP1，棕色脂肪组织是机体产热的主要组织。随后科学家在多种动[21-22]物体内发现UCP1，UCP1主要分布于棕色脂肪组织中。UCP1所介导的产热有短期和长期两种。短期反应的机制是动物受到寒冷刺激后，机体诱导交感神经系统释放去甲肾上腺素，然后去甲肾上腺素与棕色脂肪组织细胞上的β-肾上腺素能受体结合，产生的环腺苷酸(cAMP)激活蛋白激酶A，随后蛋白激酶A分解脂肪，释放脂肪酸，机体利用脂肪酸的氧化分解为对抗寒冷提供热量。在长期反应中，蛋白激酶A可以激活一系列级联反应，从而提高UCP1蛋白的表达量、合成新线粒体以及促进棕色脂肪组织的增生。冷休克蛋白(cold-shockprotein，CSPs)作为RNA分子伴侣，这几年已成为学者们研究的热点。无论微生物或是动物，当受到寒冷刺激时，机体都会产生一系列的冷休克蛋白对细胞3 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述进行保护作用。[21]1987年，研究人员在大肠杆菌中发现了第一个冷休克蛋白(CspA)，随后人们发现了和这个蛋白在结构上相关的一系列蛋白质，研究人员将这类蛋白称为CspA家族。成员包括CspA、CspB、CspC、CspD、CspE、CspF、CspG、CspH、CspI。只有CspA、CspB、CspG是冷诱导蛋白，其中研究最多的就是CspA，在冷刺激时，大肠杆菌诱导的CspA表达量升高，与单链RNA结合阻止mRNA进行有效翻译的二级结构的形成，或者作为伴侣蛋白来促进它们的核质穿梭，从而保持线性的存在方式，这样在来自大肠杆菌的CspA能够提高自身[22]mRNA翻译水平的同时也能够提高mRNA对RNAase的降解敏感度。随后Dersch等人在[23]1994年通过双向凝胶电泳发现，在大肠杆菌中共有16种蛋白是冷诱导产生的。除了Csp家族外，还包括RecA、H-NS、NusA、Hsc66等冷诱导产生的蛋白。研究学者就寒冷刺激作用于动物时机体内的生理变化进行了研究，学者们发现当动物受到寒冷刺激时，动物机体内的大部分蛋白质的合成量减少，少数的蛋白质却显著增加，其中包含了一类特殊的蛋白质，它能够帮助动物机体对抗寒冷以及其他一些有害刺激，这类功能性蛋白被人们称为冷休克蛋白。1997年Nishiyama等人在小鼠睾丸细胞中分离得到冷诱导[4]RNA结合蛋白(coldinducibleRNAbindingprotein，CIRP)，最长的开放阅读框编码172个氨基酸的蛋白质，其分子量为18kDa。随后人们陆续在人类、大鼠、非洲爪蟾、牛蛙等多种生物细胞中分离得到CIRP的cDNA序列，并发现它们在结构上高度保守，具有较高的同源性。同年Danno等人在人类胎儿的脑组织中分离鉴定得到了另一种与CIRP结构相似的冷休[24]克蛋白RNA结合基序蛋白3(RNAbindingmotifprotein3，RBM3)，其分子量为17kDa，最长的开放阅读框编码157个氨基酸的蛋白质。RBM3在核酸结构和氨基酸大小两方面与玉米的一个RNA结合蛋白AAIP具有同源性，这表明了RNA结合基序蛋白3从植物到哺乳[25]动物保守的根本途径中发挥作用。这两个蛋白是目前被研究较多的冷休克蛋白，它们在结构上具有共同的特征，都在氨基端具有RNA识别基序(RNA-recognitionmotif，RRM)和一个富含甘氨酸的羧基末端的区域。CIRP和RBM3的氨基酸序列对比，主要的同源发生在RNA结合区域，同源性高达70%。CIRP是一种典型的冷休克蛋白，当受到寒冷刺激时，蛋白表达量就会升高，并且CIRP被诱导的程度与冷刺激的强度和时间有直接的联系，冷刺激后CIRP的表达存在一定规律并且具有组织特异性。当环境温度升高时，CIRP在细胞中的表达会显著降低。人们研究发现CIRP是以RNA分子伴侣的形式对冷应激条件下的基因进行调控，从而对细胞进行保护作用的。CIRP参与人和动物机体内的很多生物学过程，包括冷应激过程。研究发现，CIRP可以被许多应激原诱导表达，它参与了调节两栖动物的冬眠；并在子宫内膜周期调节及其癌症[26][27]发生过程中担当角色。还与人和动物的神经发育调节密切相关。RBM3是动物机体内另一种非常重要的冷应激蛋白，正常生理条件下在多种组织和细[28]胞中存在，并且在外界环境温度变化时被诱导表达量升高。1997年Danno等研究发现，RBM3可以在k562、HepG2、NC65、HeLa、T24等多种细胞系中表达，RBM3的表达程度与温度呈负相关，即在32℃时表达最强，在39℃时表达最弱。在NC65细胞系中，RBM3在低温环境下，其表达在36h中随时间推移，表达逐渐增高，相同条件下RBM3表达强度要高于CIRP。与CIRP的分布不同，RBM3并非在所有细胞中均能表达，在一些组织中检4 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述测不到RBM3蛋白的表达，它在胰腺、肾上腺、胎盘和睾丸细胞中高效表达，在心脏、甲状腺细胞中则不表达。虽然RBM3与冷诱导的生长抑制无关，但其与CIRP一样在冷应激细胞保护中扮演着重要的角色。2004年Wellmann等研究发现，与CIRP相似的是，在细胞缺氧的条件下，RBM3的表达会明显增高。这提示RBM3可能具有对抗有害刺激、保护细胞功能的作用。由于RBM3的主体结构和CIRP相同，其发挥作用也应与CIRP有着共同的[5]途径。金属硫蛋白(MT)是一类富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白。金属硫蛋白家族有4种亚型，它们分别是MT-I、MT-II、MT-III和MT-IV。糖皮质激素、金属元素、各种生理、病理或心理的应激因素都能够诱导金属硫蛋白的合成，MT是一种急性期蛋白。近年来，学者们深入的研究了金属硫蛋白在抗氧化和抗冷应激方面的作用。并且揭示了金属硫蛋白与动物抵抗冷应激的能力有着非常密切的关系。Beattie等人研究发现，冷刺激能够诱导大鼠肝脏、肾脏及棕色脂肪组织中MT-I的合成增加，其中肝脏中MT表达量是正常状态下的2-3[29]倍，而棕色脂肪组织中MT含量增加了16倍。1.3RNA结合基序蛋白3的生物学功能许多研究者就动物处于冷环境时其生理变化进行研究，研究学者在动物体内发现冷刺激时大部分蛋白质合成受到抑制的同时冷休克蛋白的合成含量却显著升高。动物体内主要的冷休克蛋白有冷诱导RNA结合蛋白(ColdinducibleRNA-bindingprotein，CIRP)和RNA结合基序蛋白3(RNAbindingmotifprotein3，RBM3)，近些年来越来越多的研究者们致力于冷休克蛋白的研究，但是大多数研究都是围绕CIRP开展的，关于RBM3的研究还很少。因此对RBM3进行深入研究是未来科学研究的发展方向。1.3.1RNA结合基序蛋白3的结构与分布1997年Danno等人在人类胎儿的脑组织中分离鉴定得到了一种冷休克蛋白RNA结合基[24]序蛋白3(RNAbindingmotifprotein3，RBM3)，它是由172个氨基酸组成、分子量为18kDa的蛋白质，与小鼠RBM3氨基酸序列同源性为94％。RNA结合基序蛋白3是哺乳动物体内重要的冷休克蛋白，它是结构高度保守且富含甘氨酸RNA结合基序蛋白家族的成员之一，[30]受轻度低温影响而上调。RBM3具有相对简单的结构域结构，包括二个结构域。一个是单一的RNA识别基序(RRM)，它在不同的物种之间高度保守。另一个是富含精氨酸，甘氨酸，和酪氨酸的羧基末端区域。RRM是RNA结合基序之一，它包含两个高度保守序列：一个命名为核糖核蛋白1(RNP1)的八聚体和一个命名为核糖核蛋白2(RNP2)的六聚体，除了这两个保守序列之外还伴随有大量的疏水性氨基酸分散贯穿在整个基序中，富含甘氨酸的羧基末端区域含有Arg-Gly-Gly(RGG)重复子，RGG区域能够介导蛋白质之间的相互作用从而[31]影响蛋白质与RNA的结合。在成年大鼠的睾丸支持细胞中RBM3呈构成型表达，在小鼠睾丸发育过程中RBM3表达出现的时间表明其与睾丸支持细胞的功能发育之间相关。此外，在睾丸以外的其他组织5 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述RBM3也表达，比如小脑，肺，脾，肠和子宫，但在心脏、甲状腺细胞中则不表达。RBM3在基因图谱中定位于Xp11.23，在中度低温应激中他的表达很早就被诱导，其最高表达量出现在6-12小时之间。1.3.2RNA结合基序蛋白3的生物学功能（1）RNA结合基序蛋白3与应激许多应激原(如冷刺激、缺血、缺氧等)作用到动物机体能够诱导机体内RBM3的表达。轻度低温能够降低哺乳动物细胞中总蛋白的合成，但在这种情况下一些蛋白的合成被诱导，其中就包括RBM3。RBM3在动物机体内作为mRNA的分子伴侣通过调节机体内蛋白质的[32-34]翻译发挥自我调节的能力。当应激原作用于细胞时，如低温、缺氧和退化性疾病，细胞[5,35]内的RBM3表达量上升，它可能会减少细胞凋亡和坏死。很多冷暴露引起的生理性效应与热应激细胞很相似。这些生理性效应包括：蛋白的变性和聚集增加、细胞周期的进展减慢、机体内的转录和翻译受到抑制、细胞骨架发生破裂、膜的通透性发生改变(例如脂质双分子层的改变)。[36]2001年ChappellSA等人研究发现，在轻度低温条件下RBM3序列能够通过一个内部核糖体进入位点(IRES)调节帽子依赖的翻译过程。当单细胞暴露于轻度低温条件下时，细胞内Rbm3在mRNA水平和蛋白水平均增加，在环境温度较低的条件下这个IRES的活性增加。与37℃相比，当细胞处于33℃条件下时IRES的活性增加5倍。轻度低温对翻译的这些影响不是通过降低细胞生长率来实现的，因为在血清缺乏的条件下不出现相似的现象。[37]DresiosJ等人在2005年研究证实了在轻度低温条件下，富含甘氨酸的RBM3表达量增加抵御寒冷对机体造成的影响，同时研究人员还发现RBM3在低温下具有部分阻滞微小RNA活性的功能。微小RNA(microRNA，简称miRNA)是动物机体内大小约为20-23个核苷酸的非编码小RNA，它通过与靶mRNA进行互补配对从而对基因的表达在转录后水平上进行负调控，翻译抑制或导致mRNA的降解。miRNAs在不同的细胞活动中发挥着重要的作用，动物机体通过miRNAs对体内蛋白的翻译产生影响。虽然冷应急蛋白与microRNAs之间的联系是微弱的，但是当RBM3过表达时会引起部分microRNA的广泛变更。这个变[43]更是正常和冷应急条件下调节总蛋白合成的稳态机制的一部分。2007年，Gammell等人用实验证明了RBM3是细胞低温性能的重要组成部分，温度变动时RBM3改变miRNA的表达并且调节蛋白质的合成。[38]2011年，Wellmann等人通过研究发现，低温应激时神经元的RBM3上调在低温诱导的神经保护中占有重要的作用。低温诱导的RBM3表达与初期神经元的保护和保护神经元细胞系的被迫凋亡有关，在神经元细胞中应用RNA干扰技术使RBM3表达封闭，低温下神经保护作用减弱，如果使RBM3过表达，则使caspase-3的活性受到抑制，从而抑制细胞的凋亡，增强对神经元的保护作用。（2）RNA结合基序蛋白3与细胞保护作用机制[39]Holcik等人在1999年发现，RBM3可保护细胞避免死亡，其作用方式可能与X-连锁凋亡抑制相似。随着RBM3作用机制研究的不断深入，Hiroko等人在2002年发现，RBM3基因过表达能够阻断由多聚谷氨酰胺诱导的神经元细胞凋亡，保护细胞对抗细胞凋亡。随后6 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述[5]Wellmann等人在2004年发现RBM3能够对抗有害刺激对细胞进行保护细胞，同时，他们还发现并证明了RBM3的表达与细胞因子依赖的增值有关。免疫组化分析表明，在多种恶性增殖组织中RBM3表达强烈但是在静止细胞和终末分化细胞中低表达。RBM3在遭受血清剥夺和接触抑制接近平行增值率的成纤维细胞和人胚肾细胞(HEK293)中表达量升高。siRNA介导的RBM3基因沉默减少了细胞活力最终导致细胞死亡，这个过程不涉及caspase-3介导的细胞凋亡，细胞周期停止或COX-2调节。相反，RBM3过表达可以挽救血清缺乏条件下的细胞死亡，此过程伴随着翻译效率的增加。总之，RBM3是一个至关重要的因素在不利微环境下提供细胞生存优势，可能是通过补充翻译效率来实现的。（3）RNA结合基序蛋白3与增殖当环境温度为37℃和32℃时，RBM3通过结合60s核糖体亚基并影响多核糖体纵切面图来直接影响翻译从而影响总蛋白合成，其中多核糖体纵切面图反应新生蛋白的合成。此蛋+白与增殖相关。例如，纯化的CD34细胞中RBM3蛋白含量上升，说明RBM3在红细胞生成增殖过程中起到重要作用。在神经元细胞中，与表达Ki67的细胞相关联的区域RBM3蛋白含量升高，Ki67是公认的增殖标记。由此可见，RBM3在增殖过程中有重要的作用。（4）RNA结合基序蛋白3与骨骼肌调节冷诱导RNA结合蛋白(RBM3)参与骨骼肌存活的调节。肌肉丢失过程中涉及到细胞死亡途径，学者们对C(2)C(12)肌母细胞(成肌细胞)中RBM3在肌肉凋亡中的作用进行了研究。研究人员通过冷应激(32℃放置6h)或者瞬时转染有原癌基因标记的RBM3表达载体。通过H2O2(1000μM)或者星孢菌素(StSp，5μM)诱导细胞死亡，结果表明与常温和转染空载体组相比低温应激和RBM3转染可以减弱形态学的改变和增加细胞活力。在冷应激组和RBM3转染组没有观察到细胞增殖的变化。在过氧化应激中DNA断裂没有增加并且细胞渗透性分析表明过氧化应激中的细胞死亡好像是坏死而不是凋亡。RBM3过表达可以减少StSp应激中的凋亡和膜电位崩解。并且当RBM3过表达时，在StSp应激中caspase-3，caspase-8和caspase-9活性的增加会回落到空白对照水平。这些结果表明RBM3表达的增加可以降低肌肉细胞的坏死和凋亡，因此在肌内萎缩和其他肌肉疾病的肌细胞活力丢失中RBM3有潜在的开发价值。（5）RNA结合基序蛋白3与生殖发育Y-染色体上的基因YRRM/RBM1和DAZ是无精子症因子，它控制人类精子发生的候[40-41]选基因。RBM3编码蛋白质的氨基酸与YRRM/RBM1的同源性为51%，并且RBM3与[42]YRRM/RBM1基因相关的功能有关。研究人员发现，在成年小鼠的睾丸支持细胞中检测到RBM3mRNA和蛋白，但在生殖细胞，生精小管的各个阶段都没有检测到。RBM3蛋白在胎儿睾丸支持细胞中未观察到表达，但在新生儿和衰老的小鼠中观察到表达。因此RBM3可能在精子的发生过程中扮演着重要的角色。（6）RNA结合基序蛋白3与疾病发生[43]基于多种原因，研究学者认为RBM3是一个潜在的原癌基因：(1)RBM3能够增加环氧化酶2(COX-2),VEGF和IL-8mRNAs的稳定性和翻译。(2)RBM3过表达可以诱导NIH3T37 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述细胞以不依赖于贴壁的方式生长。(3)RBM3与HuR相互作用，HuR是另一个RNA结合蛋白，它通过与快速下降的转录物(比如COX-2)的3’-UTR结合介导核质穿梭。(4)通过基因沉默技术siRNA方法沉默RBM3，增加处于G2/M期的细胞数量，并且导致凋亡。(5)RBM3表达水平依赖于肿瘤所处的阶段，表明这个蛋白可能在肿瘤发生中行使功能。1.4本实验中涉及的主要技术1.4.1慢病毒载体慢病毒载体是一种以人类免疫缺陷病毒-1(humanimmunodeficiencyvirustype-1，HIV-1)为来源的病毒载体，它含有病毒包装、质粒转染和基因整合所需要的一系列遗传信息，是慢病毒载体系统的重要组成部分。携带有目的基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒和细胞系的辅助下，通过病毒包装过程产生具有感染力的病毒颗粒，然后病毒颗粒通过感染组织细胞或动物机体，使目的基因在组织细胞或动物机体中的表达。