《猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
密级：：论文编号中国农业科学院学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒Ｎｓｐ１２功能的探索研究ＥｘｌｏｒａｔｉｏｎｏｆＮｓ１２ＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅＰＲＲＳＶＬｉｆｅＣｃｌｅｐｐｙ硕士研究生：王同云指导教师：蔡雪辉研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物传染病病原学与流行病学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院２０１８年６月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究ExplorationofNsp12FunctioninthePRRSVLifeCycle硕士研究生：王同云指导教师：蔡雪辉研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物传染病病原学与流行病学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2018年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationExplorationofNsp12FunctioninthePRRSVLifeCycleM.S.Candidate：WangTongyunSupervisor：Prof.CaiXuehuiMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:EtiologyandepidemiologyforAnimalinfectiousdiseasesJune2018 独创性声明本人声明所呈交的论文媞我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除丁文中特别加以标注和致谢的地方外人己经发。尽我所知，论文中不包含苏他农或揋写过的研究成果？，也不包含为获得中ｒａ农业科学院或３ｔ它教荇机构的学位或证书而使用过的材料一＾与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢总。研究生签名：＾时间：年。５月闩＾关于论文使用授权的声明本人完全了解中困农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中囷农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同总中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：王Ｊ习ａ时间：年ｒ月ｒ？／。■ＯＳ／ｎ导师签名：时间：年＾ 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目猪繁殖与呼吸综合征病＿Ｎｓｐｌ２功能的探尜研宄＂＂动论文作者王同云专业预防兽医学研宄方向｜｜｜‘学：Ｇ流？ｒｗ７｜＼＿＾指导教师蔡雪辉培养单位（研究所）哈尔滨兽医研宄所＂＂＂＂脱姓名职称；？：专业＾｜，二｜＃师东方教授业东北农大学颅防＆咲学中尔高玉龙研究员謙瓶学＾人＝＝￣ＣＷ郑Ｍ教授麵科大学＝免疫学露＿？连教拓成授吉林大学学业李艳华教授东北农大学ｓ础兽＾学［答硕导口屮圆农业科学院哈尔ｒｔＣ，ｗ，１７１古宏ｍＭ，ｒｆｉＲＶｉｆｒ１ｍｆｈ＾顶卩力＞＜Ｂ滨涔宄＾ｇ博导囡研所￣￣＾，？＞业硕导口中国农科学院哈ｒａ尔－＾＾＾ｄ王Ｍｒ｝ｆ＾ｒ＾ｔ關０總酬蕭委硕导□博和Ｍ口硕导博异口口硕导＿和Ｉ（会录秘书）议记汤艳东论答辩：文时间地点哈滨学２０１８０５８３尔啟匳研宂所的睬院十教％月丨Ｉ１丨点 摘要猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起严重威胁猪养殖业的传染病之一。20世纪80年代末至90年代初，该病最早在美国和欧洲等国家暴发和流行。PRRSV的主要特点是变异快、重组率高，这给PRRSV的防控带来巨大的挑战，而详尽研究并了解PRRSV的生物学特性，对于PRRSV的防控具有重要意义。根据生物信息学的预测与实验证实，PRRSVORF1a区与ORF1b区共编码14个非结构蛋白(Nsp)(FangandSnijder,2010)(FangandSnijder,2010)。其中Nsp1与PRRSV的亚基因组mRNAs的合成相关。Nsp2与Nsp3参与复制相关复合体DMVs(doublemembranevesicles)的形成。目前研究认为，PRRSV病毒的复制在DMVs上进行。Nsp4编码3C样丝氨酸蛋白酶。除此之外，Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4和Nsp11被证实与PRRSV抑制天然免疫信号通路相关。ORF1b区域编码4个Nsps(Nsp9至Nsp12)，Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），Nsp10是RNA解旋酶，已经有相关的报道证实Nsp9与Nsp10是高致病性PRRSV的致病基础。Nsp11具有核酸内切酶活性与去泛素化酶活性，此外Nsp11具有抑制NLRP3炎症小体与调节细胞周期的作用。在整个ORF1b区域，唯有Nsp12的功能尚不明确，并未见其相关报道。Nsp12含153aa，其分子量为17kDa，位于ORF1b区末端，能够提高IL-1β和IL-8的表达。除此之外，HSP70是研究比较明确的与Nsp12相互作用的蛋白质。抑制HSP70的表达能够显著降低病毒mRNA的合成及病毒的复制。本研究主要对Nsp12对病毒复制的影响及相关的生化特性进行分析。通过对不同PRRSV毒株间的Nsp12序列进行保守性分析；在感染性克隆的基础上构建Nsp12的缺失病毒，探索其对复制的影响；对Nsp12二聚化的现象及二硫键的特性进行相关的探索；在本实验室构建的复制子系统的基础上，对Nsp12是否参与病毒RNA的合成等问题进行相关的研究。研究表明，不同PRRSV毒株间Nsp12的氨基酸序列具有高度的保守性。Nsp12缺失不能够拯救病毒，表明Nsp12参与进PRRSV的复制并且对于PRRSV的复制至关重要。生化分析结果显示Nsp12容易被氧化形成二聚体及多聚体，Nsp12与N蛋白的二聚体形成都是由于细胞裂解后空气氧化形成二硫键，与N蛋白不同的是，Nsp12二聚体不存在于成熟的病毒粒子中。对Nsp12中3个半胱氨酸突变分析表明，第35位和79位Cys联合突变不能拯救出病毒，说明第35位和79位Cys对于PRRSV的复制至关重要。最后，构建了可以评价PRRSV负链RNA合成能力的复制子系统，并通过该系统初步证明只有ORF1a和ORF1b共同表达时才会有效的启动PRRSV负链RNA的合成，同时也初步证实Nsp12参与进了病毒RNA的合成过程。本研究初步探索了Nsp12的生化特性及功能，将为该蛋白的生物学功能探索奠定基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，Nsp12，功能I AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)iscausedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)andthreatensthepigindustryseriously.Fromthelate1980stotheearly1990s,thediseasefirstbrokeoutintheUnitedStatesandEurope.ThemutationandtherecombinationrateofPRRSVissohighthatposesagreatchallengeforustopreventandcontrolofit.StudyingandunderstandingthebiologicalcharacteristicsofPRRSVisofgreatsignificanceforthepreventionandcontrolofPRRSV.Basedonbioinformaticspredictionsandexperiments,14nonstructuralproteinswereencodedintheregionofORF1aandORF1bofPRRSV.Amongthem,Nsp1isassociatedwiththesynthesisofPRRSVsubgenomicmRNAs.Nsp2andNsp3areinvolvedintheformationofreplication-associatedcomplexdoublemembranevesicles(DMVs).CurrentresearchsuggeststhatPRRSVreplicationisperformedonDMVs.Nsp4encodesa3C-likeserineprotease.Inaddition,Nsp1α/β,Nsp2,Nsp4,andNsp11haveshowntobeassociatedwiththeinhibitionofinnateimmunesignalingpathways.ORF1bregionencodes4nonstructuralproteins(Nsp9toNsp12).Nsp9isanRNA-dependentRNApolymerase(RdRp)andNsp10isanRNAhelicase.RelatedreportshaveconfirmedthatNsp9andNsp10arePathogenic-relatedgenesofhighlypathogenicPRRSV.Nsp11hasendonucleaseanddeubiquitinaseactivity.Inaddition,Nsp11hasthefunctionofinhibitingNLRP3inflammasomeandregulatingcelllifecycle.IntheentireORF1bregion,onlythefunctionofNsp12isnotyetclear,andalmostnorelevantreportshasbeenreported.Nsp12contains153aminoacidsandthemolecularweightisabout17kDa.ItlocatesattheendoftheORF1bregionandcanincreasetheexpressionofIL-1βandIL-8.Inaddition,HSP70isarelativelywell-definedproteinthatcaninteractwithNsp12.InhibitionofHSP70expressioncansignificantlyreduceviralmRNAsynthesisandvirusreplication.Inthisstudy,theeffectsofNsp12onvirusreplicationandtherelatedbiochemicalcharacteristicswerestudied.WeanalyzedtheconservedNsp12sequenceindifferentPRRSVstrainsandconstructNsp12deletionmutantsbasedonvirusinfectiousclonetoinvestigatetheeffectofreplication;WealsoexploreNsp12dimerizationphenomenonanditstwodisulfidebonds.Onthebasisofthereplicatingsubsystemconstructedinourlaboratory,therelatedresearchonwhetherNsp12participatesinthesynthesisofvirusRNAisperformed.TheresultsshowedthattheaminoacidsequenceofNsp12amongdifferentPRRSVstrainswerehighlyconserved,andNsp12deletionfailedtorescuethevirusindicatingthatNsp12wascrucialforPRRSVreplication.BiochemicalanalysisshowedthatNsp12waseasilyoxidizedtoformdimersandpolymers.BoththedimerizationofNsp12andNproteinwerecausedbyoxidation.UnlikeNprotein,Nsp12wasnotpakagedinvirusparticles.AnalysisofthreecysteinemutantsinNsp12indicatedcombinationof35thand79thcysteinemutantsfailtorescuethevirus,thisindicatedthat35thand79thcysteineareessentialforthereplicationofPRRSV.Finally,wedevelopedamini-genomesystemthatusesfireflyluciferaseasareportertoevaluatethePRRSVnegativestrandsynthesis,andwedemonstratedthatcombinationsofopenreadingframes1a(ORF1a)andORF1barenecessaryforviralminus-strandRNAsynthesis.BasedII onthissystem,wealsodemonstratedthatNsp12hasbeeninvolvedinthesynthesisofvirusRNA.ThisstudyexploredthebiochemicalcharacteristicsandfunctionsofNsp12,whichwilllayafoundationforexploringthebiologicalfunctionoftheprotein.Keywords:Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,Nsp12,FunctionIII 目录第一章引言........................................................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）.............................................................................11.1.1PRRS病原学特征..........................................................................................11.1.2PRRSV分子生物学特征...............................................................................21.1.3PRRSV复制的生命周期...............................................................................41.1.4PRRSVRNA合成相关的复制转录复合体..................................................51.1.5PRRSVNsp12研究现状................................................................................61.2研究目的和意义......................................................................................................6第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究.............................................72.1材料和方法..............................................................................................................72.1.1菌株、细胞、质粒和载体............................................................................72.1.2实验相关的仪器、耗材与试剂.....................................................................72.1.3MegAlign软件分析不同毒株间Nsp12的序列差异...................................82.1.4点突变PCR构建Nsp12突变体质粒及感染性克隆...................................82.1.5PRRSVHuN4-F5及其Nsp12突变体感染性克隆的拯救.......................102.1.6TCID50法进行病毒滴度的测定..................................................................102.1.7间接免疫荧光鉴定HuN4-Nsp12突变体的拯救情况...............................102.1.8WesternBlot鉴定HuN4-Nsp12突变体的拯救情况..................................112.1.9WesternBlot对Nsp12真核质粒蛋白表达及二聚化的鉴定.....................122.1.10蔗糖密度梯度离心法纯化PRRSV粒子..................................................122.1.11复制子系统目的片段的PCR扩增...........................................................132.1.12DNA片段的回收.......................................................................................152.1.13载体与目的片段的酶切.............................................................................152.1.14载体与目的片段的连接.............................................................................162.1.15连接产物的转化与鉴定.............................................................................162.1.16小提质粒用于酶切鉴定.............................................................................16IV 