我国市售大米中食源性致病菌—蜡样芽孢杆菌的检测和致病性分析

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分类类号密级UDC学校代代码10496硕士学位论文我我国市售大米米中食食源性致致病菌菌-蜡样样芽孢孢杆菌的的检测测和致病病性分分析DetectionandPathogenicanalysisoffood-bornepathoogen-BacilluscereusinChineserice论文文作者蒋荣荣指导导教师周帼帼萍副教教授学科科专业微生物物与生化化药学论文文提交日日期2013.05.20论文答辩辩日期2013.5.31答辩辩委员会会主席评阅人2013年5月 摘要蜡样芽孢杆菌是条件致病菌，广泛存在于自然界，通常引起呕吐和腹泻两种食物中毒。本研究，采用MPN法、鉴别培养基并结合ITS序列分析，检测、分离和鉴定了138份市售大米样品的蜡样芽孢杆菌检出情况。国内134份样品，109(81.3%)份检出蜡样芽孢杆菌群微生物；107份(79.9%)检出蜡样芽孢杆菌(含菌量为3.0～>1100CFU/g)，均值39.1CFU/g；7(5.2%)份检出苏云金芽孢杆菌，含菌量均值3.8CFU/g；1份(0.7%)检出蕈状芽孢杆菌，含菌量7.2CFU/g。原料源于泰国的3份样品中，蜡样芽孢杆菌检出率100%，含菌量16.9CFU/g；苏云金芽孢杆菌检出率66.7%，含菌量4.7CFU/g；而越南1份样品只检出苏云金芽孢杆菌，含菌量150.0CFU/g。共分离有285株蜡样芽孢杆菌群微生物，268株蜡样芽胞杆菌，16株苏云金芽孢杆菌，1株蕈状芽孢杆菌。不同气候区域、不同加工工艺的大米蜡样芽孢杆菌含量有显著差异(P<0.05)。蜡样芽孢杆菌对有利生长繁殖的气候区域有一定的选择性。利用PCR检测呕吐毒素合成相关基因ces，细胞毒素K基因cytK1、cytK2，溶血素BL基因hblC；非溶血性肠毒素基因nheB。各地区蜡样芽孢杆菌毒素检出率不等，在不同的气候区域，蜡样芽孢杆菌毒素的分布差异也极为显著(P<0.0001)。nheB(75.0%)在蜡样芽孢杆菌中普遍存在，其次是cytK2(55.2%)和hblC(43.3%)，cytK1检出率为零，90.3%(242/268)的菌株至少携带一种以上的肠毒素基因，即各地区蜡样芽孢杆菌普遍携带肠毒素基因。蜡样芽孢杆菌分离株在8℃～48℃可生长。18(6.7%)株在低温如10℃生长较好，111株(41.4%)可在48℃生长良好。大部分分离株(82.8%)具有β-溶血环或微弱局限溶血环,也有46株(17.2%)不溶血。16株苏云金芽孢杆菌的ces和cytK1均为阴性，87.5%的苏云金芽孢杆菌同时携带有cytK2、nheB和hblC。蕈状芽孢杆菌毒素基因均为阴性，但具有β-溶血环。37株(13.8%)蜡样芽孢杆菌含有ces基因，分布在15个省市地区，比国外的蜡样芽孢杆菌ces检出率高许多。这些ces阳性株携带肠毒素的情况是：cytK1II 和hblC均为阴性，只携带cytK2和/或nheB基因,，值得注意的是有35株(94.6%)ces和nheB同时存在，高于nheB在蜡样芽孢杆菌分离株中的检出率75%。多数可在10～48℃生长良好。经过HPLC-MS分析，凡含ces基因阳性的蜡样芽孢杆菌其呕吐毒素cereulide也能检出高峰值，反之，ces阴性菌株其cereulide未检出。化学定量分析和PCR结果能互相印证。关键词：食源性致病菌，蜡样芽孢杆菌，中国大米，呕吐毒素，肠毒素，PCR，HPLC-MSIII ABSTRACTBacilluscereusisaendosporefromingpathogenicbacteriumthatisubiquitousintheenvironmentandisfrequentlyassociatedemeticanddiarrhealtypesoffoodborneillness.Inthispaper,138samplesofricefromretailorsupermarketwereanalyzedfortheexamination,theseparationandtheappraisal,withMPNtest,chromogenicmediumandITSsequenceanalysis.Bacillusspecieswerefoundin109(81.3%)134ofthericesamplesfromdomesticdistrict.Ofthe109ricesamplesanalyzed107(79.9%)sampleswerepositiveforB.cereus(3.0～>1100CFU/g)withanmeanvalueof39.1CFU/g,7(5.2%)sampleswerepositiveforBacillusthuringiensiswithanmeanvalueof3.8CFU/g,1(0.7%)sampleswaspositiveforB.mycoideswith7.2CFU/g.ThethreericesamplesfromThailandwereallpositiveforB.cereuswithanmeanvalueof16.9CFU/g,andtwosamplesweredetectedB.thuringiensiswithanmeanvalueof4.7CFU/g.AndinonesamplefromVietnamonlyB.thuringiensiswasfoundwith150.0CFU/g.268ofthe285BacillusspeciesisolateswereidentifiedasB.cereus,16wereidentifiedasB.thuringiensisandonewasidentifiedasB.mycoides.TheamountsofB.cereusindifferentcilmateregionsandindifferentriceprocessingtechnologywerestatisticallysignificant(P<0.05).B.cereusmaybehavecertainselectivitytofavorablecilmateregionforthegrowthandreproduction.UseingPCRtheisolateswerecheckedforthepresenceofthecereulidesynthetasegene(ces),thecytK1andcytK2gensofcytotoxinK,thenheBgeneofthenonhemolytic(NHE)enterotoxincomplexandthehblCgeneofthehemolysinBL(HBL)complex.DifferentdistincthaddifferentdetcetionrateoftheB.cereustoxingenes.ThetoxinsdistributionofB.cereusindifferentcilmateregionswerestatisticallysignificant(P<0.0001).ThenheBgene(75.0%)aregenerallycommon,followedbycytK2(55.2%)andhblC(43.3%),andcytK1ofallisolatesIV werenegative.Whereas90.3%(242/268)isolateswerepositiveforatleastoneenterotoxingene,thatistosay,B.cereusgenerallyproducedenterotoxingeneseverywhere.B.cereusisolateswereabletogrowat8℃～48℃.ThemajorityofB.cereus(82.8%)werestronglybetahemolyticorweaklyhemolytic,andalso46isolates(17.2%)werenon-hemolytic.ThecesandcytK1genesof16B.thuringiensisisolateswerenegative,whilethecytK2,nheBandhblCgenessimultaneouslyof87.5%B.thuringiensisisolateswerepositive.ThetoxingenesofB.mycoideswereallnegative,butwasstronglybetahemolytic.37(13.8%)B.cereusisolatesproducedcesgene,widelydistributedin15regions,obviouslyhadhigherdetectionratethanothercounties.TheseisolateswereonlycapableofcytK2and/ornheBgenes.Itisworthnotingthat94.6%cespositiveisolateswerealsocapableofnheB,morethanthedetectionrate75%ofnheBthatinallB.cereusisolates.Mostofisolatesgrewwellat10～48℃.UsingHPLC-MS,allstrainscarriedcesgenehadhighconcentrationofcereulide,whereasthestrainsnotcarriedcesgenedidnotdetectcereulide.TheHPLC-MSresultcoincidedexactlywiththePCRdetection.Keywords:foodbornepathogen,Bacilluscereus,Chineserice,cereulide,enterotoxin,PCR,HPLC-MSV 