慢病毒载体与其他病毒载体系统相比，它不仅可以整合到宿主基因组中，实现基因长效稳定的表达，而且它还拥有免疫原性低、[44]感染效率高等特点。主要的慢病毒载体系统有4种类型，分别是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)载体系统、人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)载体系统、猿类免疫缺陷病毒(simianimmuno--deficiencyvirus，SIV)和猫免疫缺陷病毒(felinesimmunodeficiencyvirus，FIV)。其中HlV-1型病毒载体系统是被学者们研究和利用得最为深入和广泛的。在HIV-l型慢病毒载体被用于实验研究的过程中，病毒载体中的野生型病毒基因组中的致病基因在逐步的改造过程中被剔除，改造过程包括去除了3’端的LTR区域中的U3反式功能基因序列，使得该区的转录能力降低，并由目的基因来代替，构建成灭活、缺陷型载体系统。这个系统不仅保留了野生型病毒基因的顺式作用原件LTR，包装信号(Ψ)和Rev基因的反式原件，而且又去除了vif、vpr、vpu、nef等致病基因，因此使之不能形成完整的病毒颗粒，从而保证了载体的生物安全性。1.4.2Gateway载体系统Gateway技术是Invitrogen公司开发研制的一种克隆技术，它能够将一个或多个基因克隆到任何蛋白表达系统。这项技术简化了基因克隆和亚克隆的实验步骤，当目的基因在不同的表达载体之间穿梭时，能够保证目的基因连入表达载体方向的正确性。Gateway技术也能够表达带有不同数目纯化和检测的标签。Gateway技术是基于已研究透彻的人嗜菌体位点特异重组系统(attB×attP→attL×attR)，所以在目的基因连入入门载体后，不需要使用限制性内切酶和连接酶将其连入表达载体中，一旦拥有了一个入门克隆载体，就能够重复利用这个载体转移目的基因到Gateway技术改造过的各种表达载体中(目的载体)。Gateway表达克隆是由BP反应和LR反应两步构成的，第一步是BP反应，它是利用一个attBDNA片段与一个attP供体载体之间进行重组反应，形成入门克隆，将目的基因连入入门载体。第二步是LR反应，它是一个attL入门克隆和一8 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述个attR目的载体在GatewayLR反应克隆酶的作用下进行重组反应，产生重组表达克隆载体。LR反应可以在平行的反应中将目的基因序列转移到一个或多个目的载体中，进行多次重复利用。表达克隆载体可以应用在合适的宿主细胞或组织中进行蛋白的表达和分析。1.5研究的目的与意义RBM3蛋白是一种具有潜在研究价值的多功能蛋白质，它不仅在对抗缺氧、寒冷等有害刺激时表达量升高用以保护细胞，而且它在肿瘤、癌症的发生、肌肉疾病的治疗上都具有开发价值。本研究的目的是构建含有RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的重组慢病毒表达载体，产毒感染ST细胞，评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果，以实验研究的成果作为以后研究组织细胞中的RBM3的功能及应用的基础。9 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建第二章重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的构建RNA结合基序蛋白3(RBM3)是学者在哺乳动物细胞中发现的一种重要的冷休克蛋白。研究人员发现RBM3存在于多种动物机体组织内，是维持动物机体正常生命活动的蛋白。当动物处于正常的状态时，机体内的RBM3蛋白含量很少，但当受到寒冷、缺氧、缺血等刺激时其会被诱导大量表达。如果应用实验技术能够在动物不受刺激的情况下提高细胞内RBM3蛋白的含量，将会给RBM3蛋白的生理学研究提供有力的保证。本研究应用分子生物学手段从仔猪脾脏组织中扩增得到大小为551bp的RBM3蛋白的基因序列，并将其成功连接到慢病毒载体pLenti6/v5-DEST上，获得表达质粒pLenti6/v5-RBM3，为以后研究组织细胞中的RBM3的功能及应用奠定基础，也为下一步获取重组慢病毒液提供准备。2.1材料2.1.1实验动物2-3月龄健康的长白仔猪，取其脾脏组织于液氮中放置一天后保存于-80℃待用。2.1.2质粒、菌种来源大肠杆菌菌株E.coliDH5α由本实验室提供；pENTR-11质粒、pLenti6/v5-DEST和pLenti6/v5-GFP质粒均为暨南大学馈赠。2.1.3主要化学试剂及仪器设备(1)主要化学试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；DEPC购自Sigma公司；反转录酶购自天跟生化科技(北京)有限公司；Oligo(dT)18、Taq酶、限制性内切酶XhoI、BamHI、标准核算分子量DL-2000marker，DL-5000marker均为大连宝生物公司产品；2×TaqMasterMix(含染料)购自康为世纪公司；琼脂糖、氨苄青霉素、卡纳霉素购自Spanish公司；pGEM-TEasy、T4连接酶购自Promega公司；琼脂粉、胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)均购于OXOID公司；质粒小量提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；LRClonase酶、杀稻瘟菌素(Blasticidin)均购自美国invitrogen生命技术公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。引物合成和测序均由上海生物技术服务有限公司完成。(2)主要仪器设备超净工作台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司核酸蛋白定量仪：美国伯乐公司10 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建电泳槽：电泳仪北京六一仪器厂紫外凝胶成像系统：美国伯乐公司PCR仪：P×ThermalCycler美国台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司电热恒温水浴锅：上海国华电器有限公司旋窝振荡器：上海医疗器械五厂电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司恒温循环器：北京德天佑科技发展有限公司超纯水仪：力新仪器上海有限公司-80℃超低温冰箱(ultralowtemperaturefreezer)：英国NewBrunswickScientific公司锥形瓶，广口瓶，试管，离心管，PCR管，液氮罐，手术剪，手术刀，镊子等。2.2方法2.2.1引物设计与合成根据猪RNA结合基序蛋白3的基因序列(GenBank登录号为:NM_001243419)，采用PrimerExpress软件设计用于扩增编码RBM3基因的特异性引物，引物大小为551bp。上游引物RBM3Forward：5’-cgggatccctgccatgtcctctgaagaag-3’，下游引物RBM3Reverse：5’-ccgctcgagacagccatttggaaggacg-3’，经BLAST软件分析说明，设计的引物具有良好的引物特异性，可用作后续试验，并委托上海生物工程技术服务有限公司合成此引物。2.2.2组织中总RNA的提取RNA提取的准备工作：将研钵、研棒、镊子，手术刀，手术剪，药匙放入牛皮纸袋中，和1000mL烧杯，棕色瓶一起放于180℃烘烤5h，待冷却后取烘烤过的烧杯配制0.1%的DEPC水，充分搅拌至无油滴后静置过夜。取一部分DEPC水至广口瓶中高温高压灭菌后用于配制75%乙醇。剩余DEPC水无需灭菌处理，直接用于浸泡枪头、EP管等，取出浸泡过夜后的枪头、EP管(尽量敲干上面的水)，放入已用75%乙醇擦洗过的饭盒、枪头盒中，高温高压灭菌后烘干待用。提取RNA中所用的氯仿、异丙醇、75%乙醇配制好后放于棕色瓶中4℃保存。(1)75%乙醇擦拭超净台台面，紫外灭菌50min。(2)液氮研磨组织：取米粒大小冻存仔猪脾脏组织块放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状，用药匙刮取组织粉末放入已加入1mLtrizol(原存于4℃)的EP管中，反复颠倒混匀至溶解。室温静置10min以充分裂解。(3)加入200μL预冷的氯仿，剧烈振荡混匀后室温静置10min，再置于4℃离心机中12000rpm离心15min。样品分三层，黄色的有机层，中间层和上层水相，RNA存在于上层水相中。11 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建(4)转移上清入新的EP管中，并加入等体积的预冷异丙醇，混匀后于-20℃静置1h以增加RNA沉淀，之后置于4℃离心机中12000rpm离心10min后弃上清。(5)用1mL75%乙醇洗涤沉淀，温和振荡，悬浮沉淀后置于4℃离心机中8000rpm离心5min后弃上清，收集沉淀。(6)室温干燥5-10min，不可过干。(7)用25μLDEPC水溶解RNA沉淀，如暂时不用可保存于-80℃。(8)用核酸蛋白定量仪测RNA浓度和A260/A280比值，要求其数值在1.8-2.0之间。(9)1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取情况：称取0.2g琼脂糖加入20mL1×TAE缓冲液，微波炉中加热，煮沸两次，冷却至50℃左右，加入少量EB混匀后倒入插有梳子的胶槽中，呆胶凝固后拔下梳子放入盛有1×TAE缓冲液电泳槽中，取5μLRNA样品与适量6×loadingbuffer混匀后加入胶孔中进行电泳。电泳停止后将凝胶放在紫外凝胶成像系统下观察并拍照。(10)RNA定量：根据测得的RNA浓度计算出1-5μgRNA所需要RNA的体积，使反转录时RNA的浓度保持一致。2.2.3目的基因的制备以仔猪脾脏组织总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物进行反转录反应。反转录反应体系如表2-1所示。表2-1反转录反应体系Table2-1SystemofReverseTranscriptionReaction试剂加样量TotalRNA1-5μgOligo(dT)18(50pmol/μL)2.0μLSuperPuredNTP(2.5mMeach)2.0μLRNase-FreeddH2O定容至14.5μL5×First-StrandBuffer(含有DTT)4.0μLRNasin0.5μLTIANScriptM-MLV1.0μL总体积20.0μL反转录反应条件为：根据上表加入RNA、Oligo(dT)18、SuperPuredNTP和RNase-FreeddH2O后，70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min。瞬时离心数秒使反应液聚集于管底，然后加入5×First-StrandBuffer，Rnasin和TIANScriptM-MLV，42℃温浴50min后95℃加热5min，立即置于冰上进行后续实验或-20℃冷冻保存。以反转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系如表2-2所示。12 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建表2-2PCR扩增体系Table2-2SystemofPCRamplification试剂加样量RT产物1.0μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLRnase-FreeWater10.5μL总体积25.0μL对PCR反应TM值和循环数等进行优化后得出RBM3的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。2.2.4目的基因的回收与纯化将含有目的基因的PCR产物加入到1%的琼脂糖凝胶块中，电泳至目的基因完全分离后停止电泳，将凝胶置于紫外灯照射下切取含有目的基因DNA片段的凝胶条，然后按照以下操作对目的基因进行纯化。(1)将胶条放入干净的离心管中，称取胶条重量。(2)向离心管中加入3倍体积的溶胶液(如果凝胶条重量为0.1g，其体积可视为100μL，则加入300μL溶胶液)，55℃水浴放置10min，并在期间不断的温和上下翻转离心管，以确保胶条的充分溶解。(3)将上述所得溶液温度降至室温后加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，将其放入离心机中13000rpm离心30-60s，然后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。(4)向吸附柱中加入700μL漂洗液，将其放入离心机中13000rpm离心30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入500μL漂洗液，将其放入离心机中13000rpm离心30-60s，倒掉废液。(6)将离心吸附放回收集管中，将其放入离心机中13000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱开盖1-2min，晾干。(7)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中吸附膜中间位置悬空滴加100μL经65℃预热的洗脱缓冲液，室温静置2min，将其放入离心机中13000rpm离心2min，收集纯化的DNA溶液并将DNA产物于-20℃保存。2.2.5感受态细胞的制备(1)将-80℃保存的DH5α化冻，用接种环取少量在无抗性的LB琼脂平板上划线，于37℃培养箱中倒置培养过夜。(2)次日从琼脂平板上挑取单菌落接种于5mL液体LB培养液试管中，37℃振荡培养过13 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建夜。(3)取0.5mL菌液转移到一个含有50mL液体LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h，至OD600值为0.3-0.4之间。(4)4℃下5000rpm离心5min，弃上清后加入1/10体积预冷的TSS缓冲液，吹吸悬浮细胞后置于冰上。(5)将菌液以200μL/管分装后置于-80℃保存，即为感受态细胞。(6)取一管进行质粒转化检测。2.2.6目的基因RBM3与T载体的连接及转化(1)目的基因RBM3与T载体的连接短暂离心PGEM-TEasy载体及DNA插入对照管，使内容物汇集到管底。然后按照表2-3连接体系建立连接反应。表2-3连接体系Table2-3Systemofconnection试剂标准反应阳性对照背景对照T4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液5.0μL5.0μL5.0μLPGEM-TEasy(50ng)1.0μL1.0μL1.0μL回收的PCR产物3.0μL0μL0μL插入DNA对照0μL2.0μL0μLT4DNA连接酶1.0μL1.0μL1.0μL补加去离子水至终体积10.0μL将上述混合液用移液器吹打使之混匀后，4℃孵育过夜。