2.1.17质粒的大量提取.........................................................................................172.1.18激光共聚焦检测Nsp12及其半胱氨酸突变体的定位............................172.1.19转染及荧光素酶活性检测.........................................................................182.2结果........................................................................................................................182.2.1不同毒株的Nsp12序列保守性分析..........................................................182.2.2感染性克隆基础上缺失Nsp12病毒的拯救..............................................192.2.3转染质粒及接种病毒细胞中Nsp12二聚化分析......................................202.2.4PRRSVNsp12中二硫键形成原因的分析..................................................212.2.5Nsp12不同于N蛋白二聚体的形成不存在于成熟病毒粒子..................222.2.6Nsp12表达质粒中半胱氨酸与二硫键形成的关系...................................222.2.7PRRSVNsp12半胱氨酸突变质粒在细胞中定位......................................232.2.8Nsp12三位半胱氨酸同时突变影响PRRSV拯救.....................................242.2.10PRRSV复制子的构建及功能评价...........................................................262.2.11通过复制子系统初步证实Nsp12参与病毒RNA合成..........................272.3讨论........................................................................................................................28第三章结论....................................................................................................................32参考文献..............................................................................................................................33致谢..................................................................................................................................39作者简介..............................................................................................................................40V 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称PRRSPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征NSPNonstructuralProtein非结构蛋白SgmRNASubgenomicmRNA亚基因组mRNASnSialoadhesin唾液酸黏附素β-Meβ-Mercaptoethanolβ-巯基乙醇PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应UTRUntranslatedRegion非编码区ORFOpenReadingFrame开放阅读框RNARibonucleicacid核糖核酸pppoly-protein多聚蛋白C-PRRSVClassicalPRRSV经典PRRSVRdRpRNAdependentRNApolymeraseRNARNA依赖的RNA合成酶EAVEquineArteritisVirus马动脉炎病毒LDVLactateDehydrogenase-elevatingVirus小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒RTCReplicationandTranscriptionComplex复制与转录复合体DMVDoublemembranevesicles双层膜泡HP-PRRSVHigh-pathogenicPRRSV高致病性蓝耳病SHFDSwineHighFeverDisease高热病IFNInterferon干扰素ISREIFN-stimulatedresponseelements干扰素刺激反应元件DTTDL-Dithiothreitol二硫苏糖醇NEMN-ethylmaleimide巯基烷化剂TCID50Tissuecultureinfectivedose50%组织细胞感染量aaAminoacid氨基酸TKRenillaluciferase海肾荧光素酶VI 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。它是近年来影响猪养殖业最重要的疾病。PRRSV临床表现为母猪严重的繁殖障碍，断奶仔猪肺炎、生长迟缓以及高死亡率等症状(Meulenberg,2000)。20世纪80年代末至90年代初，该病最早在美国和欧洲等国家暴发和流行(Keffaber,1989;Loula,1991)，随后迅速蔓延至亚洲及其它地区，造成养猪业巨大的经济损失。由于PRRSV危害严重，1992年世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类传染病。1995年，我国首次报道PRRS疫情，郭宝清等人从流产母猪胎儿中分离得到PRRSV，这是我国首次分离得到该病病原(郭宝清,1996)。随后PRRSV席卷全国，这些毒株被划分为经典型PRRSV，其临床特点是母猪繁殖障碍，断奶仔猪生长缓慢以及死亡率增高。随后，杨汉春等在多个疑似PRRS猪场中分离得到多株PRRSV(杨汉春,1997)。2006年，中国江西省首次报道高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，可感染各种月龄的猪，其特征性症状为高热（41～42°C）、高发病率（50%～100%）和死亡率（20%～100%），最初被称为“猪高热病（SHFD）”。童光志，田克恭等首次证实该病病原是高致病性的PRRSV的变异株(Tianetal.,2007)。在接下来的几个月里，这种疾病迅速蔓延到中国大部分省市和周边的一些国家如蒙古、越南、泰国、印度和老挝。与经典毒株相比，高致病性毒株拥有更严重的临床症状包括呼吸困难、结膜炎、腹泻、神经症状以及高发病率和高死亡率。尸检时观察到严重的肺水肿和硬化，淋巴组织出血坏死，脑内严重病变。HP-PRRSV具有更广泛的组织嗜性，能扩展到肝、肾、脑、心肺和淋巴组织(Tongetal.,2007)。自2013年起，在中国的中部地区几个免疫过疫苗的猪场暴发了PRRS，受感染的妊娠母猪流产和死胎，断奶仔猪有呼吸道症状(Zhouetal.,2015)，表明类NADC30毒株在中国广泛传播，并在许多省份成为当地流行的主要病毒株。虽然它们的致病性没有高致病性蓝耳病(HP-PRRSV)强，但是类NADC30毒株可以通过与其它病毒株的高度重组而改变自身的毒力(Zhaoetal.,2015)。并且在许多已经接种疫苗的猪场中频繁暴发类NADC30毒株的感染，表明当前商业化PRRS疫苗不能对当前的流行毒株提供完全的免疫保护(Lietal.,2016)。1.1.1PRRS病原学特征PRRSV有囊膜，其基因组为单股正链RNA，属于尼多病毒目（Nidovirales），动脉炎病毒科（Arteriviridae），动脉炎病毒属（Arterivirus）的成员。同属的还包括马动脉炎病毒(EAV)、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(LDV)、猴的出血热病毒(SHFV)。病毒粒子是圆形或是椭圆形，直径为50～60nm，外表面相对光滑。病毒的RNA被核衣壳包被，核衣壳外面是脂质双分子层，病毒的糖蛋白以及一些膜蛋白镶嵌其中，其病毒粒子如图1.1所示。PRRSV分为2个基因型，分别为I型（欧洲型）和II型(北美洲型)(Mengetal.,1995)。20世纪在中国的流行毒株主要为II型(ZhouandYang,2010)。2008年，农业部将HP-PRRS列为一类动物疫病。现阶段，PRRSV在中国广泛流行，并出现多种重组高致病性PRRSV，这给中国PRRSV的防控带来严峻挑战(Zhaoetal.,2015;Zhouetal.,2018)。两种基因型均感染单核细胞和肺泡巨噬1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言细胞。基因型之间的同源性因比较的基因或蛋白而异，总的来说，非结构蛋白中Nsp1和Nsp2是病毒变异最大的部分，基因的同源性为50.5%～54.3%，蛋白的同源性为24.4%～28%。Nsp9是保守型最高的蛋白，其同源性为73.2%～75%。结构蛋白中最保守的是M蛋白，其同源性为75.2%～81.6%(Darwichetal.,2011)。图1.1PRRSV粒子结构模式图(Lunneyetal.,2016)Fig.1.1SchematicrepresentationofPRRSVvirion（CitedfromLunneyetal.,2016）1.1.2PRRSV分子生物学特征PRRSV的RNA是单股正链RNA，3′端有多聚腺苷酸的尾巴，全长大约15Kb，包含着11个已知的开放性阅读框，分别是ORF1a、ORF1b和ORF2-7区(Snijderetal.,2013)。PRRSV基因组如图1.2所示，其中ORF1a和ORF1b主要编码PRRSV的复制酶，一般被认为是病毒的非结构蛋白（Nonstructuralproteins，Nsp）编码区。ORF2-7编码病毒的结构蛋白，主要包括病毒表面糖蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、膜蛋白M和核衣壳蛋白N(Meulenberg,2000)，ORF2-7区域被广泛而深入的研究(Deaetal.,2000;Meulenberg,2000;Murtaughetal.,1995)。PRRSV包膜的主要成分是GP5和M蛋白，它们由二硫键连接形成异二聚体，是病毒囊膜表面主要的蛋白。如果在PRRSV的感染性克隆中将编码两者的基因缺失，导致无法产生病毒颗粒(Wissinketal.,2005)。GP5和M蛋白的主要功能是参与病毒结构的组成，在出芽期间引起病毒囊膜的突起。此外，GP5的功能还涉及到病毒粒子最初与细胞的结合以及与宿主的胞膜进行融合(Wissinketal.,2004)。许多的研究表明GP5上含有中和表位，并且其中和表位主要位于GP5的胞内区(PirzadehandDea,1997)。此外M蛋白上也存在中和表位(Yangetal.,2000)，拥有两个保守的糖基化位点，在1型PRRSV中位于173和179位天冬酰胺残基，在2型PRRSV中位于171和178位天冬酰胺残基，但该糖基化对于病毒的感染是非必须的。GP2糖蛋白在2型PRRSV中有256个残基（1型为253aa）。第1～40位氨基酸残基之间含有预测的N-末端信号序列（1型中为1～37位氨基酸），接着是大约168个残基的胞外域，单个跨膜螺旋和20个残基的胞内域(Wissinketal.,2004)。GP2含有两个糖基化的位点，十分保守，其分别位于173和179位的酪氨酸（1型PRRSV）以及178和184位酪氨酸（2型PRRSV）。由于一些2型PRRSV中并不存在184位酪氨酸的糖基化，因此该位点的糖基化对于PRRSV的复制是非必须的。E蛋白是囊膜上最小的非糖基化蛋白，由70～73位aa组成(Wuetal.,2001)。E蛋白存在单2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言一的预测TM螺旋，可能形成低聚离子通道(LeeandYoo,2006)。因此，这种蛋白质很可能参与病毒的融合和/或内化过程(Pintoetal.,1992)。这些蛋白形成质子通道，与细胞发生融合后会在PH值较低的内体中降低病毒内部的pH值，有利于基因组的释放(Facchinetal.,2003)。GP3由ORF3编码的被7个N连接的糖基糖基化的蛋白质。有报道指出GP3具有较高的抗原性，能够使仔猪对PRRSV产生较好的保护。近期也有明确报道GP3含有线性中和表位(Vanheeetal.,2011)。GP4糖蛋白由178aa组成，分子量31～35kD。它能像GP5那样产生中和抗体（欧洲型）(vanNieuwstadtetal.,1996)。GP4高度糖基化，具有4个潜在的糖基化蛋白位点，在欧洲型和美洲型之间较为保守(Meulenbergetal.,1997)。GP2/3/4形成的复合体可以与细胞的CD163受体相互作用(Dasetal.,2010)。CD163是PRRSV进入细胞最关键的受体(VanGorpetal.,2010)。N蛋白是由ORF7编码，较小，由123～128aa组成。在PRRSV粒子中的表达量很高，为病毒核衣壳的主要组成成分，它具备较高的免疫原性。抗原特异性的黏膜免疫在PRRSV感染后7～10d首次出现，首先产生的是针对N蛋白的抗体，但是该抗体无中和活性。具有中和活性的抗体在PRRSV感染14～28d出现在血液中，此后外周血中的病毒才会减少(Murtaughetal.,2002)。此外，在非还原条件下的N蛋白会形成二硫键连接的二聚体及多聚体的产生，为病毒核衣壳的组装奠定基础（SarahKetal.,2003）。近年来，越来越多的研究集中于ORF1a区与ORF1b区编码的非结构蛋白的生物学功能。ORF1a与ORF1b位于5′端，占据了基因组全长的3/4，编码相关的复制酶基因。根据生物信息学预测与实验证实，ORF1a区与ORF1b区共编码至少14个非结构蛋白(FangandSnijder,2010)。ORF1a区编码基因的特征及其相关的功能如下：Nsp1具有383aa，是位于PP1a肽链氨基末端的多功能蛋白，含有两个亚基：Nsp1α及Nsp1β。虽然Nsp1α比较保守，但是NSP1β高度多变(Murtaughetal.,1995)。Nsp1的切割是自我催化的，它的切割位点依据基因型的不同分别位于180位蛋氨酸或是组氨酸(Sunetal.,2009)。Nsp1α的木瓜蛋白酶样蛋白酶活性主要位于76位的半胱氨酸和146或147位的组氨酸。而Nsp1β的木瓜蛋白酶样蛋白酶活性在276半胱氨酸和345位的组氨酸(Kroeseetal.,2008)。由于其具有锌指结构区，Nsp1与PRRSV的亚基因组mRNAs合成相关(Kroeseetal.,2008)。并且该蛋白某些位点的突变可以阻止病毒复制(Tijmsetal.,2001)。Nsp1α木瓜样蛋白酶失活可以抑制SgmRNA的合成，但是基因组RNA的复制不受影响。而Nsp1β木瓜样蛋白酶失活就会使Nsp1β与Nsp2的分离受到影响，因此检测不到病毒RNA合成的迹象(Kroeseetal.,2008)。Nsp2是PRRSV所有非结构蛋白中最多变的非结构蛋白，尤其是其中央区域。该蛋白拥有4个功能域：N末端木瓜样蛋白酶结构域（PLP2）(Snijderetal.,2013)、非特异性的中枢功能区域、C末端的疏水区和1个保守的C末端尾部(Fangetal.,2006)。Nsp2在被感染的细胞中大量表达，与Nsp3和Nsp5非结构蛋白一起修饰被感染细胞的膜结构，从而有利于病毒复制复合物的组装。Nsp2同时也是1种新发现的结构蛋白，能够包装到正常的病毒粒子中(Kappesetal.,2013)，因此感染PRRSV的猪能够检测到Nsp2抗体。Nsp4是1种糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，该酶对于病毒的存活至关重要，因为它包含病毒蛋白酶的催化三联体（His1103-Asp1129-Ser1184），能够切割Nsp3～12成单个的非结构蛋白(van3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言Dintenetal.,1996)。