目录第1章绪论…………………………………………………………11.1研究背景……………………………………………………………11.1.1食源性致病菌……………………………………………………11.1.2蜡样芽孢杆菌及其危害…………………………………………21.2蜡样芽孢杆菌的主要毒力因子和致病机理…………………………61.2.1呕吐型毒素……………………………………………………61.2.2腹泻型毒素……………………………………………………71.3分离鉴定方法……………………………………………………81.4蜡样芽孢杆菌研究现状……………………………………………111.5课题主要研究内容………………………………………………121.6本课题研究的目的和意义…………………………………………12第2章蜡样芽孢杆菌的分离、鉴定和地域分布研究.....................142.1材料………………………………………………………………142.1.1样品来源………………………………………………………142.1.2主要培养基……………………………………………………142.1.3仪器和设备……………………………………………………152.1.4主要试剂………………………………………………………162.1.5方法……………………………………………………………172.2结果和分析………………………………………………………192.2.1大米样品采样结果……………………………………………192.2.2蜡样芽孢杆菌的分离鉴定结果…………………………………192.2.3ITS序列分析结果………………………………………………212.2.4蜡样芽孢杆菌群在各地区的分布结果…………………………222.2.5大米样品蜡样芽孢杆菌的分布类型分析………………………232.2.6不同省市大米样品中蜡样芽孢杆菌结果………………………28VI 2.2.7不同气候区域大米样品蜡样芽孢杆菌情况……………………302.2.8不同工艺分类大米中蜡样芽孢杆菌结果………………………322.3讨论………………………………………………………………332.3.1蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定分析……………………………332.3.2蜡样芽孢杆菌的含菌量分析…………………………………342.3.3不同工艺大米中蜡样芽孢杆菌分析……………………………372.4小结………………………………………………………………38第3章呕吐毒素基因和肠毒素基因的PCR检测.............................403.1材料和方法…………………………………………………………403.1.1菌株……………………………………………………………403.1.2仪器和设备……………………………………………………403.1.3主要试剂………………………………………………………403.1.4方法……………………………………………………………403.2结果………………………………………………………………423.2.1各菌株毒素的PCR检测结果…………………………………423.2.2各地区蜡样芽孢杆菌毒素分布情况……………………………453.2.3其他蜡样芽孢杆菌群菌株毒素的PCR检测结果………………503.3讨论………………………………………………………………503.3.1蜡样芽孢杆菌肠毒素的分布分析………………………………513.3.2蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的分布分析……………………………523.3.3其他蜡样芽孢杆菌群菌株分析…………………………………523.4小结………………………………………………………………54第4章蜡样芽孢杆菌的热生长实验及表型特征研究.....................554.1材料和方法…………………………………………………………554.1.1菌株……………………………………………………………554.1.2培养基和试剂…………………………………………………554.1.3方法……………………………………………………………564.2结果………………………………………………………………57VII 4.2.1分离株在不同温度下生长情况…………………………………574.2.2淀粉和水杨苷水解试验结果……………………………………584.2.3溶血试验结果…………………………………………………584.3讨论………………………………………………………………594.3.1在不同温度下的生长分析………………………………………594.3.2淀粉和水杨苷水解试验分析……………………………………604.3.3溶血试验分析…………………………………………………604.4小结…………………………………………………………60第5章结论…………………………………………………………62参考文献………………………………………………………………64致谢……………………………………………………………………….74攻读学位期间的研究成果………………………………………………75VIII 第一章绪论第1章绪论1.1研究背景1.1.1食源性致病菌食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，常以食物中毒引起的突发事件为主，严重威胁着人类和动物的健康。