(2)重组质粒的转化离心数分钟使连接反应产物汇集到管底，取2.0μL连接反应产物加到置于冰上的1.5mL离心管中，同时从-80℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，放置在冰浴直至融化(5min左右)，轻轻振动离心管使之混匀。将感受态细胞加入到放有连接产物的转化管中，轻轻振动转化管混匀，冰浴20min。然后将其放入42℃水浴中热击45-50s(不要振动)，迅速转移到冰浴中冷却2min。随后向管中加入1mL经过37℃预热的LB培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(150rpm)1.5h。将转化培养基涂到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，在超净台上正面向上放置1h，待完全吸收后放置在37℃培养过夜(16-24h)，后贮存在4℃。同时做两个对照组，对照1组：以同体积的无菌水代替DNA溶液，其他同上正常情况下此组在含抗生素的LB平板上不会出现菌落；对照2组：以同体积的无菌水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布在不含抗生素的LB平板上，正常情况下产生大量菌落。2.2.7质粒的提取用无菌枪头挑取单菌落接种于4mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃14 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建振荡培养过夜(12-16h)。(1)将振荡培养的菌液加入1.5mLEP管中，12000rpm离心1min，弃上清。在吸水纸上扣干水滴，使菌沉淀尽量干燥。(2)加入250μL溶液Ⅰ，振荡混匀，悬浮细菌细胞沉淀。(3)加入250μL溶液Ⅱ，温和上下颠倒混匀5-10次，作用不超过5min。(4)加入350μL溶液Ⅲ，温和快速翻转混合6-8次直至出现白色絮状沉淀，将其放入离心机中12000rpm离心10min。(5)将上清液加入吸附柱中，室温静置2min，将其放入离心机中12000rpm离心1min，弃掉废液。(6)向吸附柱中加入漂洗液700μL，将其放入离心机中12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。(7)向吸附柱中加入漂洗液500μL，将其放入离心机中12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。(8)将其放入离心机中12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，敞口室温晾干数分钟。(9)将吸附柱放到新的离心管中，悬空滴加经过65℃预热的200μL洗脱液，室温静置1min，将其放入离心机中12000rpm离心1min得到质粒溶液。2.2.8重组克隆载体的鉴定(1)重组克隆载体的PCR鉴定以连有目的基因的T载体重组质粒为模板进行PCR扩增，反应体系如表2-4所示。表2-4PCR反应体系Table2-4SystemofPCRamplification试剂加样量质粒0.5μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLRnase-FreeWater10.0μL总体积25.0μLPCR反应条件与2.2.3中PCR反应条件相同，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(2)重组克隆载体的酶切鉴定通过XhoI、BamHI对含有目的基因RBM3的重组质粒进行双酶切鉴定，反应体系如表2-5所示。15 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建表2-5双酶切体系Table2-5Systemofdoubleenzymeexcision试剂加样量10×KBuffer2.0μL重组质粒3.0μLXhoI1.0μLBamHI1.0μL补加灭菌水至终体积20.0μL将反应物混匀后，37℃水浴1h，酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(3)重组克隆载体的序列测定及其分析将初步鉴定为阳性的菌液培养过夜后加入50%的甘油，送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析。2.2.9目的基因RBM3与入门载体的连接及转化通过XhoI、BamHI对含有目的基因RBM3的重组质粒和入门载体pENTR-11进行双酶切，反应体系如表2-6所示。表2-6双酶切体系Table2-6Systemofdoubleenzymeexcision试剂加样量10×KBuffer2.0μL重组质粒/pENTR-113.0μLXhoI1.0μLBamHI1.0μL补加灭菌水至终体积20.0μL将反应物混匀后，37℃水浴1h，利用2.2.4方法对目的基因和入门载体进行回收和纯化，然后按照表2-7连接体系对目的基因和和入门载体进行连接反应。表2-7连接体系Table2-7Systemofconnection试剂标准反应T4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液5.0μL回收的pENTR-111.0μL回收的目的基因产物3.0μLT4DNA连接酶1.0μL补加去离子水至终体积10.0μL将上述混合液用移液器吹打使之混匀后，4℃孵育过夜。然后用2.2.6中的方法将连接产+物转化入感受态细胞DH5α，将已转化的感受态细胞DH5α均匀涂抹到100μg/mLKan抗性16 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建的LB平板上，37℃培养过夜。然后挑取若干单菌落,摇菌提取质粒。2.2.10重组入门载体pENTR-RBM3的鉴定(1)重组入门载体pENTR-RBM3的PCR鉴定以重组入门载体pENTR-RBM3为模板进行PCR扩增，反应体系如表2-8所示。表2-8PCR反应体系Table2-8SystemofPCRamplification试剂加样量pENTR-RBM30.5μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLRnase-FreeWater10.0μL总体积25.0μLPCR反应条件与2.2.3中PCR反应条件相同，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(2)重组入门载体pENTR-RBM3的酶切鉴定通过XhoI、BamHI对含有目的基因RBM3的重组入门载体pENTR-RBM3进行双酶切鉴定，反应体系如表2-9所示。表2-9pENTR-RBM3双酶切体系Table2-9SystemofpENTR-RBM3doubleenzymeexcision试剂加样量10×KBuffer2.0μLpENTR-RBM33.0μLXhoI1.0μLBamHI1.0μL补加灭菌水至终体积20.0μL将反应物混匀后，37℃水浴1h，酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(3)重组入门载体pENTR-RBM3的序列测定及其分析将初步鉴定为阳性的菌液培养过夜后加入50%的甘油，送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析。利用BioXM软件将所测得的基因序列同之前扩增的RBM3序列进行比对，结果达到100%相同，证明重组所得的入门载体pENTR-RBM3可以用于后续试验。2.2.11慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3将测序正确的重组入门载体pENTR-RBM3与目的慢病毒载体进行LR反应。反应体系17 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建如表2-10所示。表2-10LR反应体系Table2-10SystemofLRamplification试剂加样量pENTR-RBM3(150ng/µl)1.0μLpLenti6-V5-DEST(150ng/µl)0.5μLTEBuffer2.5μLLRClonase1.0μL总体积5.0μL将反应物混匀后，25℃孵育过夜后加入1.0µL蛋白酶K终止反应，稍微震荡。37℃孵育10min。然后用2.2.6中的方法将2.0μLLR反应产物转化入感受态细胞stb31中，于100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin)和50μg/mL杀稻瘟菌素(Blasticidin)的LB琼脂糖平板培养，37℃培养过夜。然后挑取若干单菌落,摇菌提取质粒。2.2.12重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的鉴定(1)重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的PCR鉴定以重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3为模板进行PCR扩增，反应体系如表2-11所示。表2-11PCR反应体系Table2-8SystemofPCRamplification试剂加样量plenti6/v5-RBM30.5μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLRnase-FreeWater10.0μL总体积25.0μLPCR反应条件与2.2.3中PCR反应条件相同，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(2)重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的酶切鉴定通过XhoI、BamHI对重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3进行双酶切鉴定，反应体系如表2-12所示。18 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建表2-12pLenti6/v5-RBM3双酶切体系Table2-12SystemofpLenti6/v5-RBM3doubleenzymeexcision试剂加样量10×KBuffer2.0μLpLenti6/v5-RBM33.0μLXhoI1.0μLBamHI1.0μL补加灭菌水至终体积20.0μL将反应物混匀后，37℃水浴1h，酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(3)重组入门载体pLenti6/v5-RBM3的序列测定及其分析将初步鉴定为阳性的菌液培养过夜后加入50%的甘油，送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析。利用BioXM软件将所测得的基因序列同之前扩增的RBM3序列进行比对，结果达到100%相同，证明重组所得的慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3可以用于后续细胞转染试验。2.3结果2.3.1总RNA的检测从冻存的仔猪脾脏组织中提取总RNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测(图2-1)结果：可见28S、18S及5S三条条带，如图所示所提取的组织RNA基本未降解，且RNA的A260/A280数值经核酸蛋白定量仪检测所得为1.8，以上结果均显示所得RNA样品符合RT-PCR反应要求，可以用于后续试验。28S18S5S图2-1仔猪脾脏组织总RNA提取结果Fig.2-1TotalRNAofthespleentissueofpig2.3.2cDNA的RT-PCR检测以提取的冻存仔猪脾脏组织样中总RNA反转录合成的第一条链cDNA为模板进行PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测得到片段大小为551bp的DNA片段(图2-2)，未见非特异性19 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建片段。2.3.3重组克隆载体的鉴定以连接RBM3基因的T载体为模板进行PCR反应，鉴定得到551bp的DNA片段(图2-2)，未见非特异性片段。将连接RBM3基因的T载体进行双酶切，得到3015bp和551bp的DNA片段(图2-2)。图2-2RBM3基因的扩增及连有RBM3基因T载体的鉴定结果Fig.2-2TheRT-PCRamplificationofRBM3andtheevaluationoftheTvectorcontainingRBM3M:DL2000Marker.1:仔猪脾脏组织中RBM3基因的RT-PCR检测结果.2:RT-PCR的空白对照组.3:连接RBM3基因的T载体的PCR检测结果.4:PCR鉴定的空白对照组.5:连接RBM3基因的T载体的酶切检测结果.6:酶切鉴定的空白对照组.M:DL2000Marker.1:theRT-PCRresultofRBM3expressioninspleentissueofpig.2:blankgroupofRT-PCR.3:thePCRresultoftheTvectorcontainingRBM3.4:blankgroupofPCR.5:thedoubledigestionresultoftheTvectorcontainingRBM3.6:blankgroupofdoubledigestion.扩增的RBM3基因的测序结果如下：ATGTCCTCTGAAGAAGGGAAGCTCTTCGTGGGAGGGCTCAACTTCAACTCAGATAAGCAGGCTCTGGAAGACCACATCAGCAGTTTCAGACCTATTTCTGAGGTGGTCATTGTCAAGGACCGGGAGACTCAGCGATCCCGGGGTTTTGGCTTCATTACCTTCACCAATCCAGAGCATGCTTCAAATGTAATGAGAGCCATGAATGGAGAGTCTCTGGATGGTCGCCAGATCCATGTGGACCACGCTGGCAAGTCGGCCCAGGGAACAAGAAGGGGTGCCTTTGGGGCCCGTGGTCGTGGCTACTCTAGAGGTGGAGGGGAGCAGGGCTCTGGAAATGGCAGATATGACAGTCGACCTGGAGGATATGTCTACAGATATGGATATGGAAAGTCCAGAGACTATGGCAGCAGAAGCCAGGGTAGTTATGACAGCTATTCAGGACGAAATTGCAGGGACAATTACGACAACTGA利用BioXM软件将所测得的基因序列同GenBank上公布的猪RBM3基因的编码序列进行比对同源性接近96%，证明克隆所得的序列可以用于后续试验。20 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建2.3.4重组入门载体pENTR-RBM3的鉴定以重组入门载体pENTR-RBM3为模板进行PCR反应,鉴定得到551bp的DNA片段(图2-3)，未见非特异性片段。将重组入门载体pENTR-RBM3进行双酶切,得到2300bp和551bp的DNA片段(图2-3)。