此外，已有相关的报道证实Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4和Nsp11与PRRSV抑制天然免疫信号通路相关(Beuraetal.,2010;FangandSnijder,2010;Lietal.,2010;Shietal.,2011;Sunetal.,2010;Yooetal.,2010)。ORF1b区域编码4个Nsps(Nsp9～12)，Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）的活性，Nsp10具有RNA解旋酶的活性，杨汉春团队证实Nsp9与Nsp10是高致病性PRRSV的致病基础(Lietal.,2014)。Nsp11具有核酸内切酶活性与去泛素化酶活性(Shietal.,2011;Wangetal.,2015)。此外，Nsp11具有抑制NLRP3炎症小体与调节细胞周期的作用(Sunetal.,2014)。据相关报道，Nsp3、Nsp5、Nsp6、Nsp7和Nsp8非结构蛋白与病毒毒力相关(Kwonetal.,2008)。尽管对PRRSV的研究非常广泛，但我们仍然对某些病毒蛋白的结构和功能知之甚少，尤其是非结构蛋白Nsp12。图1.2PRRSV基因组结构模式图（引自http://viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/284.html）Fig.1.2TheStructureofPRRSVgenome（Citedfromhttp://viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/284.html）1.1.3PRRSV复制的生命周期PRRSV复制的生命周期如图1.3所示。病毒吸附到受体上，受体介导病毒内吞。到目前为止，CD163已被确定为主要的受体，介导病毒内化和去组装。据报道，CD169是1种唾液酸粘附素（Sn），可以通过与GP5/M受体的胞外区相互作用介导病毒内化(VanBreedametal.,2010)。然而，最近的一项研究表明将猪的CD169敲除后并不会影响PRRSV的吸附、内化。两个较小的结构蛋白GP2a和GP4确定为病毒吸附蛋白，能够与CD163相互作用介导病毒进入宿主细胞(Dasetal.,2010)。此外，将EAV的结构蛋白GP2a、GP3、GP4替换进PRRSV，形成的嵌合毒株细胞嗜性变得更为广泛(Tianetal.,2012)。这进一步说明病毒的糖蛋白是决定细胞嗜性的决定性因素。病毒进入细胞后，释放出病毒的基因组，病毒基因组是单股正链RNA，它首先翻译产生多聚蛋白pp1a-nsp2tf、pp1a-nsp2n、PP1a和pp1ab。这些多聚蛋白被病毒内部蛋白酶切割产生至少14种非结构蛋白，这些非结构蛋白被组装成复制和转录复合体RTC（Replicationandtranscriptioncomplex）。RTC定4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言位到特殊的双层膜泡上，参与负链RNA合成，产生负链全长基因组和负链亚基因组SgRNAs（SubgenomicRNA）。随后，负链SgRNAs作为模板合成正链SgmRNAs，用于表达病毒的结构蛋白。负链全长基因组RNA用于合成病毒的单股正链基因组RNA，并包装进核衣壳。其囊膜是病毒从光滑的细胞内膜出芽时形成的，新病毒粒子的释放是通过胞吐途径进行(Lunneyetal.,2016)。图1.3PRRSV的生命周期模式图（引自Lunneyetal.,2016）Fig.1.3ThepatternofPRRSVlifecycle（CitedfromLunneyetal.,2016）1.1.4PRRSVRNA合成相关的复制转录复合体RTC普遍存在于单股正链RNA病毒的复制场所，与病毒非结构蛋白修饰的细胞器膜结构相关。膜相关的复制转录复合体RTC必须定位到DMV上才能发挥转录复制的功能，DMV为RTC的功能行使提供合适的微环境，并且能够使病毒免受双链RNA合成过程中诱导的细胞抗病毒反应。有多种病毒复制酶参与了RTC的形成，它们能够改造细胞内膜，从而导致囊泡形成或膜内陷，创造病毒复制的环境。PRRSV基因组RNA的合成是以正链RNA为模板，在RdRp复合体的催化下，首先合成负链RNA。但是RdRp复合体的组份尚不清楚。目前已知PRRSV基因组RNA的合成是在DMVs（Doublemembranevesicles，DMVs）结构中进行的。RTC最终会形成病毒的全长的病毒基因组以及一些SgmRNA，SgmRNA参与病毒结构蛋白的合成，最终包裹病毒的基因组形成完整的病毒粒子。在EAV病毒中，DMV起源于内质网结构，Nsp2和Nsp3两个跨膜非结构蛋白共表达时就可以诱导动脉炎病毒感染后引发的典型的特殊膜结构。1个被预测存在于Nsp3的loop环结构中的四个半胱氨酸被替换掉就会阻断DMV的形成。与此同时发现这些5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言突变的Nsp3有很高的细胞毒性，对内质网结构的影响尤其严重(Nethertonetal.,2007)。1.1.5PRRSVNsp12研究现状尽管现阶段对PRRSV的研究非常广泛，但我们仍然对某些病毒蛋白的结构和功能知之甚少。尤其是非结构蛋白（Nsp）如Nsp5、Nsp6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8及Nsp12。这些非结构蛋白是病毒复制所必需的但是它们的功能仍然未知。几种病毒蛋白，包括Nsp1β、Nsp7、Nsp12和GP3蛋白已经确定能够抑制干扰素(IFN)刺激反应元件(ISRE)的表达，表明这些蛋白可能通过协同作用来抑制IFN介导的抗病毒反应，以此来为病毒的感染和复制争取时间(Wangetal.,2013)。Nsp12含153aa，其分子量为17kDa。以往的研究表明用PRRSV中等毒力的毒株VR2385感染Marc-145细胞及猪的肺泡巨噬细胞能够诱导STAT1分子在727位丝氨酸的磷酸化，从而激活信号通路，使IL-1β和IL-8等炎性因子显著提高。表明其PRRSV的致病机制可能与调节细胞相关基因的表达相关(Yuetal.,2013)。利用定量蛋白质组学以及免疫共沉淀的方法，在293T细胞中过表达Nsp12-EGFP的融合蛋白，结果显示有112种蛋白能够与Nsp12发生较高概率的相互作用，这些蛋白质大部分是核酸结合蛋白或分子伴侣，它们涉及到RNA转录后修饰、蛋白质的合成、细胞组装。在这些蛋白中HSP70是研究比较明确的与Nsp12相互作用的蛋白质。抑制HSP70的表达能够显著降低病毒mRNA的合成及病毒的复制。总的来说，Nsp12能够招募细胞蛋白HSP70来维持其稳定性，并且有利于病毒的复制(Dongetal.,2016)。此外，相关研究表明PRRSVNsp12能够与病毒的Nsp9相互作用，Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶的活性，因此Nsp12可能参与病毒RdRp的组成，从而参与病毒的复制与转录(田娇,2015)。1.2研究目的和意义PRRSV在我国的流行给我国养猪业带来巨大危害与损失，对PRRSV编码蛋白功能的解析将提高我们对PRRSV复制周期和病毒复制能力相关因素的认知，对PRRS的防控具有重要的指导意义。目前，ORF1b区被认为是与病毒RNA合成相关的主要区域，但是对该区域Nsp12的功能尚未见报道，阻碍了对这一领域的深入研究。本课题拟进行的Nsp12的功能探索将集中在以下两个方面的研究：第一，Nsp12是否参与了PRRSVRNA的合成。第二，对Nsp12的生化特性加以了解。以上研究将进一步了解Nsp12在PRRSV生命周期中发挥的作用，该科学问题的阐明将为PRRS防治策略的探讨以及抗病毒药物设计等提供参考。6 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究2.1材料和方法2.1.1菌株、细胞、质粒和载体本实验所用的感受态细胞是DH5α，购自Takara公司。所用的细胞是Marc-145细胞，293T细胞均由本实验室保存，复苏后使用。pCAGGS由本实验室购买并保存。所用的HuN4感染性克隆由本实验室构建(陶冶,2014)。涉及到的Nsp12突变质粒：Nsp12WT、Nsp12C29A、Nsp12C35A、Nsp12C79A、Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp12C35/79A、Nsp12C29/35/79A真核表达质粒以及HuN4-F5、HuN4-F5-Nsp12C29A、HuN4-F5-Nsp12C35A、HuN4-F5-Nsp12C79A、HuN4-F5-Nsp12C29A/C35A、HuN4-F5-Nsp12C29A/79A、HuN4-F5-Nsp12C35A/C79A、HuN4-F5-Nsp12C123A、HuN4-F5Del-Nsp12等感染性克隆的质粒均由自己构建。2.1.2实验相关的仪器、耗材与试剂相关仪器：PCR仪及微量移液器均购自德国EPPENDORF；BG-Power600电泳仪及摇床均购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统购自北京赛智创业科技有限公司；恒温金属浴购自上海精宏实验设备有限公司；荧光倒置显微镜及激光共聚焦显微镜均购自德国LEICA公司；超速离心机购自美国BECKMAN公司；蛋白电泳仪以及半干转膜仪购自Bio-Rad公司；DK-8D型恒温水浴锅购自金坛市医疗仪器厂；-20°C冰箱，-40°C冰箱，-70°C冰箱均购自中国海尔公司；细胞培养箱及台式高速离心机购自赛默飞公司；电子天平购自德国赛多利斯公司；连接仪购自德国Hermle公司；超净工作台购自HealForce公司；暗箱紫外线投射仪Galaxy公司；恒温培养摇床购自无锡玛瑞特有限公司。相关耗材：6孔细胞培养板(Corning,USA)、12孔细胞培养板(Corning,USA)、24孔细胞培养板(Corning,USA)、48孔细胞培养板(Corning,USA)、96孔细胞培养板(Corning,USA)、25mL细胞培养瓶(Corning,USA)、75mL细胞培养瓶(Corning，USA)和15mL及50mL离心管(Corning，USA)分子克隆相关的试剂：KODDNA聚合酶购自东洋纺生物公司；T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；相关的限制性内切酶购Thermoscientific公司；小提质粒试剂盒购自美国QIAGEN公司；大提质粒试剂盒购自美国Invitrogen公司。细胞培养以及转染相关试剂：胎牛血清（FBS）及DMEM培养基均购自美国Gibco公司；青链霉素和胰蛋白酶为哈尔滨兽医研究所自制；X-tremeGENEHPDNA细胞转染试剂购自Roche公司。实验相关的抗体：β-actin单克隆抗体、HA单克隆抗体、Flag单克隆抗体均购自Sigma公司。Nsp12单克隆抗体由哈尔滨兽医研究所翁长江老师课题组提供。激光共聚焦相关的试剂：DAPI、鼠源抗Flag标签单抗购自Sigma-Aldrich公司；FITC标记亲和纯化绵羊抗小鼠IgG（H+L）二抗购自美国JacksonImmunoResearch公司。7 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究荧光素酶（Luciferase）活性检测试剂盒购自Promega公司。2.1.3MegAlign软件分析不同毒株间Nsp12的序列差异为分析PRRSV毒株的Nsp12氨基酸序列差异，分别选取了2株经典毒株，VR-2332(GenBank:AYl50564)与CH-la(GenBank:AY032626)，3株高致病性毒株HuN4(GenBank:EF635006.1)，JXA1(GenBank:FJ548853)，JXWn(GenBank:HQ233604)通过MegAlign软件进行氨基酸序列分析。2.1.4点突变PCR构建Nsp12突变体质粒及感染性克隆针对Nsp12目的片段上存在的29位、35位及79半胱氨酸位点及第6-8位氨基酸位点设计相应的突变引物，将半胱氨酸突变为丙氨酸，6-8位氨基酸突变为三个连续的终止密码子。引物设计如下：Nsp12真核表达质粒第29位突变引物为Nsp12-C1A，第35位突变引物为Nsp12-C2A，第79位突变引物为Nsp12-C3A，终止密码子的突变体引物为Nsp12-ternination。表2.1点突变引物Table2.1Pointmutationprimers引物核苷酸序列（5’-3’）正/反义PrimersNucleotidesequence（5’-3’）SenseNsp12-C1AF：GTACTTGGACCCCGCGATGGGCCCTGCTC+Nsp12-C1AR：GAGCAGGGCCCATCGCGGGGTCCAAGTAC-Nsp12-C2AF：GGGCCCTGCTCTTGCGAACAGAAGGGTTG+Nsp12-C2AR：CAACCCTTCTGTTCGCAAGAGCAGGGCCC-Nsp12-C3AF:CAAAATTCTGGCGGCGGCGGAGTTCTCGC+Nsp12-C3AR：GCGAGAACTCCGCCGCCGCCAGAATTTTG-Nsp12-terninationF：GGCCGCCATTTCACCTAGTAATAACTTGCAAG+Nsp12-terninationR：CTTGCAAGTTATTACTAGGTGAAATGGCGGCC-在pCMV-Nsp12真核表达质粒的基础上构建Nsp12的质粒突变体分别命名为：Nsp12C29A、Nsp12C35A、Nsp12C79A、Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp12C35/79A、Nsp12C29/35/79A，pCMV-ORF1b作为中间质粒构建Nsp12相应的突变体，用于后期感染性克隆突变体HuN4-F5-Nsp12C29A、HuN4-F5-Nsp12C35A、HuN4-F5-Nsp12C79A、HuN4-F5-Nsp12C29A/C35A、HuN4-F5-Nsp12C29A/79A、HuN4-F5-Nsp12C35A/C79A、HuN4-F5-Nsp12C123A、HuN4-F5Del-Nsp12的构建，点突变的PCR的反应体系及步骤如下：8 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究表2.2点突变PCR反应体系Table2.2PointmutationPCRreactionsystem反应试剂试剂的量2×PCRBuffer50μLdNTPMixture(2mM)8μLF（Forwardprimer）2μLR（Reverseprimer）2μLDNA模板1μgRNA-freeH2O33μLTotalvolume100μL表2.3点突变PCR反应条件Table2.3PointmutationPCRreactionconditions反应温度/°C反应时间循环数955min9430s195530s1972根据片段大小决定197210min沉淀DNA：将PCR产物转移入无菌的1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，室温静置15min。离心：12000r/min离心10min，可在离心管底观察到少量的白色沉淀。溶解：用17μL的RNA-freeH2O溶解白色沉淀。对原始的模板质粒进行酶切消化：根据PCR反应后获得的质粒不具甲基化的修饰，而原始的模板质粒具有甲基化修饰的特点，应用DpnI限制性内切酶在甲基化位点酶切消化的特性，其可以损坏模板质粒，而保留PCR扩增之后点突变的质粒。于37°C水浴锅中酶切2h。反应体系如下：表2.4点突变PCR酶切体系Table2.4PointmutationPCRenzymedigestionreactionsystem反应试剂试剂的量溶解的白的沉淀17μL酶缓冲液10xBuffer2μL限制性内切酶DpnI1μLTotalvolume20μL9 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究转化：将酶切后的产物取10μL直接按上述步骤进行转化。鉴定：对挑取的单克隆菌落进行测序鉴定，得到正确的Nsp12中间体点突变。突变体感染性克隆的构建：将正确的Nsp12中间体点突变质粒酶切目的片段替换到HuN4-F5感染性克隆上。2.1.5PRRSVHuN4-F5及其Nsp12突变体感染性克隆的拯救对上述构建的HuN4-F5、HuN4-F5-Nsp12C29A、HuN4-F5-Nsp12C35A、HuN4-F5-Nsp12C79A、HuN4-F5-Nsp12C29A/C35A、HuN4-F5-Nsp12C29A/79A、HuN4-F5-Nsp12C35A/C79A、HuN4-F5-Nsp12C123A、HuN4-F5Del-Nsp12等感染性克隆进行拯救。步骤如下：（1）将生长状态良好的Marc-145细胞用含10%血清的DMEM重悬，铺于6孔板中。当细胞密度达到80%～90%时进行转染。（2）先将X-tremeGENEHPDNA转染试剂及无血清的DMEM从冰箱取出恢复室温，将转染试剂X-tremeGENEHPDNA和质粒按照1μg:3μL的比例加入到100μL无血清的DMEM中充分混匀，室温孵育15min。（3）将孵育完毕的转染复合物逐滴分散加入到细胞已经长好的6孔板中。（4）转染12h后换液，加入含2%FBS的DMEM新鲜培养液，将6孔板放于37°C，5%CO2的细胞培养箱中培养36～72h后观察细胞病变的情况，并用间接免疫荧光、WesternBlot等实验方法辅助检测。2.1.6TCID50法进行病毒滴度的测定（1）收集的细胞培养上清液用于测定PRRSV病毒滴度。（2）生长状态良好的Marc-145细胞胰酶消化，加有10%血清的DMEM重悬，接种于96孔板中，当细胞密度为80%时进行实验。（3）将待测病毒样品原液进行10倍稀释，做6个稀释度，每个稀释度设置8个重复孔，然后将稀释好的病毒液加入孔中，每孔加100μL，同时留下最后两列细胞作正常的细胞对照孔。（4）接种后5～7d在荧光显微镜下观察每个稀释度细胞病变的情况，并记录每个稀释度细胞病变孔数。（5）按Reed-Muench两氏法或Karber法计算出待测样品PRRSV病毒的TCID50。2.1.7间接免疫荧光鉴定HuN4-Nsp12突变体的拯救情况HuN4-F5、HuN4-F5-Nsp12C29A、HuN4-F5-Nsp12C35A、HuN4-F5-Nsp12C79A、HuN4-F5-Nsp12C29A/C35A、HuN4-F5-Nsp12C29A/79A、HuN4-F5-Nsp12C35A/C79A、HuN4-F5-Nsp12C123A、HuN4-F5Del-Nsp12等感染性克隆用间接免疫荧光检测其是否能拯救出病毒。