我国于2001年建立食源性疾病监测网，已覆盖全国34个省、市和自治区，在2000-2009年报告[1]的3299起全国重大食物中毒案例中，微生物引起食物中毒案例占54.72%，且整体具有逐年增加的趋势。迄今，全球各个国家地区均建立了各自的食源性疾病监测体系。国外研究中，美国ElaineScallan等人[2]对2000-2008年所涉及的31种病原菌引起的疾病进行了调查和统计分析；结果表明，每年病原菌导致约3720万人患病，约940万人食物中毒，23万人住院，2600人死亡。主要的食源性致病菌包括沙门氏菌(Salmonella)，单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)，大肠埃希氏菌O157：H7(EscherichiacoliO157:H7)，阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)，肉毒梭状芽孢杆菌(clostridiumbotulinum)，志贺氏菌(Shigella)以及蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等。蜡样芽孢杆菌是条件致病菌。1950年在挪威发表了第一起蜡样芽抱杆菌食物中毒的报告，之后许多国家，尤其是欧洲一些国家相继报告了类似食物中毒的爆发。我国在上世纪70年代确认蜡样芽孢杆菌中毒事件后，此类中毒事件的报道逐年增多。我国国家食源性疾病监测网统计的人群食源性疾病爆发资料分析：1992～2001年[3]，微生物食源性疾病居首位38.5%(2221起)，其中蜡样芽孢杆菌中毒事件占6.8%，在细菌性病原体中排在第五。在2003～2007年，毛雪丹等[4]根据中国食源性疾病监测网报告资料，分析了1060起细菌食源性疾病事件，其中蜡样芽孢杆菌引起的食物疾病占11.4%(121起)，居第四位。ElaineScallan等[2]也对每年发生的B.cereus食物中毒进行了估计，食物中毒人次约有6.34万，住院人次约有20人，无人死亡。1 武汉轻工大学硕士学位论文C.W.Hedberg等[5]调查了美国疾控中心(CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC)报道的1982-1997年间的在餐馆爆发的2246起食物中毒案例，并对其临床资料进行了流行病学分析；分析结果，只有697(31%)例是明确病原菌的，其余69%中毒案例并未知查明是何病原菌，其中已知病原菌案例中，B.cereus和产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)、S.aureus、Salmonella均可引起呕吐或腹泻症状的食物中毒，与食物在存放不当的时间和温度下食用有关。B.cereus和S.aureus一样，可在食物中产生多种毒素，引起食物中毒的类似临床症状，但可以通过检测污染食物等来确定病原菌。现今，越来越多的人开始关注食源性致病菌蜡样芽孢杆菌。1.1.2蜡样芽孢杆菌及其危害(1)蜡样芽孢杆菌群广义的蜡样芽孢杆菌群包括相近的种有：蜡样芽孢杆菌(B.cereus)炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)，苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)，蕈状芽胞杆菌(B.mycoides)，假蕈状芽胞杆菌(B.pseudomycoides)和耐冷菌韦氏芽胞杆菌(B.weihenstephanensis)[6,7,8]。另一个新种Bacilluscytotoxicussp.(NVH391098(T))是在2013年由法国人GuinebretièreMH等[9]提出的，此菌分离自1998年法国爆发的一起严重的B.cereus食物中毒事件，通过采用16SrRNA、MLST序列、细菌脂肪酸分析、DNA-DNA杂交等方法，发现此种与时下公认的蜡样芽孢杆菌群的6个种，种间基因型和表型具有差异性。目前报道鉴定为该新种的菌株极少，为非常罕见特殊的高毒株。近年，研究学者陆续报道了另外2个属于蜡样芽孢杆菌群微生物的新菌种：B.gaemokensissp.