图2-3重组载体pENTR-RBM3的鉴定结果Fig.2-3TheevaluationoftherecombinantvectorpENTR-RBM3M:DL2000Marker.1:重组载体pENTR-RBM3的PCR检测结果.2:PCR鉴定的空白对照组.3:重组载体pENTR-RBM3的酶切检测结果.4:酶切鉴定的空白对照组.M:DL2000Marker.1:thePCRresultoftherecombinantvectorpENTR-RBM3.2:blankgroupofPCR.3:thedoubledigestionresultoftherecombinantvectorpENTR-RBM3.4:blankgroupofdoubledigestion.2.3.5重组慢病毒载体的鉴定以重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3为模板进行PCR反应，鉴定得到551bp的DNA片段(图2-4)。将重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3进行双酶切，得到8688bp和551bp的DNA片段(图2-4)。21 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建图2-4重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的鉴定结果Fig.2-4TheevaluationoftherecombinantvectorpLenti6/v5-RBM3M:DL2000Marker.1:重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的PCR检测结果.2:PCR鉴定的空白对照组.3:重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的双酶切检测结果.4:酶切鉴定的空白对照组.M:DL2000Marker.1:thePCRresultoftherecombinantvectorpLenti6/v5-RBM3.2:blankgroupofPCR.3:thedoubledigestionresultoftherecombinantvectorpLenti6/v5-RBM3.4:blankgroupofdoubledigestion.2.4讨论RNA结合基序蛋白3(RBM3)是哺乳动物体内被发现最早的冷休克蛋白之一，1997年Danno等人在人类胎儿的脑组织中发现了RBM3的存在，并且对这个冷休克蛋白进行了分[24]离鉴定，RBM3是哺乳动物体内重要的冷休克蛋白，近些年来，越来越多的学者致力于对它的结构及功能的研究，并发现它是一种结构高度保守且富含甘氨酸的RNA结合基序蛋白。RBM3包括二个结构域：一个是RNA识别基序(RRM)，它在不同的物种之间高度保守；另一个是富含精氨酸，甘氨酸，和酪氨酸的羧基末端区域。RBM3能够与DNA和RNA结合，有研究表明当RBM3过表达时会引起部分microRNA的广泛变更，而这种改变能够调节机体正常状态下和冷应激状态下总蛋白的合成，RBM3作为一种分子伴侣，在动物受到冷应激时调节mRNA的翻译，从而影响蛋白质的合成。RBM3在仔猪多种组织中表达，例如睾丸、小脑、肺、脾、肠和子宫组织，并且睾丸和小脑等组织内高表达，但在心脏、甲状腺中则不表达。基于上述研究，本实验选用仔猪脾脏组织对RBM3基因片段进行扩增。近些年来，学者研究了多种将目的基因导入靶细胞的方法，包括真核表达质粒的转染和病毒载体介导的基因转移法等。在这些方法中，研究人员最常应用于实验研究的方法是真核表达质粒的转染方法，因为这种方法对于分裂增殖比较旺盛的体外培养细胞的转染效果最好，但随表达质粒进入细胞的目的基因常常随培养时间的延长而发生丢失。以往学者们研究介导外源基因在真核细胞表达时大多采用腺病毒及腺相关病毒载体。腺病毒载体虽然能够感染非分裂细胞，但它不能整合到宿主细胞的基因组中，而且腺病毒载体还容易引起机体免疫炎症的反应，不能保证基因长效稳定的表达，目的基因的表达也会随着时间的延长而减退，表达量在2-3天的时候达到最大值，但是培养一周之后就会消失.。腺相关病毒的优点是没22 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章重组慢病毒载体pLenti6-RBM3的构建有致病性也不会引起免疫反应，而且还能将目的基因整合入宿主细胞的基因组中，使目的基因持续稳定的表达，但是这种转染方法的实验的制约性很大，它只能携带很小的基因片段，缺少高效的包装细胞也是制约因素之一。本研究选用了真核表达质粒中的慢病毒载体pLenti6/v5-DEST作为目的基因RBM3的表达载体，因为慢病毒载体是在HIV-1病毒基础上进行改造而形成的病毒载体系统，重组的慢病毒载体系统能够将目的基因导入目的细胞中。慢病毒载体基因组是正链RNA，当慢病毒基因组进入目的细胞后，它被自身携带的反转录酶反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到目的细胞的基因组中。慢病毒载体能够转移大片段的基因进入目的细胞内而且不易引起宿主的免疫反应具有良好的安全性。它不仅能感染分裂细胞，也能高效的感染非分裂细胞，如神经细胞、肝细胞、造血干细胞和肌纤维细胞等。希望通过此方法让目的基因能够在细胞中高效表达，收集到高感染效率的重组慢病毒液。同时，本研究还应用了Invitrogen公司的Gateway技术，该技术是基于λ嗜菌体位点特异重组系统。采用的LR重组酶所进行的LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应，可在平行的反应中能够快速、定向地将目的基因序列转移到一个或更多个Gateway化的目的表达载体上，这项技术简化了基因的克隆和亚克隆的步骤，在实验过程中不再需要任何的限制内切酶和连接酶对其进行酶切和连接反应，只需要利用重组酶就能够达到目的基因在表达载体之间穿梭的目的，并且保证了连接方向的准确性，简化了实验操作。本研究采用LR反应将pENTR-RBM3载体上的RBM3基因成功平行转移到pLenti6/v5-DEST表达载体上，并经测序验证，实验验结果表明成功构建了重组慢病毒质粒pLenti6/v5-RBM3。2.5小结(1)利用RT-PCR方法成功从仔猪脾脏中扩增得到了仔猪的RBM3基因。(2)成功将RBM3基因连入克隆载体T载体中。(3)成功将RBM3基因连入入门载体pENTR-11中，构建了入门载体pENTR-RBM3。(4)通过LR反应，将入门载体pENTR-RBM3与目的载体pLenti6/v5-DEST进行重组反应，将RBM3基因平行转移到了表达载体pLenti6/v5-DEST，成功构建了重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3。23 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定第三章重组慢病毒的制备及滴度测定慢病毒是一群形态特征相似、生化特点相近、基因组结构相似的一类免疫缺陷性病毒，慢病毒载体可以整合到宿主基因组，实现目的基因稳定长效的表达，并且其具有免疫原性低、感染效率高的特点。重组慢病毒离开包装细胞后病毒颗粒仅能转导细胞,但不能自我复制,这为其安全性提供了更有效的保证。由于慢病毒载体的这些特点，它已经逐渐受到了学者的关注，成为将目的基因导入细胞的理想载体。本实验将慢病毒载体通过转染进入293T细胞内，产生重组慢病毒，并对其病毒滴度进行测定，为后续重组慢病毒液感染ST细胞实验提供保证。3.1材料3.1.1细胞来源人胚肾细胞系293T细胞由本实验室提供。3.1.2主要化学试剂及仪器设备(1)主要化学试剂琼脂粉、胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)均购于OXOID公司；琼脂糖、氨苄青霉素购自Spanish公司；无内毒素质粒中提试剂盒购自OMEGA公司；胎牛血清(FBS)、TMDMEM、MEM培养液均购自Hyclone公司；ViraPowerPackagingMix购自Invitrogen公司；OPti-MEM、Trypsin购自GIBCO公司。(2)主要仪器设备超净工作台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司核酸蛋白定量仪：美国伯乐公司电泳槽：电泳仪北京六一仪器厂紫外凝胶成像系统：美国伯乐公司电热恒温水浴锅：上海国华电器有限公司电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司细胞培养箱：GSLaboratoryEquipment公司倒置显微镜：NIKONEXLIPSETS100公司荧光显微镜：美国伯乐公司超纯水仪：力新仪器上海有限公司-80℃超低温冰箱(ultralowtemperaturefreezer)：英国NewBrunswickScientific公司锥形瓶，广口瓶，烧杯，1.5mL离心管，细胞培养瓶，96孔板，培养皿，5mL枪头，24 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定冻存管，10mL离心管等。3.2方法3.2.1转染用慢病毒载体质粒的提取(1)在平皿上分别接种验证成功的重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的菌种、pLenti6/v5-GFP的菌种和pLenti6/v5-DEST的菌种，置于培养箱中培养过夜，挑取单菌落至5mL氨苄抗性的培养基中，37℃振荡培养至OD600至0.6左右后接种到100mL的液体氨苄抗性的培养基中继续37℃振荡培养16h左右。(2)收集50mL培养基至50mL离心管中，室温3500-5000×g离心10min。(3)弃去培养基后加入2.5mL的SolutionⅠ/RNaseA到细菌培养物中，漩涡振荡悬浮细菌培养物。(4)加入2.5mL的SolutionⅡ，轻轻颠倒并旋转8-10次至得到澄清的裂解液，室温静置5min。(5)取出LysateClearanceFilterSyrine活塞，将滤器垂直置于架子上。(6)加入1.5mL的N3Buffer，室温孵育3min并间断轻轻颠倒离心管数次至出现絮状沉淀。(7)准备HiBind柱子：将一个HiBind柱子放进15mL收集管中，加入2mLGPS缓冲液，室温静置10min后室温3000-5000×g离心5min，弃去流出液。将柱子重新放回15mL收集管中。(8)立即将裂解液转移到LysateClearanceFilterSyrine中，垂直放置2min，用新的50mL管子收集细菌裂解液，将活塞插到过滤器中并缓慢推动，将裂解液压到收集管中。(9)加入0.1倍体积的ETRsolution到收集管中，轻轻颠倒旋转混匀10次，冰浴20min，并间断颠倒离心管数次。(10)42℃孵育5min，溶液重新变浑浊。室温3000-5000×g离心5min，ETRsolution分层于离心管底部。(11)将上层水相转移到新的15mL离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇。轻轻颠倒旋转混匀10次，室温静置2min。(12)加入3.5mL澄清的裂解液至HiBindDNA柱子中，室温3000-5000×g离心5min，倒掉滤过液。(13)将剩余的裂解液加到柱子上，重复(12)步中的操作。(14)加入3mLBufferHB至柱子中，室温3000-5000×g离心5min，倒掉过滤液并重新放回到收集管中。(15)加入3.5mLDNAWashbuffer至柱子中，室温3000-5000×g离心5min，倒掉滤液。重复此步一次。(16)空柱离心10min(最高转速，不超过5000×g)，以干燥柱子。(17)将柱子放入新的15mL离心管中，加入1mLDNAEndotoxin-FreeElutionBuffer至柱子的基质中，室温静置3min，最高转速(不超过5000×g)离心5min。25 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定(18)弃去上清液，加入3mLTE溶液(含有0.1g/LRNaseA)混匀，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置30min。室温3000–5000×g离心15min。(19)用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，5000×g离心5min，吸净上清，室温干燥。(20)加入适量TE溶液(含有0.1g/LRNaseA)溶解沉淀，37℃水浴孵育15min，彻底降解残余的RNA。(21)1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取情况，用核酸蛋白定量仪测DNA浓度及A260/A280比值，要求其数值在1.8-2.0之间。3.2.2人胚肾细胞系293T细胞的培养（1）人胚肾细胞系293T细胞的复苏①用止血钳从液氮中取出293T细胞冻存管两只，迅速放到37℃水浴锅，轻轻的不停地晃动，直到细胞冻存液完全融化(控制时间在1-2min)。②用75%酒精棉球擦拭冻存管，放入超净台中，将细胞悬液移入15mL离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，吹打混匀后800rpm/min离心5min，弃上清。③加入适量体积的完全培养液(含10%FBS的DMEM细胞培养液)吹打沉淀的细胞，吸取细胞加到细胞培养瓶中，双十字混匀，置于CO2培养箱中37℃培养。④24h后观察细胞的复苏情况，只要有贴壁的细胞就换一次细胞培养液，以除去DMSO。⑤每天为细胞进行半量换液，以维持细胞正常的生长状态。⑥当细胞生长状态良好，贴壁达到80%-90%时进行细胞传代，传代周期为2-3天。（2）人胚肾细胞系293T细胞的传代①用吸管吸出细胞培养瓶中的培养液后，向培养瓶内加入适量PBS液，轻轻晃动培养瓶后倒掉。重复此步骤一次。②加入37℃预热含0.02%EDTA与0.25%Trypsin的细胞消化液，轻轻晃动细胞培养瓶，于37℃培养箱中消化40s后置于显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞质间隙增大时，迅速将细胞液吸出，再让剩余的消化液作用30s后，瓶(一)细胞加入完全培养液终止消化，瓶(二)细胞加入维持液(含2%FBSDMEM细胞培养液)终止消化。③用吸管反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液，吹打部位由上到下，再由左到右，尽量不出气泡。④镜下观察发现贴壁细胞大多数已悬浮于培养液中，成片的细胞已经分散成为小的细胞团或者单细胞，即可停止吹打。6⑤收集悬液进行细胞计数，瓶(一)中的细胞以1×10个细胞密度接种到新的细胞培养瓶5中。瓶(二)中的细胞以1×10个细胞密度接种到35mm小平皿中。（3）细胞计数①取血球计数板，将经过酸处理的盖玻片盖在血球计数槽上。②取适量细胞悬液到一个干净的离心管中，加入同等体积的含0.4%台盼蓝的染液，制成可计数的细胞悬液，活细胞不会被染色。③将待测细胞悬液沿着盖玻片边缘缓慢加入，保证盖玻片下充满细胞悬液，玻片下无气泡，悬液也不能流入边槽中。26 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定④将计数板放在显微镜下观察，数出四大计数方格中活细胞的数目，按照公式：细胞悬4液中细胞数/mL=(四大计数方格中细胞数/4)×2×10计算出悬液的细胞密度。3.2.3重组质粒pLenti6/v5-RBM3转染人胚肾细胞系293T细胞本实验构建的重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3不含有荧光标记，因此为了确保能够得到准确的转染用质粒用量，本实验采用了将重组质粒pLenti6/v5-GFP作为试验的平行对照组进行操作。