（1）Marc-145细胞正常传代后铺于6孔板中（注意细胞不要铺太密）。（2）12～24h后，按X-tremeGENEHPDNA转染试剂的步骤将构建的感染性克隆及其突变体进行转染，每孔转染3μg质粒。10 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究（3）转染后48h后，弃上清，PBS洗3次（注意提前将PBS放在37°C水浴中预热）。（4）弃PBS，加2mL4%的多聚甲醛固定，室温静置30min后弃掉多聚甲醛，用PBS洗3次，5min/次，可在摇床上摇晃。（5）弃掉后加2mL0.1%TritonX-100透膜，室温静置15min，弃掉后加PBS2mL，洗3次，可在摇床上摇晃，5min/次。（6）加入5%的脱脂乳2mL，室温封闭1h，可室温静置孵育，也可在摇床上孵育。（7）用鼠源的N蛋白的单抗（1:200）进行孵育，37°C摇床上作用1h，对一抗稀释液进行回收，PBS洗3次，摇床上孵育5min/次。（8）用FITC标记亲和纯化绵羊抗小鼠IgG（H+L）二抗在摇床上室温孵育1h，避光，弃二抗后，PBS洗3次，5min/次，可在摇床上摇晃。（9）DAPI（1:1000）对细胞核进行染色，15min后弃去，加1mLPBS，5min/次，洗3次，可在摇床上摇晃。（10）在荧光倒置显微镜下观察处理的六孔板中的细胞样品，观察病毒的拯救情况。2.1.8WesternBlot鉴定HuN4-Nsp12突变体的拯救情况（1）将转染突变体后的细胞用强的RIPA裂解液(内含1%的PMSF)裂解细胞,收集待检测的蛋白样品，按样品的体积加入4LoadingBuffer，置金属浴10min，室温自然冷却后用于检测。（2）蛋白胶的配置，分离胶的浓度常为12%，浓缩胶的浓度常为5%(具体情况视目的条带的分子量而定)。蛋白胶配置完毕后，上样，将制备好的蛋白样进行凝胶电泳，设定的程序为80v30min在浓缩胶中电泳用于将大小蛋白压到同一起跑线上，120v1h在分离胶中电泳，按分子量大小分离目的条带。表2.5蛋白胶配制Table2.5Proteingelpreparation蛋白胶组分12%分离胶（25mL）5%浓缩胶（5mL）30%丙烯酰胺10mL0.83mLH2O8.25mL3.4mLTris-HC16.25mL（pH8.8）0.63mL（pH6.8）10%APS0.25mL0.04mL10%SDS0.25mL0.04mLTEMED8μL6μL（3）拆卸胶板，切去上层胶，剪裁合适大小的滤纸及硝酸纤维素膜，将剪好的硝酸纤维素膜先浸泡于甲醇中10min,然后将滤纸、硝酸纤维素膜、胶置于转膜液中备用，按照从上到下是滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸的顺序放置，进行转膜，15v，1.5～2h。（4）转膜结束后，用5%的脱脂乳进行封闭，置摇床上孵育2h。（5）PBST洗3次，15min/次，再分别用针对目的蛋白的一抗室温孵育2h,PBST洗3次,15min/11 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究次，然后用对应的二抗室温孵育1h，孵育结束后用用相同的PBST洗涤15min/次，3次。（6）曝光，检测蛋白的表达情况。2.1.9WesternBlot对Nsp12真核质粒蛋白表达及二聚化的鉴定293T细胞正常传代后铺于12孔板中，待生长到80%密度时转染Nsp12真核表达质粒及其质粒突变体。转染24后收获细胞，冷磷酸盐缓冲盐水（PBS），洗涤两次。用含1%甲基苯基磺酰基氟化物（PMSF）RIPAbuffe（r1%TritonX-100）裂解，冰上孵育20分钟后，细胞裂解液14000g/min离心30min，回收上清液,鉴定Nsp12的表达情况。在鉴定蛋白二聚化时，分别用含有β-ME或不含β-ME的4xloadingbuffer上样缓冲液以及含有0.5MDTT或不含DTT的4xloadingbuffer上样缓冲液处理样品。为防止空气对样品中蛋白的氧化作用，用含1%PMSF的RIPAbuffer（内含或是不含20mMN-ethylmaleimide,NEM）裂解。按上述步骤进行Western-Blot。2.1.10蔗糖密度梯度离心法纯化PRRSV粒子应用蔗糖密度梯度离心法纯化PRRSV的病毒粒子(刘杰,2016)，其过程如下：（1）细胞感染PRRSV，48h收集接种病毒的细胞上清,-20°C冰箱备用。（2）5000g/min离心20min，去掉细胞碎片。取上清液，内含PRRSV的病毒粒子。（3）取45mL经上述步骤处理后的细胞上清，分于5个超速离心管中，每管9mL。（4）用长的针头，向离心管中缓缓加入3mL的缓落剂，注意严格配平，超速离心对病毒粒子进行初步的浓缩和纯化。（5）用1.5mLPBS（PH=7.4）重悬附着于离心管底部的病毒粒子（注意：要确保吹打混匀）。（6）用带有长针头的注射器缓慢的将溶解的病毒粒子加入20%～60%的连续密度梯度蔗糖液体中，置超速离心机中离心，40000r/min，4°C离心20h。（7）离心后的病毒粒子用1mL的TEbuffer重悬。（8）超速离心时同时要设置PBS代替病毒液的空对照。（9）将纯化的病毒粒子通过WesternBlot检测相关蛋白的表达以及存在情况。表2.6不同浓度蔗糖的配制Table2.6Preparationofsucrosewithdifferentconcentration蛋白胶组分蔗糖（g）PBS（PH=7.4）20%10.0050mL30%15.0050mL40%20.0050mL50%25.0050mL60%30.0050mL12 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究2.1.11复制子系统目的片段的PCR扩增按如下的引物和体系对复制子系统相关的目的片段进行PCR扩增，以HuN4感染性克隆为模板，CMV-F和CMV-R引物用于扩增CMV启动子以及5′UTR。Luc-F和Luc-R引物用于从pGL3Basic质粒中扩增萤火虫荧光素酶的报告基因。BGH-F和BGH-R用于扩增3′UTR以及BGHpoly(A)加尾信号。用融合PCR融合各基因片段然后克隆至Tang-EGFP载体上，形成Mini-genomesystems。Nsp9片段用Nsp9-F及Nsp9-R引物扩增。Nsp10质粒用Nsp10-F及Nsp10-R引物扩增。ORF1a和ORF1b质粒分别用ORF1a-F，ORF1a-R引物以及ORF1b-F，ORF1b-R引物扩增。扩增所用的模板均为HuN4感染性克隆。然后将各基因片段构建至pCMV-HA载体上。扩增后的片段用0.8%～1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，在凝胶成像仪下察看结果。表2.7PCR扩增引物Table2.7PCRamplificationprimers引物核苷酸序列（5’-3’）正/反义PrimersNucleotidesequence（5’-3’）SenseCMV-F5′-GCAGATCTTTACATAACTTACGGTAAATGG-3′+CMV-R5′-CGGAAAGATCGCCGTGTAATTGGAGATTCAGAGGAAG-3′-Luc-F5′-CTTCCTCTGAATCTCCAATTACACGGCGATCTTTCCG-3′+Luc-R5′-CAGGGCACAAGTTCCAGCCACCATGGAAGA-3′-BGH-F5′-TCTTCCATGGTGGCTGGAACTTGTGCCCTG-3′+BGH-R5′-GCCTCGAGGCTCTCCCCAGCATGCC-3′-ORF1a-F5′-GCGGCCATGGAGGCCATGTCTGGGATACTTGATC-3′+ORF1a-R5′-AAAGCGGCCGCCTAGCAGTTTAAACACTGC-3′-ORF1b-F5′-GCCTCGAGGTTTTAAACTGCTAGCCGCC-3′+ORF1b-R5′-AAAGCGGCCGCTCAATTCAGGCCTAAAGTTGG-3′-Nsp9-F5′-GCGGCCATGGAGGCCCTAGCCGCCAGCGGCTTG-3′+Nsp9-R5′-AAAGCGGCCGCCTACTCATGATTGGACCTG-3′-Nsp10-F5′-GCGGCCATGGAGGCCGGGAAGAAGTCCAGAATG-3′+Nsp10-R5′-AAAGCGGCCGCCTATTCCAGGTCTGCGCAAATAGCGC-3′-表2.8PCR反应体系Table2.8PCRreactionsystem反应试剂试剂的量2×PCRBuffer50μLdNTPMixture(2mM)8μLF（Forwardprimer）2μLR（Reverseprimer）2μL13 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究续表2.8PCR反应体系Continuedtable2.8PCRreactionsystem反应试剂试剂的量DNA模版3μLKODDNA聚合酶1μLRNA-freeH2O34μLTotalvolume100μL表2.9PCR反应条件Table2.9PCRreactionconditions反应温度/°C反应时间循环数955min9430s355530s3572根据片段大小决定357210min融合PCR的步骤：将分别扩增的CMV-5’UTR、Lucreporter、3’UTR-HDV-BGHpA片段进行融合。表2.10融合PCR反应体系Table2.10OverlappingPCRreactionsystem反应试剂试剂的量2×PCRBuffer50μLdNTPMixture(2mM)8μL模版（CMV，Luc，BGH）各2ulKODDNA聚合酶2μLTotalVolume96ul表2.11融合PCR反应条件Table2.11OverlappingPCRreactionconditions反应温度/°C反应时间循环数955min9430s105530s1072根据片段大小决定107210min14 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究反应10个循环后，取出样品，各加2ulCMV-F以及BGH-R引物，按上述条件进行35个循环。2.1.12DNA片段的回收电泳产物使用OMEGA胶回收试剂盒进行回收，步骤如下：（1）紫外灯下观察电泳结果，快速切下目的条带，放入1.5mL的EP管中并切去多余的胶。（2）将装有凝胶块的EP管进行称量，计算质量，按照胶的密度为1g/mL进行估计。加入1倍体积的BindingBuffer，50～60°C水浴锅加热7min，每隔2～3min颠倒混匀1次，直到胶完全溶解。（3）将HiBindDNAMiniColumn放入1个2mLEP管中，向其中加入700μL凝胶溶液。10000g/min，室温离心1min，弃掉液体。（4）向离心柱中加入300μL的BindingBuffer（XP2），13000g/min，室温离心1min，弃掉液体。（5）向离心柱内加入700μLSPWWashBuffer，最大转速离心1min，弃掉液体。（6）重复步骤5。（7）空离，13000r/min离心2min，干燥HiBindDNAMiniColumn，将离心筒转移入1.5mL的无菌离心管中，做好标记。（8）向HiBindDNAMiniColumn的吸附膜中央加入30～50μL的ElutionBuffer或无菌去离子水，室温静置2min，最大转速离心1min，于-20°C条件下保存备用。2.1.13载体与目的片段的酶切将回收后的目的片段及载体按如下的体系用相同的限制性内切酶进行切割，已用于后续的连接反应。表2.12酶切反应体系Table2.12Enzymedigestionreactionsystem反应试剂试剂的量PCR片段或载体2μg酶缓冲液10xBuffer10μL限制性内切酶12μL限制性内切酶22μL去离子H2O84μLTotalvolume100μL37°C水浴锅反应2h。反应完毕后视情况按如上胶回收的步骤进行跑胶切胶回收或直接过柱回收。对酶切后的载体和目的片段进行纯化。15 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究2.1.14载体与目的片段的连接将酶切纯化后的目的片段与载体按如下体系进行连接：Nsp9、Nsp10、ORF1a、ORF1b构建至pCMV-HA载体上，将融合PCR的产物构建至Tang-EGFP载体上。表2.13DNA连接体系Table2.13DNAligasereactionsystem试剂用量10×T4DNAbuffer1μLT4DNAligase1μL限制性内切酶处理后胶回收的载体2μL限制性内切酶处理后胶回收后片段4μLH2O2μLTotalvolum10μL置于连接仪中，16°C过夜连接。2.1.15连接产物的转化与鉴定（1）将连接产物10μL加100μL（或50μL）DH5a感受态细胞。（2）置冰上冰浴30min，42°C热激90s,返回冰浴2min。（3）于超净台中加入700μL无抗LB，200r/min摇菌1h。（4）5000r/min离心2min，弃上清留100μL,吸打混匀后涂到相应抗性的LB固体培养基上。37°C温箱培养12～24h，观察菌落的生长情况。（5）将生长出的菌落用无菌的枪头分别挑到对应抗性的LB液体中，200r/min置摇床中孵育12h(氯霉素抗性需要避光孵育)。（6）按小提质粒的步骤对每管菌液进行质粒提取。（7）将提取的质粒进行PCR或是酶切鉴定，然后将鉴定正确的质粒送往长春库美公司进行测序验证。2.1.16小提质粒用于酶切鉴定（1）将生长于平板中的单菌落用无菌的枪头挑到高压灭菌装有4mLLB的试管中，每管对应一个单菌落，并做好标记。（2）置摇床中37°C，200r/min,待浑浊后取出，将2mL菌液倒入2mL离心管中。（3）10000g/min,离心1min,弃掉上清，保留菌体沉淀，用250μLSolutionI重悬。（4）加入250μLSolutionII,室温静置2min。（5）再加入350μLSolutionIII，此时会出现白色絮状沉淀。16 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究（6）置于离心机中，13000g/min,离心15min，将上清液转移至HiBindDNAMiniColumn中。（7）10000g/min离心1min，弃掉流下的液体，加入500μL的HiBindBuffer。（8）10000g/min离心1min，弃掉流下的液体，加入700μL的无水乙醇。（9）重复步骤8。（10）13000g/min空离2min,甩干膜上残留的液体后，将膜晾干。（11）加入30～50μLElutionBuffer或无菌去离子水，10000g离心1min，洗脱。（12）分光光度计测量质粒的浓度并进行标记。2.1.17质粒的大量提取（1）菌液按1:10000接种于500mL含有抗性的LB中，37°C摇菌14h至菌液浑浊即可大提。（2）将菌液加入500mL离心桶中（不要超过最大体积的80%），4°C，8000g/min，15min。向吸附柱中加入30mL的EQ1自然流尽。（3）弃离心桶中的上清，向桶内加入10mLR3(含RNaseA),先震荡后吹打均匀，转移至50mL离心管中，静置一会。（4）加入10mLL7，轻柔颠倒至均匀粘稠的液体，室温孵育5min。（5）加入10mLN3，迅速反复颠倒数次，看到大量絮状沉淀。（6）用滤纸过滤至吸附柱中，自然流尽，弃去滤纸中残留的白色沉淀。（此步骤也可以离心去除白色絮状沉淀，配平时用N3平衡）。（7）向吸附柱中加入60mL的W8，流尽。（8）换新的离心管，加入15mLE4，洗脱至新的离心管。（9）向离心管中加入10.5mL的异丙醇，4°C，10000g/min，30min，用于沉淀DNA（10）弃上清，加入5mL70%乙醇（现配现用），4°C，10000g/min，5min(小心，千万不能让白色DNA沉淀随液体流出)。（11）弃上清，晾干或吹风机吹干。（12）加入500～1000μLTE溶解质粒。（13）用分光光度计测量质粒的浓度，将质粒浓度定量到0.5～1µg/µL。2.1.18激光共聚焦检测Nsp12及其半胱氨酸突变体的定位激光共聚焦检测Nsp12WT、Nsp12C29A、Nsp12C35A、Nsp12C79A、Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp12C35/79A、Nsp12C29/35/79A真核表达质粒在293T细胞中的定位情况。具体步骤如下：（1）293T细胞正常传代后铺于共聚焦小皿中（注意细胞不要铺太密），12h后进行转染。（2）转染后24～36h，弃上清，PBS洗3次（注意提前将PBS放在37°C水浴中预热）。（3）弃PBS，加700μL4%的多聚甲醛固定，室温静置30min后弃掉多聚甲醛，用PBS洗3次，5min/次，可在摇床上摇晃；（4）弃掉后加1mL0.1%TritonX-100透膜，室温静置15min，弃掉后加PBS1mL，洗3次，可在摇床上摇晃，5min/次。17 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究（5）加入5%的脱脂乳1mL，室温封闭1h，可室温静置孵育，也可在摇床上孵育。（6）用鼠源的Flag单抗（1:200）进行孵育，37°C摇床上作用1h，对一抗稀释液进行回收，PBS洗3次，摇床上孵育5min/次。（7）FITC标记亲和纯化绵羊抗小鼠IgG（H+L）二抗在摇床上室温孵育1h，避光，弃二抗后，PBS洗3次，5min/次，可在摇床上摇晃。（8）DAPI（1:1000）对细胞核进行染色，15min后弃去，加1mLPBS，5min/次，洗3次，可在摇床上摇晃。（9）在激光共聚焦显微镜下观察处理的共聚焦小皿，并用CoLocalizerPro2.7.1软件进行分析。（10）观察完毕后，加入500μL50%的甘油-4°C保存，便于以后观察。2.1.19转染及荧光素酶活性检测（1）48孔板中接种Marc145细胞，待细胞密度达到90%时0.2μg的mini-genomesystem质粒DNA及0.01μg的海参荧光素酶质粒用X-tremeGENEHP转染试剂转入细胞中。海参荧光素酶作为内参来平衡荧光素酶的值。（2）转染18h后，每孔细胞接种0.01MOI的PRRSVHuN4。（3）24h后裂解细胞，用双荧光素酶报告系统试剂盒检测萤火虫荧光素酶的活性。（4）48孔板中接种293T细胞，待细胞密度达到90%时0.2μg的mini-genomesystem质粒DNA、0.01μg的海参荧光素酶质粒及1μg指定的质粒用X-tremeGENEHP共转入细胞中。（5）转染48h后检测萤火虫荧光素酶的活性。检测步骤如下：（1）弃掉48孔板中细胞的培养上清，用PBS洗3次，用吸水纸吸干孔中残留的液体。