(BL3-6(T))和B.manliponensissp.(BL4-6(T))，2010年均由韩国JungMY.等[10,11]分离自黄海潮滩沉积物。这两株菌与该群菌株的16SrRNA基因相似度分别为>98.1%和>97.5%。传统的细菌分型方法基于表型特征，如生理生化、血清型等，但区分度低、重复性差。现在分类研究大多采用多相分类法，将形态、生理生化、化学(DNA碱基GC分析、脂肪酸类型)、分子(DNA同源性分析，16SrRNA测序)等方法相结合，根据所得数据进行综合准确的分类。其中，分子分型是现今常用的方法，如16S/23SrDNA、随机扩增多态性DNA(Therandomamplifiedpolymorphic2 武汉轻工大学硕士学位论文DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)、脉冲凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)、多位点序列分型(MLST)和panC基因分型等等。因为蜡样芽孢杆菌群中B.cereus、B.thuringiensis和B.anthracis，基因同源性十分高，利用常规的生化实验方案、化学分类方法，抑或细菌共有的相关靶基因都不能很好的区分。蜡样芽孢杆菌群菌株很多有可区分的致病性标记归因于可转移质粒，如B.cereus的呕吐毒素基因ces位于pBCE4810大质粒上，而B.thuringiensis的杀虫晶体蛋白(insecti-cidalcrystalprotein，ICP)cry基因位于一个或多个质粒上[12]。利用这些标记特点，可以采用分子分型方法将蜡样芽孢杆菌群进行分类。16S/23SrDNA基因一直是细菌分型的最重要分型方法之一。RAPD费用低、不需预知待扩增基因组DNA序列、样品纯度要求不高等，缺点是在图谱中，引物长度和序列及引物数目、扩增基因条件等实验技术方面还未标准化，影响了不同条件下结果的可比性，且每个标记含有信息量少、假阳/阴性结果、无法进行等位基因分析等；AFLP优点是也不需要预知全基因组序列、无复等位效应，且带纹丰富、用样量少、快速灵敏等优点，但缺点是成本高、对样品DNA质量要求高，通常要利用同位素标记等；PFGE重复性好、分辨率高、易标准化等优点，缺点是操作复杂、费用高、电泳带型易受人为因素影响等[13]。MLST分析进化相对较慢的6~10个管家基因序列，研究具有代表性菌株的变异和流行病学及进化特征[14]。MLST分型不同于基于电泳图谱的分型方法，该法非常适合比较全球不同地区实验室的结果，所以越来越受到重视。目前已建立了全球病原菌MLST的数据库，截至2013年6月1日为止，B.cereus库中已有全球各地提交的序列1101个，profiles(MLST)753个(http://pubmlst.org/bcereus/)。SergeiG.Bavykin等[15]利用16SrRNA、23SrRNA和gyrB基因序列分析和鉴定了B.cereus群微生物间的系统发育关系。gyrB基因是细菌编码DNA促旋酶的B亚单位基因，对细菌的DNA的转录和复制十分重要，基于该序列分析与DNA杂交同源性有较好的一致性，适用于属内或属间关系的比较，近年来常用于细菌系统发育分析、细菌鉴定等。SergeiG.Bavykin等[15]基于16SrRNA和23SrRNA序列的差异将该群微生物分为7个亚群(Anthracis，CereusA，Cereus3 武汉轻工大学硕士学位论文B，ThuringiensisA，ThuringiensisB，MycoidesA和MycoidesB)，这七个亚群的进化分析显示，又殊途同归分属为两个截然不同的集群，其中B.cereus在6个亚群中均有分布，B.thuringiensisin也分布在3个亚群中；它们这种分属亚群的迥异情况，支持了二者不属于一个种。此外，B.cereus、B.thuringiensis和B.mycoides三种可通过16SrRNA、23SrRNA和gyrB基因序列鉴别分离；然而的这三个基因序列显示B.anthracis的同质性很高，所以rRNA和gyrB序列可用于鉴别B.anthracis。WenwanZhong等[16]利用脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)证明可将B.anthracis和B.cereus、B.thuringiensis鉴别开，从而支持了SergeiG.Bavykin等的亚群观点。GuinebretièreMH等[17]人利用多种分型方法探究了蜡样芽孢杆菌群的多态性聚类分析。采用荧光扩增片段长度多态性(FluorescentAmplifiedfragmentlengthpolymorphism，FAFLP)、核糖体基因序列、部分panC基因序列、耐冷型DNA特征等的分子数据以及该群生长范围、耐冷/耐热试验的描述特征，将该群分为七个类群；其研究结果表明菌群如何改变自身耐受温度范围来适应新环境塑造了该群具有全球分布的多态性。