(1)瓶(二)细胞接种到35mm小平皿中后培养24h，待细胞培养密度达到80%左右时即可用于转染。在进行质粒转染前2h要将细胞培养液换为无血清培养基。TM(2)制备CaPO4-DNA沉淀：准备两组EP管，A管中加入质粒、ViraPowerPackagingMix、CaCl2补加灭菌水，B管中加入相应体积的2×HBS。按照表3-1中组分进行质粒的梯度添加。表3-1转染体系Table3-1systemoftransfection试剂加样量质粒pLenti6/v5-RBM3/pLenti6/v5-DEST/pLenti6/2.0μg3.0μg4.0μg5.0μg6.0μg7.0μg8.0μgv5-GFPTMViraPowerPackaging6.0μg9.0μg12.0μg15.0μg18.0μg21.0μg24.0μgMixCaCl2(1mol/L)24.9μL37.2μL49.5μL62.0μL74.4μL86.8μL99.2μL灭菌水138μL126μL112.5μL99.5μL86.2μL74.5μL60.0μL2×HBS165μL165μL165μL165μL165μL165μL165μLA管中添加试剂后静置5min后，将A管中溶液缓慢的滴加到B管中，同时用另一吸管吹打B管中溶液，整个过程需要缓慢地进行，至少需要持续1-2min。(3)将配制完成的CaPO4-DNA沉淀室温静置30min，至出现细小颗粒沉淀。(4)小心地将沉淀逐滴添加到细胞培养平皿中，十字晃动(此步需迅速完成)。(5)在CO2培养箱中37℃培养6h后，除去培养液，加入含20%FBSDMEM细胞培养液培养48h-72h后于荧光显微镜下观察转染效果。3.2.4病毒的收获及浓缩(1)收集转染后48h-72h的293T细胞上清液。(2)将收集到的细胞悬液放在4℃离心机中，4000g离心10min，收集上清。(3)用0.45μm滤器过滤上清到干净的离心管中。(4)把病毒提取液加入到过滤杯中并盖紧盖子。将过滤杯放入收集管中，放到离心机中4000×g离心10-15min后收集杯中的即为病毒浓缩液。(5)将病毒浓缩液分装到病毒管中，-80℃长期保存，留一支进行病毒滴度的测定。27 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定3.2.5重组慢病毒滴度的测定[45]按Reed-Muench法计算重组慢病毒的TCID50(50%组织培养感染剂量)值。此方法是基于最高稀释度下在细胞中细胞病变的形成。按照以下步骤进行操作。(1)收集一瓶生长状态良好的293T细胞进行计数，计数方法同3.2.2.3中计算方法。5(2)用含有2%血清含量的DMEM细胞培养液准备细胞密度为1×10个细胞/mL的细胞悬液20mL。(3)准备2块96孔板，并在细胞板的每孔内加入100μL的细胞悬液。-1-8(4)对制备的病毒液进行稀释度10-10的稀释准备。(5)准备适量干净的离心管，每一管中加入0.9mL含有2%血清含量的DMEM细胞培养液，其余管加入1.8mL含有2%血清含量的DMEM细胞培养液。(6)在第一管中再加入0.1mL病毒液，上下吹打数次混匀。(7)换用新的枪头，从第一管中吸取0.2mL混合液加入到第二管中。(8)以此类推，对病毒液进行反复稀释至最高的稀释度。(9)将病毒稀释液加入到已接种细胞的96孔板中，每孔加入100μL，每个稀释度10个孔，2个孔为阴性对照，阴性对照孔加入100μL含有2%血清含量的DMEM细胞培养液，对细胞的存活状况进行监测。(10)加样时从高稀释度向低稀释度进行添加。(11)将加样完毕的96孔板放入细胞培养箱中37℃培养5-7天后放置在显微镜下进行观察，计算每一排中出现细胞病变的孔数，只要出现一点细胞病变即为阳性。3.3结果3.3.1转染用重组质粒及空载体质粒的提取结果对提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，无RNA污染。用核酸蛋白定量仪对提取的质粒的DNA浓度进行检测，每个样品进行3次重复检测，三组数值的平均值即为提取质粒的DNA浓度，如表3-2。28 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定表3-2质粒浓度的检测结果Table-3-2concentrationofplasmidDNA浓度的平均值转染用提取的质粒DNA浓度(μg/mL)A260/A280(μg/mL)38.65261.9977pLenti6/v5-GFP37.54992.011237.335837.46921.9987121.31882.0162pLenti6/v5-RBM3120.97872.0046120.7904120.07362.010863.88522.0888pLenti6/v5DEST63.88512.094863.880063.86952.09043.3.2复苏培养的293T细胞的检测结果将复苏培养的293T细胞放置在普通光照下进行观察并拍照，图3-1是293T细胞在光镜下的细胞状态。图3-1293T细胞的形态(×100)Fig.3-1appearanceof293TCell3.3.3plenti6/v5-GFP质粒转染293T细胞的检测结果将质粒pLenti6/v5-GFP按照梯度对293T细胞进行质粒转染，当质粒剂量在4.0μg时，转染效率达到40%左右，如图3-2所示，当质粒剂量在5.0μg时，转染效率并未增加，而且细胞出现死亡现象。因此实验选择的最佳转染剂量为4.0μg。29 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定(1)(2)图3-2转染pLenti6/v5-GFP质粒的293T细胞(×100)Fig.3-2Appearanceof293TCellwhichtransfectedbypLenti6/v5-GFP(1):正常显微镜下转染pLenti6/v5-GFP质粒的293T细胞(2):荧光显微镜下转染pLenti6/v5-GFP质粒的293T细胞(1):Appearanceof293TCellwhichtransfectedbypLenti6/v5-GFPundernormalmicroscope(2):Appearanceof293TCellwhichtransfectedbypLenti6/v5-GFPunderfluorescencemicroscope3.3.4病毒滴度的检测结果按照Reed-Muench法计算中公式lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变的稀释度的对数计算病毒滴度，其中距离比例=(高于50%的百分数-50%)/(高于50%的百分数-低于50%的百分数)。按照表3-1中测定结果得到慢病毒pLenti6/v5-RBM3滴度为278×10PFU/mL；按照表3-2中测定结果得到慢病毒pLenti6/v5-DEST滴度为4.7×10PFU/mL；8按照表3-3中测定结果得到慢病毒pLenti6/v5-GFP滴度为3×10PFU/mL。表3-1重组慢病毒pLenti6/v5-RBM3滴度的测定Table-3-3titer’sdeterminationoflentiviruspLenti6/v5-RBM3病毒稀释度细胞病变情况-110××××××××××√√-210××××××××××√√-310××××××××××√√-410××××××××××√√-510××××××××××√√-610××√√××√×√×√√-710×√√×√×√×√√√√-810√√√√√√√√√√√√注：×表示细胞出现病变；√表示细胞生长状态良好，无细胞病变。30 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定表3-2重组慢病毒pLenti6/v5-DEST滴度的测定Table-3-2titer’sdeterminationoflentiviruspLenti6/v5-DEST病毒稀释度细胞病变情况-110××××××××××√√-210××××××××××√√-310××××××××××√√-410××××××××××√√-510××××××××××√√-610√√×√√×××√×√√-710√√√××√√√××√√-810√√√√√√√√√√√√注：×表示细胞出现病变；√表示细胞生长状态良好，无细胞病变。表3-3重组慢病毒pLenti6/v5-GFP滴度的测定Table-3-3titer’sdeterminationoflentiviruspLenti6/v5-GFP病毒稀释度细胞病变情况-110××××××××××√√-210××××××××××√√-310××××××××××√√-410××××××××××√√-510××√×××××√×√√-610×××××√√√××√√-710××√×√×√√√√√√-810√√√√√√√√√√√√注：×表示细胞出现病变；√表示细胞生长状态良好，无细胞病变。3.4讨论[46]现阶段将外源基因导入真核细胞的方法很多，包括重组DNA病毒感染法、显微注[47][48][49][49][50-51]射法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖转染法、磷酸钙转染法和脂质体转染法等。重组DNA病毒感染法对所插入的外源基因的片段大小有一定的限制，并且具有潜在[52]的危险性。电穿孔法是通过短暂的高场强电脉冲处理细胞，由于细胞膜内外产生电压差会导致细胞膜暂时穿孔，因此DNA就会穿过孔道进入细胞内。场强的大强度和电脉冲时间过长都会对对细胞产生不可逆的伤害而使细胞裂解。因为电转过程中场强的大小影响细胞的存活率，所以不同细胞的电转条件都需要进行多次实验进行优化，找到最佳的电转条件。显微注射法是通过细胞注射的方法，一个一个的进行基因的导入。实验操作步骤繁琐，不利于大量细胞的转染。DEAE-葡聚糖转染法只能够对少数细胞系大量转染，并且对细胞有毒性作用，不适于细胞的大量转染。31 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定磷酸钙转染法是1973年Graham等人创建的，该方法是将氯化钙、病毒质粒及磷酸缓冲液按照一定的比例进行混合，混合液静置一段时间后形成极微小的磷酸钙-DNA复合物沉淀，磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。可用于多种细胞的基因转染，并获得目的蛋白短期或长期的表达。此法所需的试剂都能够手工配制，而且制备成本较低，制备具有高效转染目的基因的磷酸钙-DNA复合物共沉物较困难，需要严格的实验操作并控制溶液的pH值，钙离子浓度，沉淀反应时间等，且对沉淀颗粒的大小和质量有严格的要求，其中不能含有杂蛋白及RNA。脂质体转染法是1984年Weinstein等人开始采用的，是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。这种方法更适宜大量细胞的基因导入，最初转染时采用逆相蒸发技术制备包装DNA的脂质体，现已发展成为商品化的Lipofectin试剂。转染试剂较贵，而且无法由于避免DNA浓度变低而造成的基因导入效率低。通过各个转染法的比较，实验采用了更为经济、有效的磷酸钙转染法将外源基因导入目的细胞，并成功的将含有目的基因RBM3的重组慢病毒载体转染进入293T细胞中。在进行病毒包装的过程中，需要注意以下几点：首先，在包装过程中，要注意调整目的载体质粒与包装系统的比例，根据目的载体质粒的分子量的大小对包装系统进行调整，选择合适的比例进行病毒的包装，从而得到感染力强的重组慢病毒。其次，细胞的培养密度和细胞的生长状态是病毒包装过程中的关键。因为慢病毒载体的包装不能反复感染，只能由转染时进入细胞的质粒在细胞内包装形成，不能增殖，所以包装病毒的细胞密度高，产生的病毒就越多；细胞的生长状态越好，质粒在细胞内包装成重组病毒的能力就越强。最后，收集病毒的时间一定要准确把握，收集包装后的病毒上清液一般选择在转染后72h左右，这是因为转染时间过短就会造成病毒包装过程不充分，产毒量低的现象；转染时间过长，病毒上清中的病毒颗粒感染效果就会有所下降，造成病毒滴度降低，不利感染目的细胞的结果。因此把握好收集病毒上清液的时间是包装病毒的重要步骤。在本研究中质粒转染、包装病毒的实验过程中，应用了质粒pLenti6/v5-GFP进行平行对照实验，因为构建的含有RBM3基因的重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3不含有标记基因，而质粒pLenti6/v5-GFP中含有绿色荧光蛋白基因，为了准确把握转染质粒的体系，本研究采用了pLenti6/v5-GFP和pLenti6/v5-RBM3在相同条件下进行平行操作，根据质粒pLenti6/v5-GFP转染293T细胞后在荧光显微镜下荧光的现象，计算重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3的转染效果。病毒滴度的测定方法包括两大类：物理方法和生物学方法。物理方法是病毒颗粒(VP)测定法，这种方法是通过测定病毒颗粒在260nm处的吸光12度(OD260nm)估算DNA量来表示病毒滴度。相关系数是1.1×10/OD260单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时的测定结果不够精确，只能在OD值大于0.1时结果才可靠，要求病毒浓度足够高。由于血清培养基能够干扰测定结果的吸光度，因此这种方法只能用来测定经过氯化铯纯化的溶于缓冲液中的病毒。这种方法能够在不同的实验室中对病毒进行测定，但它不能对感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒进行区分。生物学方法包括空斑测定法(PFU)和50%组织培养感染剂量法(TCID50)，空斑测定法(PFU)是测定病毒滴度最早的标准方法，主要是测定病毒感染单层细胞之后，通过一个32 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章重组慢病毒的制备及滴度测定感染周期感染周围邻近细胞裂解空斑的形成。由于细胞的质量、实验的操作和观察方法等因素都能够影响空斑测定的结果，这种方法得到的结果很少能够在其它实验室重复，结果很不稳定。50%组织培养感染剂量法(TCID50)已经被用于多种病毒滴度的测定，将病毒稀释液加入在96孔板内培养的细胞中，然后观测细胞培养孔中细胞病变的形成。本实验采用TCID50法对收集到的病毒液进行滴度的测定，相对于PFU法而言，TCID50法的检测速度是PFU法的2倍，在不同实验室中、不同个体间重复实验操作结果更稳定。在不同的实验室内所有的病毒滴度测定方法所得到的结果不是一致的，这种现象的出现主要是与病毒感染的过程和方法有关。感染过程中的许多因素都能够对测定的结果产生影响，例如：病毒液的用量、细胞培养的时间和细胞培养液的用量等。本实验采用了1996年Mittereoler等人改良的病毒滴度的测定方法，即用更小体积的病毒液对细胞进行感染并且在感染的过程中每隔一段时间晃动细胞培养板。实验中对病毒液进行了梯度添加寻找到了最佳的感染用量4.0μg对ST细胞进行感染。3.5小结(1)将构建成功的重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3、pLenti6/v5-GFP和慢病毒载体pLenti6/v5-DEST成功转染到293T细胞内，并收集到重组慢病毒液。(2)采用TCID50法对收集到的慢病毒液进行了病毒滴度的测定，重组慢病毒78pLenti6/v5-RBM3滴度为2×10PFU/mL；慢病毒pLenti6/v5-DEST滴度为4.7×10PFU/mL；8慢病毒pLenti6/v5-GFP滴度为3×10PFU/mL。