（2）将荧光素酶检测试剂盒中的5PassiveLysisbuffer，用ddH2O稀释成1PassiveLysisbuffer。（3）每孔加入80μL稀释好的1PassiveLysisbuffer，4°C裂解45～60min。（4）吸取细胞裂解液于1.5mLEP管中，4°C，12000r/min离心3min，取上清进行检测。（5）于1.5mLEP管中每管加入20μL萤火虫荧光素酶检测底物，加入10μL细胞裂解上清，与底物混匀后，立即放入荧光分析仪中读取Fluc荧光值。（6）然后取出1.5mLEP管加入20μLStopBuffer（海肾荧光素酶检测底物），立即放入荧光分析仪中读取Rluc荧光值，记录试验数据；（7）最终结果用Fluc值/Rluc值表示，使用Graphpad软件作图，用SPASS软件进行统计学分析。2.2结果2.2.1不同毒株的Nsp12序列保守性分析Nsp12为ORF1b区域的最后一个编码蛋白，与Nsp9、Nsp10、Nsp11同属于ORF1b区的成员，编码153aa(图2.1A)。为探讨PRRSVNsp12的功能，我们首先对PRRSV毒株的Nsp12进行氨基酸序列分析，分别选取了2株经典毒株，VR-2332(GenBank:AYl50564)与CH-la(GenBank:AY032626)，3株高致病性毒株HuN4(GenBank:EF635006.1)，JXA1(GenBank:FJ548853)，JXWn18 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究(GenBank:HQ233604)进行氨基酸序列分析。序列分析结果表明：Nsp12蛋白在经典毒株与高致病性毒株中高度保守(图2.1B)。高度保守的结构一般在生物学上具有重要意义，提示Nsp12可能在PRRSV的复制周期中发挥重要的功能。图2.1不同毒株的Nsp12保守性的分析。（A）PRRSV基因结构组成示意图。（B）经典毒株与高致病性毒株Nsp12氨基酸序列分析。Fig.2.1AnalysisofNsp12conservationofdifferentstrains.（A）SchematicdiagramofthestructureofPRRSVgene.(B)AnalysisoftheaminoacidsequenceoftheclassicalandhighlypathogenicstrainsofNsp12.2.2.2感染性克隆基础上缺失Nsp12病毒的拯救为进一步探讨Nsp12在PRRSV中的作用，我们通过反向遗传技术在HuN4-F5感染性克隆基础上对Nsp12基因进行缺失，即针对PRRSV的Nsp12编码区的第6至第8位氨基酸进行点突变，将氨基酸编码序列突变为3个连续的终止密码子，将构建的感染性克隆命名为PRRSVHuN4-F5Del-Nsp12（图2.2A）。然后将生长良好的Marc-145细胞铺于六孔板中，转染构建好的感染性克隆3μg，同时拿HuN4-F5的感染性克隆作阳性对照。5~7d之后进行检测，通过对N蛋白的间接免疫荧光检测是否能够拯救出病毒。在阴阳性对照组成立的条件下，未见Nsp12缺失毒株有可见荧光，表明Nsp12缺失的病毒株不能拯救出PRRSV（图2.2B）。同时通过Western-Blot的方法检测，也未检测到N蛋白的表达（图2.2C），进一步证实未能拯救出PRRSV。这些结果表明，Nsp12参与进PRRSV的复制，并且对PRRSV的复制至关重要。19 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究图2.2Nsp12点突变后病毒的拯救情况。(A)Nsp12点突变设计示意图。(B)间接免疫荧光检测PRRSV-HuN4-F5及PRRSV-HuN4-F5-del-Nsp12感染性克隆在Marc-145细胞上的拯救情况。(C)WesternBlot检测PRRSV-HuN4-F5及PRRSV-HuN4-F5-del-Nsp12感染性克隆N蛋白的表达情况。Fig.2.2VirusrescueafterNsp12deletion(A)ModelsofthepointmutationofNsp12.(B)IndirectimmunofluorescencewasusedtodetecttherescueofHuN4-F5andPRRSV-HuN4-F5-del-Nsp12infectiouscloneonMarc145cells.(C)WesternBlotwasusedtodetecttheexpressionofNproteininHuN4-F5andPRRSV-HuN4-F5-del-Nsp12infectiousclone.2.2.3转染质粒及接种病毒细胞中Nsp12二聚化分析通过构建Nsp12的真核表达质粒，用Nsp12的真核表达质粒转染293T细胞，转染24h后，用不含β-巯基乙醇(β-Me)的上样缓冲液处理细胞裂解样品，Nsp12有二聚化甚至多聚化的现象（图2.3A）。猜测这种二聚体及多聚体的产生与二硫键或其它非共价键的形成相关。为了证明该多聚体的形成是否与二硫键的形成有关，实验中选取了3种上样缓冲液，1种加有强还原剂β-ME，1种是非还原形式的缓冲液。其中N蛋白是已经报道的明确能够通过二硫键形成二聚化或多聚化的蛋白，因此用N蛋白的真核表达质粒作阳性对照。结果表明加入强还原剂β-ME后Nsp12二聚化的现象消失，说明Nsp12蛋白确实存在二聚化的现象（图2.3B）。该实验同时应用加有DTT的上样缓冲液处理细胞样品，DTT又名DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇，它常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键的形成。加入该试剂后得到了与β-ME相同的结果，同样证明了Nsp12存在二聚体（图2.3C）。20 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究为了验证在病毒感染的细胞内Nsp12是否也存在二聚体，用野生型HuN4PRRSV高致病性毒株,CH1aPRRSV经典毒株感染Marc-145细胞，得到相同的结果，同样证明Nsp12蛋白二聚化的形成（图2.3D,E）。图2.3Nsp12蛋白在质粒转染及接种病毒的细胞中均可形成二聚体。(A)含β-Me还原条件下，Nsp12表达质粒二聚化甚至多聚化的现象。(B)(C)分别含β-Me、DTT的还原条件下，N蛋白及Nsp12蛋白表达质粒二聚化的现象。(D)(E)含DTT的还原条件下，HuN4以及CH1a株N蛋白及Nsp12蛋白质粒二聚化及多聚化的现象。Fig2.3ThedimerizationofNsp12existsbothinplasmidtransfectionandvirusinoculationcells.(A)EvaluationthedimerizationorevenmultimerizationofNsp12ineukaryoticexpressionplasmidwithorwithoutβ-Me.(B)(C)EvaluationthedimerizationofNandNsp12proteinineukaryoticexpressionplasmidwithorwithoutβ-MeorDTT..(D)(E)EvaluationthedimerizationofNandNsp12proteininHuN4andCH1aviruswithorwithoutβ-MeorDTTrespectively.2.2.4PRRSVNsp12中二硫键形成原因的分析为了进一步探索二硫键的形成是由于Nsp12蛋白在细胞内形成，还是由于细胞裂解后Nsp12蛋白暴露于空气中被氧化的结果，我们引入了一种试剂N-ethylmaleimide(NEM),NEM是一种巯基烷化剂，细胞一旦裂解后巯基就会被甲基取代，使其保持细胞内单体的状态，不被氧化成二硫键，因此加入NEM后能够反映蛋白在细胞内的情况。将293T细胞正常传代后铺于12孔板中，待生长到80%密度时转染Nsp12及N蛋白的真核表达质粒，转染24h后用含1%PMSF的RIPAbuffer（内含或是不含20mMN-ethylmaleimide,NEM）裂解液裂解细胞，按上述步骤进行Western-Blot。引用N蛋白作为对照，研究表明N蛋白在细胞内是以单体的形式存在，但是在包装成的病毒粒子中具有二聚体形式。因此用NEM处理后二聚体的形式被破坏（图2.4A）。Nsp12经NEM处理后只有单体形式而无二聚体形式（图2.4B）。结果表明Nsp12与N蛋白相似，细胞内并不存在二聚体，二聚体形成由于处理细胞裂解过程中Nsp12暴露到空气中被氧化所致，并非21 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究细胞内二聚体形式的存在。图2.4Nsp12的中二硫键的形成是由于样品处理过程中被氧化的结果。(A)PRRSV病毒粒子中的N蛋白在细胞内有二聚化的形式存在(B)PRRSV病毒粒子中的Nsp12蛋白在细胞内无二聚化的形式存在。Fig2.4ThedisulfidebondsinNsp12isduetooxidationduringsampleprocessing.(A)DimerizationofNproteinexistsincells.(B).NodimerizationofNsp12proteinexistsincells.2.2.5Nsp12不同于N蛋白二聚体的形成不存在于成熟病毒粒子为了进一步探索Nsp12二聚体的产生是否经历了N蛋白相同的过程，只存在于成熟的病毒粒子中，结合之前的报道非结构蛋白Nsp2可以作为1种结构蛋白参与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）粒子的结构组成。我们大胆推测Nsp12蛋白是否像Nsp2蛋白和N蛋白一样可以包装进成熟的病毒粒子中。为了探索该问题，本实验采用蔗糖密度梯度离心法分离高度纯化的病毒粒子，结合WesternBlot检测，使用Nsp12单克隆抗体对纯化病毒粒子中的Nsp12蛋白进行检测。结果表明与Nsp2和N蛋白不同，纯化的病毒粒子中并不存在Nsp12蛋白，即Nsp12并非结构蛋白，不会像N蛋白一样包裹进成熟的病毒粒子，因此其二聚体的产生也与N蛋白不同（图2.5）。图2.5蔗糖密度梯度离心纯化的病毒粒子中不存在Nsp12Fig.2.5ThereisnoNsp12inthevirusparticlespurifiedbysucrosedensitygradientcentrifugation2.2.6Nsp12表达质粒中半胱氨酸与二硫键形成的关系对PRRSVNsp12的氨基酸序列进行分析发现在其29位，35位，79位存在3个半胱氨酸位点（图2.6A）。在质粒水平上分别构建29、35、79位Nsp12单半胱氨酸突变体分别命名为Nsp12C29A、Nsp12C35A、Nsp12C79A，双半胱氨酸突变体Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp1222 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究C35/79A，以及29、35及79位三半胱氨酸突变体Nsp12C29/35/79A共7种组合的突变，将涉及到的半胱氨酸均突变为丙氨酸。将这些突变的质粒分别转染293T细胞，用含有0.5MDTT的4xloadingbuffer上样缓冲液处理样品，在还原条件下分析各种Nsp12突变体的表达情况，结果表明任何单半胱氨酸突变体及双半胱氨酸突变体都不能影响二聚体的形成（图2.6B），唯有三个半胱氨酸位点都突变后才能没有二聚体以及多聚体的产生（图2.6C）。图2.6Nsp12真核表达质粒中半胱氨酸与二硫键形成的关系。(A)Nsp12WT、Nsp12C29A、Nsp12C35A和Nsp12C79A真核表达质粒中单半胱氨酸突变体二聚体的形成情况（B）Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp12C35/79A、Nsp12C29/35/79A和Nsp12WT(DTT)真核表达质粒中二聚体的形成情况。Fig.2.6TherelationshipbetweencysteineanddisulfidebondformationinNsp12eukaryoticexpressionplasmids.(A)DimersexistinNsp12WTandmutantplasmidsNsp12C29A,Nsp12C35A,Nsp12C79A.(B)DimersexistinNsp12C29/35A,Nsp12C29/79A,Nsp12C35/79Aplasmids,andnodimersinNsp12C29/35/79A,Nsp12WT(DTT)plasmids.2.2.7PRRSVNsp12半胱氨酸突变质粒在细胞中定位蛋白发挥的功能与其存在的位置具有直接相关性，我们检测Nsp12WT及其半胱氨酸突变体Nsp12C29A、Nsp12C35A、Nsp12C79A、Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp12C35/79A、Nsp12C29/35/79A真核表达质粒在细胞内的定位情况。293T细胞正常传代后铺于共聚焦小皿中，12h后转染表达Nsp12及其突变体的真核表达质粒，转染后24～36h后处理样品，通过激光共聚焦实验对Nsp12进行定位分析，发现Nsp12及其半胱氨酸的突变体均定位于细胞质中。表明半胱氨酸的突变并不影响PRRSVNsp12在细胞内的定位（图2.7）。23 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究图2.7Nsp12及其半胱氨酸突变体的亚细胞定位分析。（A）Nsp12、Nsp12C29A、Nsp12C35A和Nsp12C79A在293T细胞中的定位情况。（B）Nsp12、Nsp12C29/35A、Nsp12C29/79A、Nsp12C35/79A和Nsp12C29/35/79A在细胞中的定位情况。（绿色代表Nsp12的定位，蓝色代表DAPI染的细胞核位置。）Fig.2.7SubcellularlocationofNsp12anditscysteinemutants.(A)thelocalizationofNsp12,Nsp12C29A,Nsp12C35A,Nsp12C79AinMarc-145cells.(B)ThelocalizationofNsp12,Nsp12C29/35A,Nsp12C29/79A,Nsp12C35/79A,Nsp12C29/35/79AinMarc-145cells.(GreenrepresentsthelocationofNsp12protein,bluerepresentsthenuclearpositionstainedbyDAPI.)2.2.8Nsp12三位半胱氨酸同时突变影响PRRSV拯救为了进一步探索3个半胱氨酸位点对PRRSV复制的影响，在HuN4-F5感染性克隆的基础上构建了Nsp123个半胱氨酸同时突变的感染性克隆的突变体HuN4-F5-Nsp12C123A。将生长良好的Marc-145细胞铺于六孔板中，转染构建好的感染性克隆HuN4-F5-Nsp12C123A3μg，同时拿HuN4-F5的感染性克隆作阳性对照。5~7d之后进行检测，通过对N蛋白的间接免疫荧光检测是否能够拯救出病毒。结果在阳性对照成立的情况下，HuN4-F5-Nsp12C123A并不能成功拯救出病毒（图2.8A）。Western-Blot也得出相同的结果（图2.8B）。该实验证明第29、35、79位Cys对于PRRSV的拯救至关重要。24 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究图2.8(A)间接免疫荧光检测感染性克隆HuN4-F5以及NSP12半胱氨酸突变体HuN4-F5-Nsp12C123A感染性克隆的拯救情况。(B)Western-Blot检测感染性克隆HuN4-F5及其HuN4-F5-Nsp12C123A感染性克隆的拯救情况。Fig.2.8(A)DetectionoftheinfectiouscloneHuN4-F5anditsNsp12cysteinemutantsHuN4-F5-Nsp12C123Abyindirectimmunofluorescence.(B)DetectionoftheinfectiouscloneHuN4-F5anditsNsp12cysteinemutantsHuN4-F5-Nsp12C123AbyWestern-Blot.2.2.9Nsp12第35、79位半胱氨酸同时突变影响PRRSV拯救我们进一步想探索哪一个半胱氨酸位点对于PRRSV的拯救至关重要。因此我们即针对上述的3个半胱氨酸位点进一步分别构建了单半胱氨酸突变HuN4-F5-Nsp12C29A、HuN4-F5-Nsp12C35A、HuN4-F5-Nsp12C79A，2个半胱氨酸突变HuN4-F5-Nsp12C29A/C35A、HuN4-F5-Nsp12C29A/79A、HuN4-F5-Nsp12C35A/C79A共计6株Nsp12病毒的感染性克隆的突变体。Marc-145细胞正常传代后铺于6孔板中。12～24h后，按X-tremeGENEHPDNA转染试剂的步骤将构建的感染性克隆及其突变体进行转染，每孔转染3μg质粒。转染后48h后，用鼠源的针对N蛋白的单抗做间接免疫荧光，结果表明，在对照组成立即HuN4-F5感染性克隆可以成功拯救出病毒的前提下，单半胱氨酸突变即HuN4-F5-Nsp12C29A、HuN4-F5-Nsp12C35A、HuN4-F5-Nsp12C79A可以拯救出病毒。当29及35位Cys同时突变时即HuN4-F5-Nsp12C29A/C35A能拯救出病毒。第29、79位Cys同时突变即HuN4-F5-Nsp12C29A/79A能拯救出病毒。但当第35和79位Cys同时突变即HuN4-F5-Nsp12C35A/C79A拯救不出病毒。（图2.9A）。用N蛋白的单抗做WesternBlot得出相同的结果（图2.9B）。实验结果表明Nsp12中第35位和79位Cys对PRRSV病毒感染性克隆的拯救至关重要。25 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究图2.9(A)间接免疫荧光检测感染性克隆HuN4-F5以及NSP12半胱氨酸突变体HuN4-F5-C29A、HuN4-F5-C35A、HuN4-F5-C79A、HuN4-F5-C29A/C35A、HuN4-F5-C29A/C79A、HuN4-F5-C35A/C79A和HuN4-F5-C29A/C35A/C79A病毒的拯救情况。