(2)蜡样芽孢杆菌B.cereus是蜡样芽孢杆菌群的模式菌株。B.cereus是兼性好氧、产芽孢的革兰氏阳性大杆菌，广泛分布于自然界中。菌体两端较平整，大小为1～1.5μm×3～5μm，多呈短链或长链，形成芽孢，芽孢呈卵圆形，位于菌体中央或稍偏一端，B.cereus生长温度范围极广(4℃～55℃)[6]，但是不适合低pH(最低5～6)或低水份(最低水活度aw是0.95)下生长[18]。在不利的环境中形成以芽孢进入休眠状态，一旦条件适宜即可萌发成营养体，常常导致食物腐败。蜡样芽孢杆菌群是许多不同真核生物的条件致病菌，包括动物、昆虫和线虫等。它们的致病性是能合成毒素，通常由质粒编码，或者如腹泻食物中毒的案例中由核基因组来编码；此外质粒的重要性在于可携带毒素，温和噬菌体可作为中介参与这些细菌使其更适于转到动物宿主上，最近报道的炭疽芽孢杆菌是最好的例子[19]。(3)蜡样芽孢杆菌污染和食物中毒4 武汉轻工大学硕士学位论文B.cereus能完成完整的一个腐生生命周期，是食品和化妆品中常见的污染菌[20]，也是人和动物的各种非肠道传染病的条件致病菌，可以导致人的眼部感染、脑膜炎和心内膜炎等疾病[21]，还可引起导管相关血流感染等[22]。B.cereus很少导致心内膜炎，但当患者有风湿性心脏病、人工心脏瓣膜修复、静脉注射药瘾、心脏起搏器和白血病等免疫力低时，B.cereus会成为致病菌；但在美国夏威夷市，BenjaminS.Thomas等[23]人首次发现无这些诱因的自体瓣膜心内膜炎病例，原因可能是患者曾腹泻性感染或者牙源性感染，或者二者皆有，导致了B.cereus的入侵。B.cereus作为常见的污染菌的报道越来越频繁。DolanS.A.等[24]报道了2011年1月美国一起由于医用酒精准备垫(alcoholpreppads，APPs)未彻底灭菌导致B.cereus污染事件，患者的血液或脑脊液的血培养为B.cereus阳性，最后制造商必须召回所有APPs产品。在许多食品中均检出有B.cereus，包括富含蛋白质的肉类、乳制品[20]、海鲜[25]、蔬菜、调味料、炒米饭或剩米饭、豆类食品[26]、面点或（意式面条）、鱼[27]、等等，尤其是富含淀粉类食品，如剩米饭或炒饭、意式面条类，最易引发B.cereus食物中毒。费飞[28]调查了我国辽宁葫芦岛市7～9月份采集的30份零售米饭中B.cereus污染情况，63.3%检出该菌，含菌量范围很广为102～108CFU/g；菌含量>105CFU/g的占57.9%。B.cereus在米饭蒸煮后，放置一段时间会导致该菌芽孢萌发大量繁殖。毕宇涵等[29]对183份黑龙江一些市县市售米面制品进行了B.cereus监测，18.1%样品检出该菌；熟制米线类、盒饭类、凉皮类检出率分别为30.5%、13.1%、8.0%。B.cereus食物中毒案件中，引发致吐型食物中毒的食品70%是粮食米面制品；腹泻型食物中毒的食物比较复杂，包括米面制品、肉制品和混合食物等[29]。B.cereus食物中毒包括两种类型：呕吐型和腹泻型。呕吐型B.cereus食物中毒潜伏期较短，一般0.5～6h，而腹泻型B.cereus食物中毒的潜伏期较长，一般在4h以上。LorraineMcIntyre等[12]对加拿大不列颠哥伦比亚省1991～2005年的39起食物中毒案例所分离的155株蜡样芽孢杆菌群类似株进行了呕吐毒素基因(nonribosomalpeptidesynthetase，NRSP)和杀虫晶体蛋白cry基因的重新鉴定，以及统计和分析了中毒案例的流行病学特征；其中，23例中毒事件是由5 武汉轻工大学硕士学位论文+－+B.cereus(包括5(12.8%)例NRPS和18(46.1%)例NRPSICP)引起的，4(10.3%)例为B.thuringiensisin，1(2.6%)例为B.mycoides，11(28.2%)例为混合芽孢杆菌。现下，欧盟国家都不列为杀虫剂B.thuringiensisin属于食源性致病菌，认为其很少与食源性疾病或其他人类疾病有关系。案例中还有一起与B.mycoides有关，致使2人产生腹泄、腹绞痛和发热症状。至今，虽然B.thuringiensisin和B.Mycoides并不属于食源性致病菌，但是它们与B.cereus基因的高度同源性，在食品卫生和安全方面仍是不容忽视的，需提高警惕。近年来，B.cereus中毒在我国各省市都有报道，中毒场所多以学生或员工食堂、饮食服务单位为多[30]。其中毒高发季节为春夏秋季，2月到10月为最常见。褚小菊[31]综合了我国1990-2009年报道记载的B.cereus引起米饭食物中毒事件，在各省市均有发生，发现中毒高发期是6～10月份，菌数一般在105～108CFU/g，30℃是呕吐毒素产生的最佳温度。