33 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定第四章重组慢病毒载体pLenti6/v5-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定猪对寒冷比较敏感，尤其是初生仔猪，当外界环境温度超过34℃时，机体无法进行自[1]我体温调节。在出生后72h内受冻而死的仔猪占很大比例，同时寒冷也致使猪的生产性能[2]降低、睾丸损伤等疾病。ST细胞对多种病毒都比较敏感，如猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒等，因此本研究选择了让重组慢病毒感染ST细胞，并应用荧光定量PCR方法和Westernblot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测ST细胞内RBM3mRNA和RBM3蛋白含量的变化。4.1材料4.1.1细胞来源猪细胞系ST细胞由哈尔滨兽医研究所馈赠。4.1.2主要化学试剂及仪器设备(1)主要化学试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；DEPC购自Sigma公司；荧光定量用反转录酶、Oligo(dT)18、Taq酶、标准核算分子量DL-2000marker、荧光定量试剂盒均为大连宝生物公司产品；2×TaqMasterMix(含染料)购自康为世纪公司；pGEM-TEasy、T4连接酶购自Promega公司；质粒小量提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂粉、胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)均购于OXOID公司；琼脂糖、氨苄青霉素购自Spanish公司；胎牛血清(FBS)、MEM培养液均购自Hyclone公司；Trypsin购自GIBCO公司；Western及IP细胞裂解液(P0013)、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；RBM3单克隆抗体购自Abcam公司。其他化学试剂均为国产分析纯试剂。引物合成和测序均由上海生物技术服务有限公司完成。(2)主要仪器设备超净工作台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司核酸蛋白定量仪：美国伯乐公司电泳槽：电泳仪北京六一仪器厂紫外凝胶成像系统：美国伯乐公司电热恒温水浴锅：上海国华电器有限公司电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司34 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定细胞培养箱：GSLaboratoryEquipment公司倒置显微镜：NIKONEXLIPSETS100公司荧光显微镜：美国伯乐公司超纯水仪：力新仪器上海有限公司-80℃超低温冰箱(ultralowtemperaturefreezer)：英国NewBrunswickScientific公司荧光实时定量PCR仪：杭州博日公司电泳仪：美国伯乐公司蛋白转膜仪：美国伯乐公司水平摇床：北京市六一仪器厂锥形瓶，广口瓶，烧杯，1.5mL离心管，细胞培养瓶，96孔板，培养皿，5mL枪头，冻存管，10mL离心管等。4.2方法4.2.1ST细胞的传代培养根据3.2.2中细胞复苏的方法复苏ST细胞，当细胞生长状态良好，贴壁达到80%-90%时进行细胞传代。用1mL含EDTA的0.25%胰酶洗一下细胞，然后吸弃胰酶，再向瓶内加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞圆缩时，缓慢移动细胞至超净台中，吸弃胰酶，盖好瓶盖，放置到37℃细胞培养箱中静置1分钟，加入细胞培养液(含10%FBS的MEM细胞培养液)，轻轻吹到数次，至细胞呈单个状态后，分瓶后放入37℃细胞培养箱中进行传代培养。4.2.2重组慢病毒感染ST细胞用收集到的慢病毒液对目的细胞进行预感染实验，寻找最佳的MOI(multiplicityofinfection)值。MOI就是感染复数，它的含义是感染噬菌体与细菌的数量的比值，就是每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位是pfu，MOI是一个比值，单位是pfunumber/cell，后来研究学者将MOI用于病毒感染细胞的研究实验中，MOI被赋予新的定义，即感染时病毒量与细胞数量的比值。因为构建的慢病毒质粒中不含有标记基因，因此本实验同样采用含有GFP的重组慢病毒液进行平行对照进行操作，筛选最佳MOI值。因为不同细胞对慢病毒的亲嗜性不同，在实验过程中我们需要同时设置对慢病毒亲嗜性高的细胞如293T细胞作为平行实验作为参照。在进行感染实验前按照不同MOI值标记不同的细胞病毒感染孔，计算每孔接种细胞数量和相应的MOI值所需要的病毒量。4(1)第一天，在24孔细胞培养板中接种5-7×10个ST细胞，铺板时细胞的融合率在50%左右，每孔细胞培养基体积为100μL，加入病毒感染细胞时要求细胞的融合度为70%左右。(2)第二天，观察细胞的生长状态，在细胞状态较好的情况下开始实验。从-80℃冰箱中取出35 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定冻存的病毒液在冰上融化后使用。(3)待冻存的病毒液完全融化后，从细胞培养箱中取出培养ST细胞中的24孔细胞培养板。(4)用移液器吸取计算得到准确体积的病毒液加入用于病毒液稀释的细胞培养液MEM中。(5)吸取细胞培养板中各孔中的细胞培养液，并用PBS缓冲液洗2次。然后在对应不同的MOI值的目的细胞和对照细胞的培养孔中加入准备好的病毒液。混匀后放入37℃细胞培养箱中孵育12h。(6)在孵育完成后将含有慢病毒的培养液换成含10%FBS的MEM细胞培养液后再次将24孔细胞培养板放入37℃细胞培养箱中培养24h后置于荧光显微镜下进行感染效率的检测，确定最佳MOI值。(7)用检测到的最佳MOI值计算感染ST细胞的重组慢病毒pLenti6/v5-RBM3和重组慢病毒pLenti6/v5-DEST的病毒液用量。然后用准确计算的病毒液按照上述步骤感染ST细胞用于后续实验。4.2.3荧光定量的引物设计与合成根据猪RNA结合基序蛋白3的基因序列(GenBank登录号为:NM_001243419)和内参GAPDH的基因序列(GenBank登录号为:NM_001206359.1)，采用PrimerExpress软件设计用于扩增RBM3和内参GAPDH基因的特异性引物，片段大小分别为199bp和86bp。RBM3上游引物Forward：5’-ccaatccagaacatgcttca-3’，RBM3下游引物Reverse：5’-cctccaggtcgactgtcatat-3’，GAPDH上游引物Forward：5’-ctctggcaaagtggacattg-3’，GAPDH下游引物Reverse：5’-gggtggaatcatactggaaca-3’。经BLAST软件分析说明，设计的引物具有良好的引物特异性，可用作后续试验，并委托上海生物工程技术服务有限公司合成此引物。4.2.4ST细胞RNA的提取(1)去除细胞培养液，用PBS缓冲液洗2遍后，加入适量Trizol静置5min使其完全溶解。(2)加入200μL氯仿，手动振荡混匀15s后室温静置5min后置于4℃离心机中12000rpm离心15min。(3)离心后混合液分为三层，吸取上层水相部分加入新EP管中，然后加入等体积的异丙醇混匀后，放在4℃环境中静置30min。(4)放入4℃离心机中12000rpm离心10min后弃去上清，收集沉淀。(5)向沉淀中加入1mL经过预冷的75%乙醇，温和振荡悬浮沉淀后放入4℃离心机中，8000rpm离心5min后弃去上清后，在室温下干燥5-10min。(6)加入20μL的DEPC水对沉淀进行溶解。(7)对所提RNA溶液进行质量检测，用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性，然后检测其浓度及A260/280。36 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定4.2.5目的基因的制备以没有转染病毒的ST细胞总RNA为模板，以Oligo-dT为引物进行反转录。反转录的反应体系和反应条件同2.2.3中相同。随后以反转录的产物为模板进行PCR反应。反应体系同表4-1所示。表4-1PCR扩增体系Table4-1SystemofPCRamplification试剂加样量RT产物1.0μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLRnase-FreeWater10.5μL总体积25.0μL对PCR反应TM值和循环数等进行优化后得出RBM3和GAPDH的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。4.2.6荧光定量用重组质粒的构建(1)根据2.2.4中的方法对RBM3基因和GAPDH基因进行回收和纯化。(2)根据2.2.6中的方法对RBM3基因和GAPDH基因与T载体进行连接与转化。.(3)根据2.2.7中的方法对连接转化的质粒进行提取。4.2.7重组质粒的鉴定(1)重组质粒的PCR鉴定以连有目的基因的T载体重组质粒为模板进行PCR扩增，反应体系如表4-2所示。表4-2PCR反应体系Table4-2SystemofPCRamplification试剂加样量质粒0.5μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLRnase-FreeWater10.0μL总体积25.0μLPCR反应条件与4.2.5中PCR反应条件相同，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴37 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定定，电泳后置于紫外灯下观察电泳结果。(2)重组克隆载体的序列测定及其分析将初步鉴定为阳性的菌液培养过夜后加入50%的甘油，送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析。利用BioXM软件将所测得的基因序列同GenBank上公布的猪的RNA结合基序蛋白3和猪内参基因GAPDH的编码序列进行比对，同源性接近100%，证明克隆所得的序列可以用于后续试验。4.2.8荧光定量PCR模板的制备(1)基因组DNA的去除反应表4-3基因组DNA的去除反应体系Table4-3SystemofgenomeDNA’sremovalReaction试剂加样量5×gDNAEraserBuffer2.0μLgDNAEraser1.0μLTotalRNA1.0μgRNaseFreedH2OUpto10.0μL将上述反应产物放入42℃水浴2min后放置到4℃冰箱中。(2)反转录反应按照下表在冰上配制反转录的反应液。表4-4反转录反应体系Table4-4SystemofReverseTranscriptionReaction试剂加样量5×PrimeScript®Buffer2(forRealTime)4.0μLPrimeScript®RTEnzymeMixI1.0μLRTPrimerMix1.0μL(1)的反应液10μLRNaseFreeddH2OUpto20.0μL为保证配制反应液体积的准确性，要按照比反应数多1的量进行反应液的配制，然后再分装到各管中。将上述反应液放置在37℃水浴锅中水浴15min，然后取出放入85℃水浴锅中水浴5s后就合成了荧光定量PCR反应所需的cDNA，可放在-20℃冰箱中保存。4.2.9SYBRGreen-Ⅰ实时荧光定量PCR(1)RBM3和GAPDH重组质粒标准品的制备用核酸蛋白定量仪测量RBM3和GAPDH的重组质粒的浓度，并计算每微升质粒溶液的拷贝数，然后对RBM3和GAPDH的重组质粒原液进行定量，制备两种重组质粒阳性模38 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定板的标准梯度，以重组质粒原液浓度为1进行梯度稀释。反应前取3μL原液加入荧光定量-1-2-3-4PCR管中然后加水27μL充分混匀按10倍稀释成10。然后依次稀释成10、10、10、-5-610、10，分装到小管中置于-20℃中备用。(2)实时荧光定量PCR反应体系RBM3和GAPDH重组质粒经过稀释制成标准品，然后按照表4-5在荧光定量PCR管中加入各组分，然后将荧光定量PCR管放入荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。整个加样过程需要在冰上操作。表4-5荧光定量PCR反应体系Table4-5Systemofreal-timerPCRamplification试剂加样量TMSYBRPremixExTaqⅡ(2×)12.5μL上游引物（10μM）1.0μL下游引物（10μM）1.0μLDNA模板2.0μLddH2O8.5μL总体积25.0μL荧光定量PCR反应条件为：94℃预变性10s，94℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸20s，共45个循环。(3)RBM3和GAPDH重组质粒标准曲线的绘制及数据的处理用荧光定量PCR仪上的Line-GeneK分析软件绘制标准曲线对RBM3基因的相对表达量进行分析。为确保样品中RBM3基因相对表达量的准确，在实验过程中每管样品做3个重复。实验数据利用SPASS数据分析软件进行分析整理，采用Duncan法进行多重比较。4.2.10蛋白样品的收集及浓度检测(1)蛋白样品的收集将接毒培养的ST细胞中的细胞培养液去除，用PBS缓冲液清洗2次以去除细胞培养液6中血清的干扰。按照每10个细胞加入100-200μLWestern及IP细胞裂解液的比例加入裂解液(冰上操作)。用枪吹打数次充分裂解细胞，收集蛋白样品。(2)蛋白样品浓度的检测收集完蛋白样品后，为确保实验过程中每个蛋白样品的上样量相同，用BCA蛋白浓度测定试剂盒按照下面的操作步骤对每个蛋白样品的蛋白浓度进行测定。①将0.8mL蛋白标准配制液加入到含有20mgBSA的蛋白标准中，吹吸混匀后得到浓度为25mg/ml的蛋白标准溶液。配制完成后保存于-20℃。②取适量25mg/mL蛋白标准溶液加入PBS缓冲液稀释成浓度为0.5mg/mL的蛋白标准溶液。稀释得到的0.5mg/mL蛋白标准溶液也可以放在-20℃长期保存。③根据蛋白样品的数量配制适量BCA工作液，BCA工作液的配制就是50体积的BCA试剂A+1体积BCA试剂B(50:1)并充分混匀。BCA工作液在室温状态下24小时内稳定。39 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定④将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加入到96孔板的标准品孔中，加入PBS缓冲液补量到20μL。⑤加适当体积待测蛋白样品到96孔板的样品孔中，加入PBS缓冲液补量到20μL。⑥在96孔板中每个蛋白样品和标准品孔中加入200μLBCA工作液，37℃放置20-30min。⑦测定A550nm，根据标准曲线计算出蛋白样品的蛋白浓度。4.2.11westernblot实验(1)蛋白样品的变性处理在制备好的蛋白样品中加入适量的5×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水加热5min，以使蛋白充分变性，煮沸变性后冷却至室温。