(B)Western-Blot检测感染性克隆HuN4-F5及其NSP12半胱氨酸突变体的拯救情况。Fig.2.9(A)DetectionoftheinfectiouscloneHuN4-F5anditsNsp12cysteinemutantsHuN4-F5-C29A,HuN4-F5-C35A,HuN4-F5-C79A,HuN4-F5-C29A/C35A,HuN4-F5-C29A/C79A,HuN4-F5-C35A/C79Abyindirectimmunofluorescence.(B)DetectionoftheinfectiouscloneHuN4-F5anditsNsp12cysteinemutantsbyWestern-Blot.2.2.10PRRSV复制子的构建及功能评价由于我们对PRRSV哪一个非结构蛋白参与其RNA的合成并不明确，因此我们设计了该系统用于评价PRRSV负链RNA的合成。Nsp12位于ORF1b区域，该区域被认为是与RNA聚合酶相关的区域，并且由图2.7可知，Nsp12定位在细胞质中，而PRRSVRNA合成的场所也在细胞质中。所以我们推测Nsp12可能直接或间接的参与PRRSV的RNA合成。该实验构建了1个能用于评价PRRSV负链RNA合成的系统，即PRRSV复制子(Replicon)系统（图2.10A）。其核心理念为：萤火虫荧光素酶基因以反向互补的方式插入5’UTR与3’UTR中间，当该系统转染进入细胞以后，CMV启动子启动下游RNA的转录。由于Luciferase为反向互补插入，不能合成荧光素酶蛋白，但是若系统中含有RNA聚合酶，能够以CMV启动合成的RNA为模板，合成负链RNA，则核糖体可以根据负链RNA序列合成荧光素酶蛋白。这样就可以通过荧光素酶的表达倍数来评价RNA聚合酶合成RNA的能力。该实验需要同时设立海肾荧光素酶作为转染内参。构建过程中，对CMV-5’UTR、Lucreporter、3’UTR-HDV-BGHpA3个片段分别进行PCR扩增，然后融合PCR（图2.10B）。将该片段连接载体Tang-EGFP，经BglII及XhoI双酶切及测序验证正确（图2.10C），复制子构建完成。进一步对该复制子进行功能验证，48孔板中接种Marc-145细胞，待细胞密度达到90%时0.2μg的mini-genomesystem质粒DNA及0.01μg的海参荧光素酶质粒用X-tremeGENEHP转染试剂转入细胞中。转染18h后，每孔细胞接种0.01MOI的PRRSVHuN4。24h后裂解细胞，用双荧光素酶报告系统试剂盒检测萤火虫荧光素酶的活性。结果表明感染PRRSV组的荧光素酶活性是对照组的9倍，表明可以成功启动复制子mini-genomesystem负链26 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究RNA的转录，该复制子体系构建成功（图2.10D）。图2.10（A）PRRSV复制子（Replicon）设计示意图。其中CMV为启动子，5’UTR为PRRSV5’端非翻译区，RCLuciferasereporter为萤火虫荧光素酶的反向互补序列，3’UTR为PRRSV3’端非翻译区，HDV为HDV核酶，用于转录的精确终止，BGHpA为转录加尾信号。（B）各个片段的分段扩增与融合PCR（Over-lappingPCR）将各个片段拼接。（C）连接载体的酶切鉴定。（D）复制子的评价。control：转染BAC空载体组；HuN4-F5：PRRSV-HuN4-F5感染性克隆转染组。用海肾荧光素酶（TK）作为转染内参。Fig.2.10(A)AschematicdiagramofPRRSVReplicon.CMVisthepromoter,5'UTRis5'enduntranslatedregionofPRRSV,RCLuciferasereporteristhereversecomplementarysequenceoffireflyluciferase,3'UTRis3'enduntranslatedregionofPRRSV,HDVisHDVribozymeusedforpreciseterminationoftranscription,BGHpAisatranscriptionplustailsignal.(B)AmplificationandfusioneachfragmentusingPCRandOverlappingPCR.(C)Identificationoftheconnectedvectorbyenzymedigestion.(D)Evaluationofthereplicon.Control:BACemptyvectortransfectiongroup;HuN4-F5:PRRSV-HuN4-F5infectiousclonetransfectiongroup.Co-transfectionwithRenillaluciferase(TK)asreference.2.2.11通过复制子系统初步证实Nsp12参与病毒RNA合成接下来，该研究应用构建完成的PRRSV复制子评价NSP12对PRRSVRNA合成的影响，通过将构建的复制子与相应的PRRSV的质粒及TK质粒共转染293T细胞，24h后检测萤火虫荧光素酶的表达情况。结果表明，单独的Nsp9与Nsp10与PRRSV的复制子mini-genomesystem共转时不能合成负链RNA，Nsp9和Nsp10共转时同样不能启动负链RNA的合成（图2.11A）。接下来我们进一步探索ORF1a与ORF1b对负链RNA合成的影响，结果发现单独的ORF1a或ORF1b不能启动mini-genomesystem，只有ORF1a与ORF1b区域共同转染才能激活mini-genomesystem（图2.11B），表明PRRSV的复制需要病毒的多种组份起作用，这也证实了PRRSV复制体的形成需要Nsp2与Nsp3的锚定。该系统成功后，我们在ORF1b真核表达质粒上对Nsp12质粒进行缺失突变，结果就失去了对mini-genomesystem的激活功能（图2.11C），表明Nsp12在病毒的27 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究RNA合成中至关重要。图2.11应用PRRSV复制子评价Nsp12对PRRSVRNA合成的影响。(A)Nsp9与Nsp10蛋白激活PRRSV复制子（Replicon）的情况。(B)ORF1a与ORF1b激活PRRSV复制子（Replicon）的情况。(C)Nsp12缺失突变体激活PRRSV复制子（Replicon）的情况。Fig.2.11ApplicationofPRRSVreplicontoevaluatetheeffectofNsp12onthesynthesisofPRRSVRNA.(A)EvaluationofthePRRSVrepliconactivationbyPRRSVNsp9andNsp10expression.(B)EvaluationofthePRRSVrepliconactivationbyPRRSVORF1aandORF1bexpression.(C)EvaluationofthePRRSVrepliconactivationbyNsp12deletionmutants.2.3讨论随着对PRRSV的研究不断深入，越来越发现非结构蛋白在PRRSV生命周期中扮演着非常重要的角色。它们有的参与病毒的复制转录与翻译，有的影响病毒的毒力，有的参与先天性免疫的逃逸，但Nsp12在PRRSV生命周期的功能研究甚少。以往的研究表明Nsp12能够使STAT1分子在727位丝氨酸的磷酸化，使IL-1β和IL-8等炎性因子显著提高，推测其与PRRSV的致病机制相关(Yuetal.,2013)。Nsp12还能够招募细胞热休克蛋白HSP70来维持其稳定性，并且参与进病毒的复制(Nethertonetal.,2007)。总的来说，Nsp12可以利用宿主蛋白来满足自身需求，对病毒的正常复制必不可少。虽然Nsp12与宿主蛋白的相互作用以及对细胞信号通路的影响有初步的研究，但从病毒的角度对Nsp12功能的解析还尚不明确。本文对PRRSVNsp12的功能进行初步的研究。通过比较多株PRRSVNsp12氨基酸序列，发现PRRSVNsp12具有高度保守性(图2.1B)，表明Nsp12可能发挥重要的生物学功能。为了进一步探索Nsp12对病毒复制的影响，在感染性克隆上构建了缺失Nsp12的突变体，通过间接免疫荧光技术及Western-Blot技术都检测不到PRRSV的存在（图2.2BC），实验结果表明Nsp12参与进了PRRSV的复制，并且对于PRRSV的复制至关重要。这与之前的报道一致，HSP70可以与病毒的Nsp12相互作用，抑制HSP70的表达能够降低病毒Nsp12蛋白的表达，并显著降低病毒mRNA的合成及病毒的复制，说明Nsp12能够招28 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究募细胞蛋白HSP70来维持其稳定性，并且参与进病毒的复制(Nethertonetal.,2007)。有趣的是我们构建了Nsp12的真核表达质粒，并检测其表达情况，结果在非还原性条件下，我们发现Nsp12出现不同于其它非结构蛋白的特点，有二聚体甚至多聚体的产生（图2.3A）。这可能与蛋白内部二硫键的形成相关，进一步的实验也确实Nsp12二聚体的形成是由二硫键连接。根据之前的相关报道，表明N蛋白在非还原性条件下可以形成二硫键连接的二聚体，然而加入一种巯基烷化剂(N-ethylmaleimide[NEM])，可以阻止二硫键的形成。这就表明N蛋白分子内部二硫键的形成是由于细胞裂解后被空气氧化所致（图2.4A）（(WoottonandYoo,2003)）。我们用相同的方法处理Nsp12真核表达质粒，同时引用N蛋白作阳性对照，结果表明Nsp12与N蛋白的结果相同，在加入NEM之后，Nsp12二聚化的现象也消失，说明Nsp12二聚体的形成不存在于细胞中，而是由于细胞裂解后，蛋白暴露于空气中氧化所致（图2.4B）。鉴于之前报道的PRRSV的非结构蛋白Nsp2可以作为病毒的结构蛋白包裹到病毒粒子中，我们大胆推测Nsp12是否可以像Nsp2蛋白一样作为一种结构蛋白（(Kappesetal.,2013)，经历与N蛋白相似的加工途径。因此我们纯化病毒粒子采用蔗糖密度梯度离心对病毒粒子中的Nsp12蛋白应用多克隆抗体进行鉴定。结果在成功检测到N蛋白的前提下，并未检测到Nsp12,说明Nsp12并不在于游离的病毒中，其二聚体的形成就是由于细胞裂解后空气氧化的结果。以前的研究表明N蛋白中同样存在3个Cys,分别位于第23位、75位及90位，而第23位Cys对于其二聚体的形成至关重要。参照N蛋白在Nsp12的真核表达质粒上对Nsp12的三个半胱氨酸进行点突变，同样构建了7株Nsp12半胱氨酸突变体，而研究表明只有当3个半胱氨酸位点全部突变时才不会产生二聚体，结果表明任何半胱氨酸位点都会导致Nsp12二聚体的产生。但是我们同时也推测真核表达质粒得到的现象并不能反映病毒的真实情况，所以有必要回归到感染性克隆上，做进一步的验证。进一步激光共聚焦实验表明，真核表达质粒水平上半胱氨酸的突变体并不影响其细胞的定位，说明半胱氨酸不影响Nsp12细胞定位信号序列，Nsp12定位于细胞质中。该场所是RNA病毒复制转录的场所，因此推测Nsp12在该处与病毒RNA的复制转录相关，半胱氨酸的突变体也没有明显的定位差异，表明它们功能的差异并非由定位差异引起。我们进一步探索了Nsp12中3个半胱氨酸位点对病毒复制的影响，我们在HuN4-F5感染性克隆的基础上，构建了一系列的半胱氨酸突变体，结果发现当3个半胱氨酸同时突变时，拯救不出PRRSV（图2.8AB）。接着构建了单个半胱氨酸突变以及两个半胱氨酸联合突变的突变体，结果发现，Nsp12中第35位和79Cys联合突变拯救不出病毒，说明这两个半胱氨酸位点对于病毒至关重要，我们推测这两个位点的突变可能直接影响到Nsp12蛋白正确空间构象的形成以及正常功能的行使。与此同时，我们也并未发现Nsp12二聚体的形成与其中半胱氨酸位点影响PRRSV复制之间必然的联系，因此推测半胱氨酸对PRRSV复制的影响与其二聚体的形成并无直接关系。因此我们并未发现Nsp12二聚体形成的生物学意义。目前，ORF1b区被认为是与病毒RNA合成相关的主要区域。通过构建复制子（Replicon）系统用萤火虫荧光素酶基因表达情况来衡量非结构蛋白对PRRSV负链RNA合成的影响。ORF1b区被认为是动脉炎病毒基因组最保守的区段，编码Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp124个非结构蛋白，研究表明Nsp9具有RdRp活性，Nsp10具有解旋酶的活性(Bautistaetal.,2002;Seybertetal.,2000)。对Nsp9进行密码子去优化，病毒的毒力就会因为影响病毒RNA的合成而降低(Gaoetal.,2015)。29 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究因此该实验我们首先推测Nsp9和Nsp10会激活复制子系统。令我们惊奇的是，单独的Nsp9和Nsp10并不能激活复制子系统，并且Nsp9和Nsp10共同表达的时候也不能激活复制子系统（图2.11A）。这与之前的报道说明纯化的马动脉炎病毒EAVNsp9未能结合到PRRSV基因组的3’端启动RNA合成结果一致(Beerensetal.,2007)。这提示PRRSVRNA的合成需要多种组分的参与。进一步的研究结果表明，只有ORF1a和ORF1b同时转染细胞时才会激活复制子系统（图2.11B），这些结果表明ORF1a和ORF1b对于PRRSV负链RNA的合成是必须的。这也与之前的研究报道说明PRRSV的RNA合成依赖于RTC定位到DMV是一致的(Pedersenetal.,1999)。DMV是所有动脉炎病毒感染细胞的标志(FangandSnijder,2010;Fukuokaetal.,2012)。PRRSV基因组RNA的合成是在DMV结构中进行的。有研究报道，DMV起源于内质网，Nsp2和Nsp3参与其形成(Posthumaetal.,2008;Snijderetal.,2001)。除此之外Nsp1的功能涉及到SgmRNA的合成(Kroeseetal.,2008)。Nsp7也与PRRSV的RNA合成息息相关（(Zhangetal.,2013)）。这些研究共同表明PRRSVRNA的合成需要多种组分共同参与，这就解释了ORF1a和ORF1b共同表达时才会激活复制子系统，我们的复制子系统将会是评价PRRSV负链RNA合成机制的有力工具。然而当我们在ORF1b的基础上缺失Nsp12后与ORF1b共转，结果其对复制子系统的激活倍数显著降低，初步证实Nsp12参与进了PRRSV的负链RNA合成过程，但是是否对于PRRSV的复制是必须的，还需要进一步的实验确认。虽然本实验从病毒的角度开启了对Nsp12研究，但是尚存在许多不足之处，我们只是在复制子系统上初步证明了Nsp12与病毒RNA的合成过程相关，并未从病毒的角度直接阐明其与RNA合成的关系，也不明确Nsp12影响病毒复制的哪个阶段，相关的实验内容仍需继续完善。此外，相关的报道用典型的动脉炎病毒EAV来探索复制转录复合体RTC的结构与功能。通过密度梯度离心法从EAV感染的细胞中分离到RTC，其中包含一些复制酶的亚单位以及新合成的mRNA，它们都位于一个比较重的膜结构上，它包含所有的RNA依赖的RNA聚合酶的活性，SgmRNAs从此复合体中释放(Nethertonetal.,2007)。PRRSV与EAV属于同属成员，PRRSV的多种非结构蛋白形成的RTC也需定位到DMV上才能行使其转录复制的功能。在研究相对深入的冠状病毒中（SARS）中，Nsp12为其RNA依赖的RNA聚合酶，它可以与非结构蛋白Nsp7和Nsp8形成三聚复合体，该复合体又可以与Nsp14相互作用。形成的这个蛋白复合体具有聚合酶和核酸外切酶等多种酶功能，是1个典型的由非结构蛋白组装行使转录复制功能的例子(Subissietal.,2014)。Nsp9为PRRSVRNA依赖的RNA聚合酶，相关报道已经证实PRRSV中Nsp9与Nsp12存在相互作用(田娇,2015)。我们也通过实验初步证实Nsp12参与进了RNA的合成，结合现有的研究背景和知识，我们推测Nsp12参与合成病毒RNA所必需的RNA转录复合体（RTC）的形成，这个问题也需进一步的探索证实。总之，本研究主要对Nsp12对病毒复制的影响及相关的生化特性进行分析。通过对不同PRRSV毒株间的Nsp12序列进行保守性分析；在感染性克隆的基础上构建Nsp12的缺失病毒，探索其对复制的影响；对Nsp12二聚化的现象及其半胱氨酸特性进行相关的探索；在本实验室构建的复制子系统的基础上，对Nsp12是否参与病毒RNA的合成等问题进行相关的研究。研究结果表明，不同PRRSV毒株间Nsp12的氨基酸序列具有高度的保守性并预示其具有重要的生物学意义。Nsp12缺失不能够拯救病毒，表明Nsp12参与进PRRSV的复制并且对于PRRSV的复制至30 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究关重要。生化分析结果显示Nsp12容易被氧化形成二聚体及多聚体，Nsp12与N蛋白的二聚体形成都是由于细胞裂解后空气氧化形成二硫键，与N蛋白不同的是，Nsp12二聚体不存在于成熟的病毒粒子中。对Nsp12中3个半胱氨酸突变分析表明，第35位和79位Cys联合突变不能拯救出病毒，说明第35位和79位Cys对于PRRSV的复制至关重要。最后，构建了可以评价PRRSV负链RNA合成能力的复制子系统，并通过该系统初步证明只有ORF1a和ORF1b共同表达时才会有效的启动PRRSV负链RNA的合成，同时也初步证实Nsp12参与进了病毒RNA的合成过程。本研究初步探索了Nsp12对于病毒复制及RNA合成的影响及其半胱氨酸的特性，将为PRRSV的深入了解及防治策略等提供参考。31 中国农业科学院硕士学位论文第三章结论第三章结论1.通过序列比对，发现PRRSV不同毒株间Nsp12的氨基酸序列具有高度的保守性。2.通过在PRRSVHuN4-F5反向遗传操作系统上构建Nsp12的缺失突变体，病毒拯救失败，证明Nsp12对于PRRSV的复制至关重要。3.在PRRSVHuN4-F5反向遗传的基础上构建Nsp12半胱氨酸的突变体，结果发现第35位和79位Cys联合突变病毒的拯救失败，说明第35位和79位Cys对于PRRSV的复制至关重要。Nsp12二聚体的形成是由于细胞裂解后被空气氧化所致，半胱氨酸功能的行使与其二聚体的形成无关。4.构建了可以评价PRRSV负链RNA合成能力的复制子系统，并通过该系统初步证明只有ORF1a和ORF1b共同表达时才会有效的启动PRRSV负链RNA的合成，且Nsp12参与进了病毒RNA的合成过程。32 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.