中毒原因多数是剩米饭贮藏温度不当或者加热不彻底，同时暴露出公共饮食单位卫生环境不达标，操作人员卫生安全意识差。B.cereus中毒一般可自愈，但可导致死亡。在国外，1997年一名17岁男孩因食用放置了4d的意大利式细面条而死亡；因为B.cereus污染了面条，其呕吐毒素抑制了肝线粒体脂肪酸氧化使肝衰竭，最终死亡[32]。在比利时，MaríaNaranjo等[33]报道的一起20岁的年轻男孩因食用被B.cereus污染的意大利面而中毒死亡，检出呕吐毒素cereulide含量达14.8μg/g。B.cereus呕吐型食物中毒案例在全球呈现非常不均衡分布，北美未见报道，欧洲和亚洲是报道比较密集的，死亡案例的分布也是如此。1.2蜡样芽孢杆菌的主要毒力因子和致病机理B.cereus的致病性，不论是在肠道或非肠道的，都与组织破坏性/胞外酶产生有密切关系；这些分泌毒素包括4种溶血素，3种截然不同的磷脂酶，1个呕吐毒素和3种成孔—肠毒素：溶血素Hbl(HemolysinBL，Hbl)、非溶血毒素Nhe(nonhemolyticenterotoxin，Nhe)和细胞毒素K(cytotoxinK，CytK)[21]。目前研究中B.cereus的主要毒力因子是呕吐毒素和3种孔成形-肠毒素。AnnetteFagerlund等[34]研究表明这三个孔成形-肠毒素依赖于分泌移位途径。6 武汉轻工大学硕士学位论文1.2.1呕吐型毒素呕吐毒素cereulide是一十二环环状缩肽，具有三个重复序列的4个氨基酸和/或氧酸[cyclo(L-O-Val-L-Val-D-O-Leu-D-Ala-)3](1.2kDa)，它可在双分子脂膜上建立K+通道，可使线粒体肿胀并影响其功能[35]。致吐型B.cereus和耐冷型B.Weihenstephanensis可产生呕吐毒素cereulide。这种呕吐毒素在污染的食物中合成，如牛奶、米饭和意大利面条等，可能是菌株生长过程中的代谢产物；引起食物中毒时，会产生呕吐症状，通常是比较温和，但也会具有致命性。cereulide非常稳定，耐强酸、耐热、耐蛋白酶水解；不仅会致使人类食物中毒，也对动物造成伤害，甚至影响其他细菌。一般B.cereus引起的食物中毒比较温和，多数能在24～48小时内自愈。但呕吐毒素cereulide引起的食物中毒较危险，甚至会导致中毒者致死。1.2.2腹泻型毒素溶血素Hbl具有溶血性、导致皮肤坏死、可致兔皮肤血管渗透性反应，是导致腹泻型食物中毒的主要毒力因子[36]。它由两个溶血亚基L1和L2和结合亚基B组成，是最初其完整的组分分离自菌株B.cereusF837-76；hbl操纵子包括三个基因hblD、hblC和hblA，分别编码已知蛋白溶血亚基L1、L2和结合亚基B；hbl基因在蜡样芽孢杆菌群广泛存在[37]。AndersChristiansson等人[20]研究B.cereus产生的呕吐毒素和肠毒素对体外培养的HelaS3、Vero(continuouscelllineageoriginatedfromthekidneyofAfricangreenmonkeys非洲绿猴肾细胞)和HEL(Humanembryoniclungcell，人胚肺细胞)进行细胞毒性分析，发现HEL对毒素比其他细胞更敏感，所有产毒素阳性菌株中有92.2%菌株对Hbl产生了不同程度的毒性，可引起兔皮肤的血管渗透性反应；在8℃的牛奶天然培养基中，只有当B.cereus数量在1×108～3×108CFU/mL时，才会产生Hbl毒素；可见毒素量与菌株数量并无严格的相关性；温度、培养基、曝气或无充气状态等因素均会影响毒素产生，在牛奶和冰淇淋、曝气状态中，B.cereus更易产毒素。非溶血毒素Nhe，由NheA(41.0kDa)、NheB(39.8kDa)和NheC((36.5kDa)的三个蛋白毒素组成。nhe基因比hbl基因更普遍存在于蜡样芽孢杆菌群微生物中。当从菌株分离出来的时候，毒素量很低，却导致挪威爆发了一次大规模的7 武汉轻工大学硕士学位论文食物中毒。研究证实[38]该毒素对Vero、GH4和CaCo-2细胞具有毒性；当达到最大毒素浓度的毒素比例是NheA：NheB：NheC=10：10：1；Nhe和Hbl蛋白之间在氨基酸序列上具有很高的相似性，如溶血素HBL的L1亚基和Nhe的39kD蛋白相似；B.cereus肠毒素Hbl和Nhe蛋白的表达是由氧化还原敏感性双组分ResDE调控系统和Fnr(fumaratenitratereductionregulatoryprotein)调节；较小程度上会受分解代谢物控制蛋白CcpA(catabolitecontrolproteinA)，显示细菌的毒力和代谢有联系。细胞毒素K(CytK)的表达是由转录激活因子PlcR和它的激活肽PapR组成的细菌群体感应系统正向调控的，是由单一的基因编码的蛋白，可导致坏死性肠炎。