(2)SDS-PAGE凝胶配制按照15%分离胶的配方配制得到分离胶，混匀后用移液器将分离胶缓慢注入安装完毕的电泳槽的两块玻璃板的间隙中，加入分离胶的过程中不能产生气泡，并给后续要注入的浓缩胶留有空间。在注好的分离胶上加入去离子水加以覆盖保证胶面的平整。完成以上操作后室温静置30min。静置过后分离胶完全凝固，用移液器吸弃去离子水，将配制得到的5%浓缩胶缓慢注入到分离胶上，迅速插上梳子，插好后用剩余的浓缩胶将梳子制造出的空隙填满。完成后室温静置30min使其充分凝固。(3)蛋白的上样及电泳等浓缩胶凝固后，将其固定在电泳装置上并在电泳槽内加入SDS-PAGE电泳缓冲液，小心拔出梳子，并将梳孔扶正。用移液器吸取制备好的蛋白样品按照设定好的顺序缓慢加样，避免样品溢出影响实验结果。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，加入5μL预染蛋白质分子量标准(Marker)。将电泳槽安装完毕后，盖上电泳槽的盖子后连接电源开始电泳。电泳时当蛋白样品在上层浓缩胶时使用80V低电压恒压电泳45min，而在染料进入下层分离胶时使用120V高电压恒压电泳大约90min，即溴酚蓝染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。(4)转膜将凝胶和3MM滤纸放入转膜缓冲液中，准备蛋白转移。将PVDF膜放在甲醇溶液中浸泡15s使其变成半透明状态，然后按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序自阴极组合到一起，尽量排除各层的气泡以避免转膜不均，将其放入转膜缓冲液中进行蛋白转移，用300mA的电流放置在冰浴中转膜60min。(5)封闭转膜完毕后，立即取出蛋白膜用去离子水冲洗，以洗去膜上的转膜液。迅速将蛋白膜放入盛有5%的脱脂奶粉溶液中，并在摇床上缓慢摇动，封闭过夜，然后用PBST漂洗2-3次，去除膜上的封闭液。(6)一抗孵育将一抗(兔源RBM3单克隆抗体)用5%的脱脂奶粉溶液按照1：1000稀释，GAPDH一抗用40 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定5%的脱脂奶粉溶液按照1：2000稀释。将膜裁剪成含分别有RBM3条带和内参GAPDH条带的两块，前者放入相应的1：1000一抗溶液中，后者放入相应1：2000一抗溶液中，37℃摇晃孵育1h，使蛋白和一抗发生特异性结合，然后取出膜用PBST溶液漂洗三次，每次洗涤10min。(7)二抗孵育将RBM3二抗(荧光标记)用5%的脱脂奶粉溶液按照1：3000稀释，GAPDH二抗用5%的脱脂奶粉溶液按照1：20000稀释。将一抗孵育的膜取出，放入相应的二抗溶液中，37℃摇晃孵育1h，然后取出膜用PBST溶液漂洗三次，每次洗涤10min。(8)蛋白检测采用LICOROdyssey双色红外激光成像系统扫描出图像。对蛋白条带进行图像分析，根据其灰度值和面积大小计算蛋白的相对浓度。实验数据利用SPASS数据分析软件进行分析整理，采用Duncan法进行多重比较。4.3结果4.3.1复苏培养的ST细胞的检测结果将复苏培养的ST细胞放置在普通光照下进行观察并拍照，图4-1是ST细胞在光镜下的细胞状态，光镜下的细胞具有清晰的细胞轮廓、细胞生长状态良好，立体感较强。图4-1ST细胞的形态（×100）Fig.4-1appearanceofSTCell4.3.2重组慢病毒感染ST细胞的结果用收集到的慢病毒液对ST细胞进行预感染实验，验证发现当MOI值是20时，重组慢病毒对ST细胞的感染率能够达到95%以上。因此确定重组慢病毒对ST细胞的最佳MOI值为20，MOI值为20的条件下ST细胞荧光照片如图4-2。41 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定(1)(2)图4-2感染重组慢病毒plenti6/v5-GFP的ST细胞(×100)Fig.4-2AppearanceofSTCellwhichinfectedbylentivirusofplenti6/v5-GFP(1):正常显微镜下感染重组慢病毒plenti6/v5-GFP的ST细胞(2):荧光显微镜下感染重组慢病毒plenti6/v5-GFP的ST细胞(1):AppearanceofSTCellwhichinfectedbylentivirusofplenti6/v5-GFPundernormalmicroscope(2):AppearanceofSTCellwhichinfectedbylentivirusofplenti6/v5-GFPunderfluorescencemicroscope4.3.3感染病毒的ST细胞RNA的提取结果从感染病毒的ST细胞中提取总RNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测(图4-3)结果：可见28S、18S及5S三条条带，如图所示所提取的细胞RNA基本未降解，经核酸蛋白定量仪检测，过表达组RNA的A260/280=2.0054，浓度C=22.1390μg/mL，空载体组RNA的A260/280=2.0878，浓度C=17.2963μg/mL，空白对照组RNA的A260/280=1.9489，浓度C=16.0326μg/mL。以上结果均显示所得RNA样品符合RT-PCR反应要求，可以用于后续试验。12328S18S5S图4-3ST细胞总RNA提取结果Fig.4-3TotalRNAofSTcells1:过表达组.2:空载体组.3:空白对照组1:plenti6/v5-RBM32:plenti6/v5-DEST3:blankgroup4.3.4cDNA的RT-PCR检测以正常状态的ST细胞中总RNA反转录合成的第一条链cDNA为模板进行PCR反应，42 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定经琼脂糖凝胶电泳检测得到RBM3片段大小为199bp和GAPDH片段大小为86bp(图4-4)，未见非特异性片段。bp1M22000100075050025086199100图4-4ST细胞中RBM3和GAPDH的RT-PCR检测结果Fig.4-4TheRT-PCRresultofRBM3andGAPDHexpressioninSTcellM:DL2000Marker.1:ST细胞中的GAPDH的RT-PCR检测结果2:ST细胞中RBM3的RT-PCR检测结果M:DL2000Marker.1:TheRT-PCRresultofGAPDHexpressioninSTcell2:TheRT-PCRresultofRBM3expressioninSTcell4.3.5重组克隆载体的鉴定以连接RBM3基因和GAPDH基因的T载体为模板进行PCR反应，鉴定得到199bp和86bp的DNA片段(图4-5)，未见非特异性片段。bp1M22000100075050019925010086图4-5连接RBM3基因的T载体的PCR检测结果Fig.4-5ThePCRresultoftheTvectorcontainingRBM3M:DL2000Marker.1:连接RBM3基因的T载体.2:连接GAPDH基因的T载体M:DL2000Marker.1,2:theTvectorcontainingRBM32:theTvectorcontainingGAPDH4.3.6荧光定量PCR结果(1)目的基因RBM3和内参基因GAPDH重组质粒的双标准曲线的绘制利用荧光定量PCR仪上的Line-GeneK软件，采用双标准曲线法对RBM3基因进行相对定量分析。荧光定量PCR反应结束后，以标准质粒为模板进行反应收集到的目的基因RBM3与内参基因GAPDH的荧光强度绘制标准曲线。43 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定图4-6荧光定量的双标准曲线Fig.4-6Areersentativestandardcurveobtainedbyplottingthestartingcopynumbersofrecombinantplasmidagainsttheircyclenumbers（2）根据标准曲线，对样品中的RBM3基因的表达量进行相对定量分析。空载体组与空白对照组相比，RBM3mRNA表达量差异不显著；过表达组与空白对照组和空载体组相比，RBM3mRNA表达量显著增加，差异显著(P＜0.05)。表4-1RBM3mRNA表达量的变化Table4-1TheexpressionofRBM3mRNA空白对照组空载体组过表达组aabRBM3基因的相对表达量1.000±0.0501.071±0.0702.450±0.080注：同行标注不同字母表示差异显著(P<0.05)3b量2.521.5aa1RBM3mRNA的表达0.50123组别图4-7不同处理组ST细胞中RBM3mRNA的表达量Fig.4-7ExpressionofRBM3mRNAinSTcellsthroughdifferenthandling1：空白对照组；2：空载体组；3：过表达组1:blankgroup2:plenti6/v5-DEST3:plenti6/v5-RBM3相同条件下转染不同病毒液差异性比较(标注不同字母表示差异显著，P<0.05)Differencecomparisoninthesameconditionusingdifferentviruses(Differencenumberrepresentsdifferencesignificant,P＜0.05)4.3.7蛋白浓度的检测结果(1)将添加了蛋白标准品和蛋白样品的96孔板放入酶标仪中进行A550nm吸光度的检测，所得数值如下表。44 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定表4-2蛋白浓度的检测结果Table4-2resultofalbumen’sconcentrationA55012345678A0.0810.120.1440.2030.3120.3930.4720.56B0.3830.3720.422(2)根据标准品蛋白浓度的检测结果绘制蛋白浓度标准曲线。图4-8蛋白浓度标准曲线Fig.4-8Astandardcurveofalbumen’sconcentration按照绘制的蛋白浓度标准曲线和所测的蛋白样品的吸光度，计算蛋白样品的蛋白浓度。计算得到的过表达组蛋白含量为6.57μg，浓度为3.29μg/μL；空载体组蛋白含量为5.44μg，浓度为2.72μg/μL；空白对照组蛋白含量为5.70μg，浓度为2.85μg/μL。4.3.8westernblot检测结果(1)LICOROdyssey双色红外激光成像系统扫描出图像，在未感染慢病毒的ST细胞、感染含空载体慢病毒的ST细胞和感染含RBM3重组慢病毒的ST细胞中均检测到GAPDH蛋白的条带，蛋白条带大小为36KDa，同时在这三组ST细胞中也检测到RBM3蛋白的条带，蛋白条带大小为17KDa(如图4-9)。45 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定M12343KDa(1)GAPDH36KDa34KDa(2)图4-9感染重组慢病毒的ST细胞中RBM3蛋白的Westernblot检测结果Fig.4-9TheWesternblotresultofRBM3expressioninSTcellsinfectedwithlentivirus(1)三组实验组ST细胞中GAPDH的蛋白表达水平(2)三组实验组ST细胞中RBM3的蛋白表达水平(1)TheWesternblotresultofGAPDHexpressioninSTcellsinfectedwithlentivirus(2)TheWesternblotresultofRBM3expressioninSTcellsinfectedwithlentivirus1:未感染慢病毒的ST细胞2:感染含空载体慢病毒的ST细胞3:感染含RBM3重组慢病毒的ST细胞1:STcellsuninfectedlentivirus.2:STcellsinfectedwithlentivirusincludingpLenti6/V5-DEST3:STcellsinfectedwithlentivirusincludingpLenti6/V5-RBM3(2)对RBM3蛋白条带运用图像分析系统进行分析，根据其灰度值计算RBM3蛋白的表达量。空载体组与空白对照组相比，RBM3蛋白表达量差异不显著；过表达组与空白对照组和空载体组相比，RBM3蛋白表达量增加，差异显著(P＜0.05)。表4-3RBM3蛋白表达量的变化Table4-3TheexpressionofRBM3空白对照组空载体组过表达组aabRBM3蛋白的相对表达量0.282±0.0280.312±0.0220.568±0.045注：同行标注不同字母表示差异显著（P<0.05）b0.7b0.60.50.4aaaa0.30.2RBM3蛋白的表达量0.10组别123图4-7不同处理组ST细胞中RBM3的表达量Fig.4-7ExpressionofRBM3inSTcellsthroughdifferenthandling1：空白对照组；2：空载体组；3：过表达组1:blankgroup2:plenti6/v5-DEST3:plenti6/v5-RBM3相同条件下转染不同病毒液差异性比较(标注不同字母表示差异显著，P<0.05)Differencecomparisoninthesameconditionusingdifferentviruses(Differencenumberrepresentsdifferencesignificant,P＜0.05)46 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定4.4讨论在培养ST细胞时，首先要注意实验操作过程中的操作规范，另外还需要注意溶液配制的准确性，因为如果在这些过程中操作不当会造成细胞污染，除此之外还要注意以下几点：第一，当改变细胞培养环境时，如更换培养基或血清、CO2含量的改变、温度的改变等，细胞的培养条件可能会与先前培养的状态有所差异，此时对细胞的传代、细胞铺板的时间应该加大关注，并且根据细胞的生长状态对培养液各组分、CO2的含量以及细胞操作过程进行调节。ST细胞培养初期对PH值的要求是不应低于6.8，所以每隔一段时间应当观察细胞生长状态及细胞培养液的颜色，并及时对细胞进行换液培养。当细胞大部分呈现贴壁状态时，应当提高PH值，因为ST细胞在PH值较高时细胞的形态及贴壁状态较好。第二，ST细胞不容易消化，而且消化后的细胞极易结团，细胞贴壁后分布不匀，从而影响细胞的生长和增殖。为了降低这种不良状况的出现，本实验从以下几个方面对细胞的消化进行改良：(1)在对细胞进行消化前，倒掉培养液后先用灭菌处理的PBS缓冲液清洗细胞2次。(2)然后用胰酶消化液洗一下细胞，吸弃胰酶消化液，再加入预温的胰酶消化液，十字晃动细胞培养瓶，使细胞充分接触胰酶消化液，镜下观察，当发现细胞开始出现圆缩现象时，倒掉胰酶消化液。(3)在瓶中留少许消化液，37℃静置1min，加入含血清的细胞培养液，吹吸数次，待细胞充分散开后，分瓶传代培养。在进行慢病毒感染目的细胞的实验中，采用了无血清、无双抗或其他营养因子的细胞培养基进行病毒液的稀释，虽然理论上含有血清、双抗或其他营养因子的细胞培养用完全培养基不会对感染效率产生影响，但是为排除一切对实验会产生影响的因素，还是采用了无任何添加的MEM细胞培养液对病毒液进行稀释。感染效率受到两个方面的因素影响，一个是由于ST细胞铺板时吹个是细胞的生长状态，另一个是病毒液的MOI值。本实验在前期准备过程中也出现打不均、二氧化碳含量不足等因素而导致的细胞生长状态不良而造成的感染效率不高，因此细胞的生长状态是本实验成功与否的关键。