郭宝清(1996).从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究.2.刘杰(2016).猪繁殖与呼吸综合征病毒颗粒定量检测及纯化方法的研究.3.陶冶(2014).HP-PRRSVHuN4株感染性克隆和嵌合病毒的构建及致病性分析.中国农业科学院,.4.田娇(2015).PRRSVN蛋白与非结构蛋白互作的筛选和验证.西北农林科技大学.5.杨汉春(1997).猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定.6.Bautista,E.M.,Faaberg,K.S.,Mickelson,D.,andMcGruder,E.D.(2002).Functionalpropertiesofthepredictedhelicaseofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Virology298,258-270.7.Beerens,N.,Selisko,B.,Ricagno,S.,Imbert,I.,vanderZanden,L.,Snijder,E.J.,andCanard,B.(2007).DenovoinitiationofRNAsynthesisbythearterivirusRNA-dependentRNApolymerase.Journalofvirology81,8384-8395.8.Beura,L.K.,Sarkar,S.N.,Kwon,B.,Subramaniam,S.,Jones,C.,Pattnaik,A.K.,andOsorio,F.A.(2010).Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein1betamodulateshostinnateimmuneresponsebyantagonizingIRF3activation.Journalofvirology84,1574-1584.9.Darwich,L.,Gimeno,M.,Sibila,M.,Diaz,I.,delaTorre,E.,Dotti,S.,Kuzemtseva,L.,Martin,M.,Pujols,J.,andMateu,E.(2011).GeneticandimmunobiologicaldiversitiesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromegenotypeIstrains.Veterinarymicrobiology150,49-62.10.Das,P.B.,Dinh,P.X.,Ansari,I.H.,deLima,M.,Osorio,F.A.,andPattnaik,A.K.(2010).TheminorenvelopeglycoproteinsGP2aandGP4ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinteractwiththereceptorCD163.Journalofvirology84,1731-1740.11.Dea,S.,Gagnon,C.A.,Mardassi,H.,Pirzadeh,B.,andRogan,D.(2000).Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus:comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates.Archivesofvirology145,659-688.12.Dong,S.,Liu,L.,Wu,W.,Armstrong,S.D.,Xia,D.,Nan,H.,Hiscox,J.A.,andChen,H.(2016).Determinationoftheinteractomeofnon-structuralprotein12fromhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruswithhostcellularproteinsusinghighthroughputproteomicsandidentificationofHSP70asacellularfactorforvirusreplication.Journalofproteomics146,58-69.13.Facchin,S.,Lopreiato,R.,Ruzzene,M.,Marin,O.,Sartori,G.,Gotz,C.,Montenarh,M.,Carignani,G.,andPinna,L.A.(2003).FunctionalhomologybetweenyeastpiD261/Bud32andhumanPRPK:bothphosphorylatep53andPRPKpartiallycomplementspiD261/Bud32deficiency.FEBSletters549,63-66.14.Fang,L.,Jiang,Y.,Xiao,S.,Niu,C.,Zhang,H.,andChen,H.(2006).EnhancedimmunogenicityofthemodifiedGP5ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Virusgenes32,5-11.33 中国农业科学院硕士学位论文参考文献15.Fang,Y.,andSnijder,E.J.(2010).ThePRRSVreplicase:exploringthemultifunctionalityofanintriguingsetofnonstructuralproteins.Virusresearch154,61-76.16.Fukuoka,M.,Minakuchi,M.,Kawaguchi,A.,Nagata,K.,Kamatari,Y.O.,andKuwata,K.(2012).Structure-baseddiscoveryofanti-influenzavirusAcompoundsamongmedicines.Biochimicaetbiophysicaacta1820,90-95.17.Gao,L.,Wang,L.,Huang,C.,Yang,L.,Guo,X.K.,Yu,Z.,Liu,Y.,Yang,P.,andFeng,W.H.(2015).HP-PRRSVisattenuatedbyde-optimizationofcodonpairbiasinitsRNA-dependentRNApolymerasensp9gene.Virology485,135-144.18.Kappes,M.A.,Miller,C.L.,andFaaberg,K.S.(2013).Highlydivergentstrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusincorporatemultipleisoformsofnonstructuralprotein2intovirions.Journalofvirology87,13456-13465.19.Keffaber(1989).AmAssocSwinePractNewsl20.Kroese,M.V.,Zevenhoven-Dobbe,J.C.,Bos-deRuijter,J.N.,Peeters,B.P.,Meulenberg,J.J.,Cornelissen,L.A.,andSnijder,E.J.(2008).Thensp1alphaandnsp1papain-likeautoproteinasesareessentialforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusRNAsynthesis.TheJournalofgeneralvirology89,494-499.21.Kwon,B.,Ansari,I.H.,Pattnaik,A.K.,andOsorio,F.A.(2008).Identificationofvirulencedeterminantsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusthroughconstructionofchimericclones.Virology380,371-378.22.Lee,C.,andYoo,D.(2006).Thesmallenvelopeproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruspossessesionchannelprotein-likeproperties.Virology355,30-43.23.Li,C.,Zhuang,J.,Wang,J.,Han,L.,Sun,Z.,Xiao,Y.,Ji,G.,Li,Y.,Tan,F.,Li,X.,etal.(2016).OutbreakInvestigationofNADC30-LikePRRSVinSouth-EastChina.Transboundaryandemergingdiseases63,474-479.24.Li,H.,Zheng,Z.,Zhou,P.,Zhang,B.,Shi,Z.,Hu,Q.,andWang,H.(2010).Thecysteineproteasedomainofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnon-structuralprotein2antagonizesinterferonregulatoryfactor3activation.TheJournalofgeneralvirology91,2947-2958.25.Li,Y.,Zhou,L.,Zhang,J.,Ge,X.,Zhou,R.,Zheng,H.,Geng,G.,Guo,X.,andYang,H.(2014).Nsp9andNsp10contributetothefatalvirulenceofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemerginginChina.PLoSpathogens10,e1004216.26.Loula(1991).Mysterypigdisease.Agri-Practice.27.Lunney,J.K.,Fang,Y.,Ladinig,A.,Chen,N.,Li,Y.,Rowland,B.,andRenukaradhya,G.J.(2016).PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus(PRRSV):PathogenesisandInteractionwiththeImmuneSystem.Annualreviewofanimalbiosciences4,129-154.28.Meng,X.J.,Paul,P.S.,Halbur,P.G.,andLum,M.A.(1995).PhylogeneticanalysesoftheputativeM(ORF6)andN(ORF7)genesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV):34 中国农业科学院硕士学位论文参考文献implicationfortheexistenceoftwogenotypesofPRRSVintheU.S.A.andEurope.Archivesofvirology140,745-755.29.Meulenberg,J.J.(2000).PRRSV,thevirus.Veterinaryresearch31,11-21.30.Meulenberg,J.J.,vanNieuwstadt,A.P.,vanEssen-Zandbergen,A.,andLangeveld,J.P.(1997).PosttranslationalprocessingandidentificationofaneutralizationdomainoftheGP4proteinencodedbyORF4ofLelystadvirus.Journalofvirology71,6061-6067.31.Murtaugh,M.P.,Elam,M.R.,andKakach,L.T.(1995).ComparisonofthestructuralproteincodingsequencesoftheVR-2332andLelystadvirusstrainsofthePRRSvirus.Archivesofvirology140,1451-1460.32.Murtaugh,M.P.,Xiao,Z.,andZuckermann,F.(2002).Immunologicalresponsesofswinetoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection.Viralimmunology15,533-547.33.Netherton,C.,Moffat,K.,Brooks,E.,andWileman,T.(2007).Aguidetoviralinclusions,membranerearrangements,factories,andviroplasmproducedduringvirusreplication.Advancesinvirusresearch70,101-182.34.Pedersen,K.W.,vanderMeer,Y.,Roos,N.,andSnijder,E.J.(1999).Openreadingframe1a-encodedsubunitsofthearterivirusreplicaseinduceendoplasmicreticulum-deriveddouble-membranevesicleswhichcarrytheviralreplicationcomplex.Journalofvirology73,2016-2026.35.Pinto,L.H.,Holsinger,L.J.,andLamb,R.A.(1992).InfluenzavirusM2proteinhasionchannelactivity.Cell69,517-528.36.Pirzadeh,B.,andDea,S.(1997).MonoclonalantibodiestotheORF5productofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusdefinelinearneutralizingdeterminants.TheJournalofgeneralvirology78(Pt8),1867-1873.37.Posthuma,C.C.,Pedersen,K.W.,Lu,Z.,Joosten,R.G.,Roos,N.,Zevenhoven-Dobbe,J.C.,andSnijder,E.J.(2008).Formationofthearterivirusreplication/transcriptioncomplex:akeyrolefornonstructuralprotein3intheremodelingofintracellularmembranes.Journalofvirology82,4480-4491.38.Seybert,A.,vanDinten,L.C.,Snijder,E.J.,andZiebuhr,J.(2000).Biochemicalcharacterizationoftheequinearteritisvirushelicasesuggestsaclosefunctionalrelationshipbetweenarterivirusandcoronavirushelicases.Journalofvirology74,9586-9593.39.Shi,X.,Wang,L.,Li,X.,Zhang,G.,Guo,J.,Zhao,D.,Chai,S.,andDeng,R.(2011).Endoribonucleaseactivitiesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnsp11wasessentialfornsp11toinhibitIFN-betainduction.Molecularimmunology48,1568-1572.40.Snijder,E.J.,Kikkert,M.,andFang,Y.(2013).Arterivirusmolecularbiologyandpathogenesis.TheJournalofgeneralvirology94,2141-2163.41.Snijder,E.J.,vanTol,H.,Roos,N.,andPedersen,K.W.(2001).Non-structuralproteins2and3interacttomodifyhostcellmembranesduringtheformationofthearterivirusreplicationcomplex.35 中国农业科学院硕士学位论文参考文献TheJournalofgeneralvirology82,985-994.42.Subissi,L.,Posthuma,C.C.,Collet,A.,Zevenhoven-Dobbe,J.C.,Gorbalenya,A.E.,Decroly,E.,Snijder,E.J.,Canard,B.,andImbert,I.(2014).OnesevereacuterespiratorysyndromecoronavirusproteincomplexintegratesprocessiveRNApolymeraseandexonucleaseactivities.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica111,E3900-3909.43.Sun,Y.,Li,D.,Giri,S.,Prasanth,S.G.,andYoo,D.(2014).Differentialhostcellgeneexpressionandregulationofcellcycleprogressionbynonstructuralprotein11ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.BioMedresearchinternational2014,430508.44.Sun,Y.,Xue,F.,Guo,Y.,Ma,M.,Hao,N.,Zhang,X.C.,Lou,Z.,Li,X.,andRao,Z.(2009).CrystalstructureofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusleaderproteaseNsp1alpha.Journalofvirology83,10931-10940.45.Sun,Z.,Chen,Z.,Lawson,S.R.,andFang,Y.(2010).Thecysteineproteasedomainofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein2possessesdeubiquitinatingandinterferonantagonismfunctions.Journalofvirology84,7832-7846.46.Tian,D.,Wei,Z.,Zevenhoven-Dobbe,J.C.,Liu,R.,Tong,G.,Snijder,E.J.,andYuan,S.(2012).Arterivirusminorenvelopeproteinsareamajordeterminantofviraltropismincellculture.Journalofvirology86,3701-3712.47.Tian,K.,Yu,X.,Zhao,T.,Feng,Y.,Cao,Z.,Wang,C.,Hu,Y.,Chen,X.,Hu,D.,Tian,X.,etal.(2007).EmergenceoffatalPRRSVvariants:unparalleledoutbreaksofatypicalPRRSinChinaandmoleculardissectionoftheuniquehallmark.PloSone2,e526.48.Tijms,M.A.,vanDinten,L.C.,Gorbalenya,A.E.,andSnijder,E.J.(2001).Azincfinger-containingpapain-likeproteasecouplessubgenomicmRNAsynthesistogenometranslationinapositive-strandedRNAvirus.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica98,1889-1894.49.Tong,G.Z.,Zhou,Y.J.,Hao,X.F.,Tian,Z.J.,An,T.Q.,andQiu,H.J.(2007).Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome,China.Emerginginfectiousdiseases13,1434-1436.50.VanBreedam,W.,VanGorp,H.,Zhang,J.Q.,Crocker,P.R.,Delputte,P.L.,andNauwynck,H.J.(2010).TheM/GP(5)glycoproteincomplexofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbindsthesialoadhesinreceptorinasialicacid-dependentmanner.PLoSpathogens6,e1000730.51.vanDinten,L.C.,Wassenaar,A.L.,Gorbalenya,A.E.,Spaan,W.J.,andSnijder,E.J.(1996).ProcessingoftheequinearteritisvirusreplicaseORF1bprotein:identificationofcleavageproductscontainingtheputativeviralpolymeraseandhelicasedomains.Journalofvirology70,6625-6633.52.VanGorp,H.,Delputte,P.L.,andNauwynck,H.J.(2010).ScavengerreceptorCD163,aJack-of-all-tradesandpotentialtargetforcell-directedtherapy.Molecularimmunology47,1650-1660.36 中国农业科学院硕士学位论文参考文献53.vanNieuwstadt,A.P.,Meulenberg,J.J.,vanEssen-Zanbergen,A.,Petersen-denBesten,A.,Bende,R.J.,Moormann,R.J.,andWensvoort,G.(1996).Proteinsencodedbyopenreadingframes3and4ofthegenomeofLelystadvirus(Arteriviridae)arestructuralproteinsofthevirion.Journalofvirology70,4767-4772.54.Vanhee,M.,VanBreedam,W.,Costers,S.,Geldhof,M.,Noppe,Y.,andNauwynck,H.(2011).Characterizationofantigenicregionsintheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbytheuseofpeptide-specificserumantibodies.Vaccine29,4794-4804.55.Wang,C.,Shi,X.,Zhang,X.,Wang,A.,Wang,L.,Chen,J.,Deng,R.,andZhang,G.(2015).TheEndoribonucleaseActivityEssentialfortheNonstructuralProtein11ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirustoInhibitNLRP3Inflammasome-MediatedIL-1betaInduction.DNAandcellbiology34,728-735.56.Wang,R.,Nan,Y.,Yu,Y.,Yang,Z.,andZhang,Y.J.(2013).Variableinterferencewithinterferonsignaltransductionbydifferentstrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Veterinarymicrobiology166,493-503.57.Wissink,E.H.,Kroese,M.V.,Maneschijn-Bonsing,J.G.,Meulenberg,J.J.,vanRijn,P.A.,Rijsewijk,F.A.,andRottier,P.J.(2004).SignificanceoftheoligosaccharidesoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusglycoproteinsGP2aandGP5forinfectiousvirusproduction.TheJournalofgeneralvirology85,3715-3723.58.Wissink,E.H.,Kroese,M.V.,vanWijk,H.A.,Rijsewijk,F.A.,Meulenberg,J.J.,andRottier,P.J.(2005).Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Journalofvirology79,12495-12506.59.Wootton,S.K.,andYoo,D.(2003).Homo-oligomerizationoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnucleocapsidproteinandtheroleofdisulfidelinkages.Journalofvirology77,4546-4557.60.Wu,W.H.,Fang,Y.,Farwell,R.,Steffen-Bien,M.,Rowland,R.R.,Christopher-Hennings,J.,andNelson,E.A.(2001).A10-kDastructuralproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyORF2b.Virology287,183-191.61.Yang,L.,Frey,M.L.,Yoon,K.J.,Zimmerman,J.J.,andPlatt,K.B.(2000).CategorizationofNorthAmericanporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses:epitopicprofilesoftheN,M,GP5andGP3proteinsandsusceptibilitytoneutralization.Archivesofvirology145,1599-1619.62.Yoo,D.,Song,C.,Sun,Y.,Du,Y.,Kim,O.,andLiu,H.C.(2010).Modulationofhostcellresponsesandevasionstrategiesforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Virusresearch154,48-60.63.Yu,Y.,Wang,R.,Nan,Y.,Zhang,L.,andZhang,Y.(2013).InductionofSTAT1phosphorylationatserine727andexpressionofproinflammatorycytokinesbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.PloSone8,e61967.64.Zhang,M.,Cao,Z.,Xie,J.,Zhu,W.,Zhou,P.,Gu,H.,Sun,L.,Su,S.,andZhang,G.(2013).37 中国农业科学院硕士学位论文参考文献Mutagenesisanalysisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein7.Virusgenes47,467-477.65.Zhao,K.,Ye,C.,Chang,X.B.,Jiang,C.G.,Wang,S.J.,Cai,X.H.,Tong,G.Z.,Tian,Z.J.,Shi,M.,andAn,T.Q.(2015).ImportationandRecombinationAreResponsiblefortheLatestEmergenceofHighlyPathogenicPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinChina.Journalofvirology89,10712-10716.66.Zhou,L.,Kang,R.,Xie,B.,Tian,Y.,Yang,X.,Yu,J.,andWang,H.(2018).CompleteGenomeSequenceofaRecombinantNADC30-LikeStrain,SCnj16,ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinSouthwesternChina.Genomeannouncements6.67.Zhou,L.,Wang,Z.,Ding,Y.,Ge,X.,Guo,X.,andYang,H.(2015).NADC30-likeStrainofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,China.Emerginginfectiousdiseases21,2256-2257.68.Zhou,L.,andYang,H.(2010).PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeinChina.Virusresearch154,31-37.38 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢三年的研究生生活转瞬即逝，还记得2014年的10月份作为一个懵懵懂懂的小本科生首次进入实验室实习，我就深深体会到老师、师兄师姐悉心的指导及无微不至的关怀。在实验室为期将近一年的实习为我日后基础理论的学习以及实验生涯的顺利进行都奠定的良好的基础。三年的硕士学习使我的理论知识得到极大的丰富，实验技能及科学思维都得到了系统的锻炼。回首三年时光，体验过实验进行不顺利时的焦躁悲伤，也体验过克服困难得到好结果时的欣喜若狂。在哈尔滨兽医研究所的日子，我收获了知识，收获了成长，收获了待我如亲人一样的老师、师兄师姐、同门、以及师妹和师弟。首先我要由衷的感谢我的导师蔡雪辉研究员。感谢您三年前给予我机会让我加入到流行病学团队这个温馨的大家庭。是您告诉我怎样去做一个合格的研究生，让我在日后的研究生生涯中有一个标准，遇事有一定的判断。实验中遇到解决不了的困难，或是需要帮助时，无论何时您总能放下手头的工作把我们的事情放在第一位，帮我分析问题，解决问题。您不仅是我学习的导师，更是我人生的导师。您了解每一位学生的性格，更注重学生人格的培养，因此总能在我失落，犹豫，徘徊不前时，给予我鼓励，警醒和追求探索的勇气。是您的陪伴与指导让我各方各面不断成长。其次我要感谢我的指导老师汤艳东老师，您在生活中扮演了老师和师兄的双重角色，作为老师不断跟我分享科研前沿的知识，悉心指导实验，毫无保留的传授我所有的实验技能，不断的跟我强调科研思维的培养，更为可贵的是总能在我犯错误时及时批评指正。但您更像是一个师兄，尊重每一个学生，不管什么时间，什么地点，不管多傻的问题，什么样的想法和疑问都能毫无心理压力的跟您交流。您对科研浓厚的兴趣爱好，对实验现象的深入分析和思考，不辞辛劳的工作态度，幽默风趣的处事风格，蔼然可亲的待人方式都深深的影响了我。感谢团队老师田志军老师，安同庆老师，刘永刚老师，涂亚斌老师，王刚老师，孙明霞老师，王淑杰老师，吕闯师兄给予的实验上的指导，生活上的照顾与鼓励，谢谢你们的帮助与陪伴。感谢本实验室师姐何海娟博士，师兄王海明博士，汪梦航博士感谢你们的照顾与包容。感谢房琼琼师姐、刘继婷师姐、张闪闪师姐、李海师兄、同门刘天昕硕士、郑琳琳硕士以及宋欢师妹、王书文师妹、熊俊垚师弟、杨月麟师妹对我实验与生活上的陪伴、关心与支持，是你们的陪伴让我的研究生生活充满活力，丰富多彩。同时也感谢李亮师姐，那雷师姐在实验上对我的指导与帮助。真心祝愿你们在未来的道路上学业顺利，家庭幸福。感谢公共仪器室杨涛老师，刘培新老师等在仪器使用上尽职尽责，不厌其烦给予的帮助，正是你们恪尽职守，才能使我们实验顺利有序的进行。最后衷心感谢我的家人，一路走来感谢你们在我背后默默的付出，你们的支持与鼓励永远是我前进的最大动力，没有你们，就没有今天的我。相信我会通过自己的努力，用自己的实际行动来报答你们。39 中国农业科学院硕士学位论文作者简介作者简介王同云，女，汉族，1991年6月9日出生于山东省潍坊青州。2011年9月就读于山东农业大学动物科技学院，专业为动物医学。2015年6月顺利毕业并获得农学学士学位。2015年9月至2016年5月在北京中国农业科学院学习理论知识。2016年5月至今在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所流行病学蔡雪辉老师团队进行进一步的研究学习，硕士期间研究的课题是PRRSVNsp12蛋白功能的探索研究。资助课题包括：十二五高技术研究发展计划（2011AA10A213）；国家自然科学基金项目（31201885）；兽医生物技术国家重点实验室开放课题基金项目（SKLVBF201410）。硕士期间曾获学业一等奖学金，2015级硕士研究生课程学习优秀奖，德惠奖学金，大北农励志奖学金，中期考核优秀奖等。以第一作者身份发表英文核心期刊1篇，以共同第一作者发表英文核心期刊4篇。发表文章：1.Tong-YunWang*,Yong-GangLiu*,LiangLi,etal.PorcinealveolarmacrophageCD163abundanceisapivotalswitchforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection.Oncotarget.2018,9(15):12174-12185.（第一作者）2.TangYD,LiuJT,FangQQ,TYWang,etal.RecombinantPseudorabiesVirus(PRV)ExpressingFireflyLuciferaseEffectivelyScreenedforCRISPR/Cas9SingleGuideRNAsandAntiviralCompounds.Viruses.2016,8(4):90.（共一作者）3.Yan-DongTang,Jin-ChaoGuo,Tong-YunWang,etal.CRISPR/Cas9-mediated2-sgRNAcleavagefacilitatespseudorabiesvirusediting.FASEBJ.2018.doi:10.1096（共一作者）4.Yan-DongTang,Ji-TingLiu,Tong-YunWang,etal.LiveattenuatedpseudorabiesvirusdevelopedusingtheCRISPR/Cas9systemVirusRes.2016Oct2;225:33-39.（共一作者）5.Yan-DongTang,Ji-TingLiu,Tong-YunWang,etal.CRISPR/Cas9-mediatedmultiplesingleguideRNAspotentlyabrogatepseudorabiesvirusreplication.ArchVirol.2017,162(12):3881-3886.（共一作者）6.TangYD1,FangQQ1,LiuJT2,WangTY1,etal.Openreadingframes1aand1boftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)collaborativelyinitiateviralminus-strandRNAsynthesis.（第四作者）40
此文档下载收益归作者所有