实验中发现，随着MOI值的升高，病毒液感染目的细胞的感染效率显著增加，同时也证明了提高MOI值能够增加感染效率。正常情况下，细胞感染病毒后培养48h目的基因的mRNA量最高，细胞感染病毒后培养72h后目的蛋白的表达量最高。实验中可根据不同的实验目的收集ST细胞样品。荧光定量PCR技术是近些年基因mRNA含量的主要技术手段，与以往检测目的基因的PCR、免疫组化等技术相比，荧光定量PCR技术具有检测速度快、特异性高、重复性好等优点。常用的荧光定量PCR技术主要有染料法和探针法，本实验采用了染料法进行荧光定量PCR实验，使用的染料SYBRGreen-Ⅱ价格低廉、能够抑制非特异性反应，只要嵌合荧光进入DNA而不需要与DNA结合就能够达到检测的目的。经过荧光定量PCR反应得到结果表明空白空载体组与对照组中RBM3mRNA的表达量差异不显著；过表达组与空白对照组、空载体组中RBM3mRNA的表达量差异显著(P＜0.05)，与理想结果相符。Westernblot技术是现阶段应用较为广泛的检测组织细胞中蛋白质表达量的专业分析技术。它能够得目的蛋白进行定性，该技术不能对蛋白进行精确的定量分析，但能够对蛋白进行半定量分析。此方法因为其灵敏度高、特异性强等诸多优点而被广大研究学者们应用于科47 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第四章重组慢病毒载体pLenti6/v3-RBM3在ST细胞中的表达及鉴定研实验中。影响Westernblot实验结果的因素有很多，包括实验前期的蛋白准备情况和实验过程中的电泳条件的选择等。在蛋白提取的准备过程中，最需要注意的是细胞破碎的问题，细胞如果破碎的不充分就提取不够需要的蛋白量，就会对目的蛋白的检测结果产生影响。本实验应用Western及IP细胞裂解液的比例加入裂解液，此步骤都在冰上操作。用枪吹吸打匀，至目的细胞全部裂解完全。从实验结果来看，蛋白的提取结果可以用于Westernblot实验。电泳条件的选择是影响Westernblot实验的关键环节，电泳条件的制约因素包括Tirs-Hcl的PH值和电泳的电压等。Tirs-Hcl是配制分离胶和浓缩胶的重要成份，要对Tirs-Hcl的PH值进行准确的定量，才能保证实验的顺利进行。采用不同的电压进行电泳时发现，当染料在浓缩胶中电泳时采用低电压，当染料进入分离胶时采用高电压，能够得到好的Westernblot实验结果。本实验中的目的蛋白大小为17KDa，采用了这种电压调节，而且得到了理想的效果：空载体组和空白对照组中的RBM3蛋白含量差异不显著；过表达组中的RBM3蛋白的含量比空载体组和空白对照组中的RBM3蛋白含量明显升高，差异显著(P＜0.05)。4.5小结(1)用收集到的慢病毒液对ST细胞进行感染实验，确定最佳MOI值为20，感染率能够达到95%以上。(2)通过荧光定量PCR技术检测得到，空载体组RBM3mRNA表达量与空白对照组RBM3mRNA表达量差异不显著；过表达组RBM3mRNA表达量高于空白对照组及空载体组RBM3mRNA表达量，差异显著(P＜0.05)。(3)通过Westernblot技术检测得到，空载体组RBM3蛋白表达量与空白对照组RBM3蛋白表达量差异不显著；过表达组RBM3蛋白表达量高于空白对照组及空载体组RBM3蛋白表达量，差异显著(P＜0.05)。48 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第五章结论第五章结论(1)利用RT-PCR方法成功从长白仔猪脾脏中扩增得到了仔猪的RBM3基因。(2)成功构建了重组慢病毒载体plenti6/v5-RBM3，并且将其与plenti6/v5-GFP、plenti6/v5-DEST成功转染到293T细胞内，并收集到重组慢病毒液。(3)通过TCID50法对收集到的慢病毒液进行了病毒滴度的测定，重组慢病毒78plenti6/v5-RBM3滴度为2×10PFU/mL；慢病毒plenti6/v5-DEST滴度为4.7×10PFU/mL；8慢病毒plenti6/v5-GFP滴度为3×10PFU/mL。(4)用收集到的慢病毒液对ST细胞进行感染实验，确定最佳MOI值为20。(5)通过荧光定量PCR技术检测得到，空载体组RBM3mRNA表达量与空白对照组RBM3mRNA表达量差异不显著；过表达组RBM3mRNA表达量高于空白对照组及空载体组RBM3mRNA表达量，差异显著(P<0.05)。(6)通过Westernblot技术检测得到，空载体组RBM3蛋白表达量与空白对照组RBM3蛋白表达量差异不显著；过表达组RBM3蛋白表达量高于空白对照组及空载体组RBM3蛋白表达量，差异显著(P<0.05)。49 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文参考文献参考文献[1]高腾云.环境温度与养猪[J].家畜生态,1995,16(2):42-43[2]LiuLi-li(刘莉莉),ChuQin(初芹),XuQin(徐青),etal.ResearchProgressesofColdStressinAnimal[J].JAnhuiAgriSci,2012,40(16):8937-8940[3]AloiaRC,RaisonJK.Membranefunctioninmammalianhibernation[J].BiochimBiophysActa,1989,988(1):123-146[4]DannoS,NishiyamaH,HigashitsujiH,etal.IncreasedtranscriptlevelofRBM3,amemberoftheglycine-richRNA-bindingproteinfamily,inhumancellsinresponsetocoldstress[J].BiochemBiophysResCommun,1997,236(3):804-807[5]WellmannS,BührerC,ModereggerE,etal.Oxygen-regulatedexperssionoftheRNA-bindingproteinsRBM3andCIRPbyaHIF-1-independentmechanism[J].JCellSci,2004,117(9):1785-1794[6]WrightCF,OswaldBW,DellisS.Vacciniaviruslatetranscriptionisactivatedinvitrobycellularheterogeneousnuclearribonucleoproteins[J].JBiolChem,2001,276(44):40680-40686[7]EhlénA,BrennanDJ,NodinB,etal.ExpressionoftheRNA-bindingproteinRBM3isassociatedwithafavourableprognosisandcisplatinsensitivityinepithelialovariancancer[J].JTranslMed,2010,8:78[8]FerryAL,VanderklishPW,Dupont-VersteegdenEE.EnhancedsurvivalofskeletalmusclemyoblastsinresponsetooverexpressionofcoldshockproteinRBM3[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2011,301(2):392-402[9]WellmannS,TrussM,BruderE,etal.TheRNA-bindingproteinRBM3isrequiredforcellproliferationandprotectsagainstserumdeprivation-inducedcelldeath.PediatrRes,2010,67(1):35-41[10]SelyeH.Asyndromeproducedbydiversenocuousagents[J].Nature,1936,138:32[11]SelyeH.Asyndromeproducedbydiversenocuousagents[J].JNeuropsychiatryClinNeurosci,1998,10(2):230-231[12]MatzJM,BlakeMJ,TatelmanHM.Characterizationandregulationofcold-inducedheatshockproteinexpressioninmousebrownadiposetissue[J].AmJPhysiol,1995,269(12):38-47.+[13]计红,吴永魁,胡仲明等.不同强度冷应激下仔猪淋巴细胞HSP70mRNA的转录规律[J].应用与环境生物学报,2007,13(4):507-509.[14]MorimotoRI.Regulationoftheheatshocktranscriptionalresponse:crosstalkbetweenafamilyofheatshockfactors,molecularnegativeregulators[J].GenesDev,1998,12(24):3788-3796[15]MoseleyPL.Exercise,stress,andtheimmuneconbersation[J].ExercSportSciRev,2000,28(3):128-13250 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黑龙江八一农垦大学硕士学位论文附录附录1载体构建相关溶液的配制(1)LB液体培养基称取2g蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl加入去离子水定容至200mL，充分搅拌溶解，高温高压灭菌后，放于4℃保存。(2)LB固体培养基称取2g蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，3g琼脂粉加入去离子水定容至200mL，充分+搅拌溶解，高温高压灭菌后，待培养基冷却至50-60℃左右时，加入氨苄青霉素(Amp)或卡+那霉素(Kan)混匀，在超净台中铺板。培养基完全凝结后，放于4℃保存。(3)50×TAE缓冲液称取24.2gTris碱于容量瓶中，然后加入5.71mL的冰乙酸(17.4mol/L)和3.72gEDTA（pH8.0)，加去离子水溶解，并定容至100mL。(4)酚/氯仿/异戊醇按照体积比为25:24:1进行配制。(5)1×TSS缓冲液称取20.3gMgCl2(6分子结晶水)定容于100mL去离子水中，取其5mL加入1g蛋白胨，0.5g酵母粉，0.5gNaCl，10gPEG(3350)，5mLDMSO，加去离子水搅拌均匀后定容至100mL。0.22μm过滤除菌后，放于4℃保存。(6)溴化乙锭(EB,10mg/mL)在10mL去离子水中加入0.1g溴化乙锭，搅拌均匀，使其充分溶解，然后用吕箱包裹容器保存于室温避光保存。(7)EDTA溶液将18.6g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·H2O)加入80mL去离子水中充分溶解，用NaOH调节pH至8.0，定容至100mL。2细胞培养相关溶液的配制(1)胰蛋白酶消化液称取蛋白酶25mg，溶于10m1PBS溶液中，微孔滤膜过滤除菌。(2)双抗贮存溶液将100万单位青霉素(钠盐)、100万单位链霉素(硫酸盐)溶于100mL三蒸水中，过滤除菌，放于-20℃冻存。(3)细胞冻存液溶液取DMSO5mL，FBS10mL，加入细胞培养液中定容至50mL，过滤除菌备用。3Westernblot相关溶液的配制(1)30%丙烯酰胺将29g丙烯酰胺和1gN',N’-亚甲基丙烯酰胺溶于80mL去离子水中，充分溶解，定容至100mL，滤纸过滤后4℃避光保存。55 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文附录(2)1.5mol/LTris-Cl(PH8.8)将18.2gTris碱加入80mL去离子水中，充分溶解后加入4mL浓盐酸，调节PH值至8.8，加去离子水定容至100mL。(3)1.0mol/LTris-Cl(PH6.8)将12.1gTris碱加入80mL去离子水中，充分溶解后加入7mL浓盐酸，调节PH值至6.8，加去离子水定容至100mL。(4)10%SDS将10gSDS溶于50mL去离子水中，充分溶解后，定容至100mL。(5)10%过硫酸铵将0.1g过硫酸铵溶于少量去离子水中，并定容至1mL，放于4℃保存。(6)5×Tri-甘氨酸电泳缓冲液将15.1gTris碱和94g甘氨酸溶于900mL去离子水中，充分溶解后，加入50mL10%电泳级SDS，调节PH值至8.4，定容至1000mL。(7)5%SDS-PAGE浓缩胶试剂加样量30%丙烯酰胺0.83mL1.0mol/LTris-Cl(PH6.8)0.63mL10%SDS0.05mL10%过硫酸铵0.05mLTEMED0.005mL去离子水3.40mL总体积5.0mL(8)15%SDS-PAGE分离胶试剂加样量30%丙烯酰胺2.5mL1.5mol/LTris-Cl(PH8.8)1.3mL10%SDS0.05mL10%过硫酸铵0.05mLTEMED0.002mL去离子水1.10mL总体积5.0mL(9)转膜缓冲液将2.9g甘氨酸、5.8gTris碱和0.37gSDS溶于600mL去离子水中，充分溶解后，加水定容至800mL，然后加入200mL甲醇，混匀后室温保存。(10)PBS缓冲液(PH7.2-7.4)将8.0gNaCl、0.2gKCl、3.58gNa2HPO4·12H2O和0.24gKH2PO4溶于800mL去离子水中，充分溶解后，用浓盐酸调节PH值至7.4，然后加水定容至1000mL，高压灭菌后，放于4℃保存。56 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文附录(11)洗涤液(PBST,PH7.4)将0.5mLTween20加到1000mLPBS缓冲液中，充分溶解后，放于4℃保存。(12)封闭液将0.5g脱脂奶粉加到100mLPBST中，充分溶解后使用，封闭液要现用现配。57 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文作者简介作者简历个人情况姓名：李俭性别：女民族：汉族籍贯：山东省金乡县出生年月：1987.04.29婚姻状况：未婚教育背景2006.09-2010.07黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院动物医学专业获农学学士学位2010.09-2013.07黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院基础兽医学专业获农学硕士学位在研期间参与的课题与发表的论文1．《RBM3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定》已录用2．李士泽，李玲，高福久，李俭，赵雅楠，姜宁，杨焕民，李玉恒，林增.谷氨酰胺和L-肉碱对低温下肉羊抗氧化性能的影响.营养饲料,2012,48(7):43-463．赵雅楠，李玉恒，李昌盛，林增，李俭，杨焕民，李士泽.不同强度冷刺激对大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中CIRP表达的影响.应用与环境生物学报,2012,18(1):55-5958
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