从1988年法国爆发的B.cereus中毒中分离出的一株菌今GuinebretièreMH等鉴定为新种Bacilluscytotoxicus，是唯一一次肠毒素致死案例分离株，研究显示其肠毒素CytK1是罪魁祸首。该类细菌耐高温，在50℃生长良好，肠毒素CytK是其主要的致死因子，该毒素编码基因cytK与多数蜡样芽孢杆菌的cytK有高度同源性，但是又有明显不同，所以对应的基因被命名为cytK1和cytK2。肠毒素CytK1或CytK2，这两个组分的氨基酸同源性为89%，它们的一个重要不同点是生物毒性不一样；CytK1对人类肠道Caco-2上皮细胞具有很高的毒性，而CytK2对Vero细胞具有毒性，这表示，CytK1比CytK2毒性更严重，所以GuinebretiereM.H.等[39]建立了采用双重PCR去检测cytK1和cytK2基因，结果表明，双重PCR可快速有效的鉴别这两种基因。因此建立有效的方法去鉴别有毒和无毒株，是当务之急。1.3分离鉴定方法B.cereus的检测方法主要是传统的分离鉴定法、免疫学检测法和基于核酸的分子生物学方法。(1)传统检测方法传统检测方法，一是自动化微生物分析仪，以鉴定细菌的微量生化反应为基础；二是国内外普遍采用显色选择性培养基平板计数法和最大或然数(mostprobablenumber，MPN)法检测食品中B.cereus，将分离筛选到的疑似菌株做各种生化试验，以及显微镜检和蛋白质晶体试验等，再做血清分型。目前我国检8 武汉轻工大学硕士学位论文测B.cereus，多数采用国家标准GB/T4789.14-2003和进出口商品检验行业标准SN0176-1992[40](出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法)，我国将于2013年9月16日开始实施新标准SN/T0176-2013。国外以国际标准化组织(InternationalOrganizationforStandardization，ISO)如美国的USFDA/CFSAN标准[41]、欧盟国家的ENISO21871-2006[42](或者ISO7932-2004[43])标准、澳大利亚的AS5013.2-2007[44]标准等，以及加拿大的MFLP-42-2011[45]等。现今，我国学者们在检测致病菌时与国际接轨，兼并运用ISO和FDA及欧盟国家的标准。由于传统的检测B.cereus方法，整个程序需3～5d，时间长，程序复杂，对致病菌的检测特异性不高且检出限高，不能满足快速检测的需求。所以国内外也致力于研究某些特征性酶，如磷脂酶C，利用适当的底物来迅速鉴定或计数B.cereus。目前更高效灵敏更低检测限的选择性培养基被陆续研发。PengH.等[46]人利用培养基中含有一种特殊显色底物去检测B.cereus中的磷酸肌醇特异性磷脂酶C；利用此新型培养基BCM(BacillusChromogenicMedia，Brilliance)和MYP(MannitolYolkPolymyxinAgarplate，MYP)培养基，对133种细菌(包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和其他革兰氏阳性和阴性细菌)进行的选择培养证明此培养基具有良好的选择性，更容易辨出蜡样芽孢杆菌。后来，MartinaFricker等[47]人也利用另一种新型显色培养基CBC(ChromogenicBacilluscereusagar)和BCM培养基，分别与PEMBA(Bacilluscereusagar)和MYP培养基进行了对比试验；结合PCR验证，结果证明这2种新型的显色培养基用于食品中B.cereus的分离、鉴定和计数时，检测限和灵敏度均优于传统标准培养基。随后，SandarM.Tallent等[48]对四种B.cereus选择性培养基：MYP、PEMBA、BCM和Bacara，进行了有效评估，并利用在食物中人工掺杂金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coil)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和B.cereus，稀释成一定浓度梯度，比较B.cereus在MYP和Bacara培养基上的生长情况。实验验证了又一种新型的Bacara培养基比传统的MYP培养基更高效准确更低检测限的用于B.cereus计数。王慧莹[49]利用X-Gluc(5-溴-4-氯3-吲哚葡萄糖苷)作为菌体的特异性酶β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)的显色底物，采用计算机视觉技术通过提取和分析菌9 武汉轻工大学硕士学位论文落边缘或形态特征自动检测该菌位置，对其分类识别和计数，优于传统检测方法，检测时间仅5h，检出限50CFU/g。由于B.cereus和B.thuringiensis形态特征的相似性，此技术的菌落前处理方法会影响图像处理，需要快速灵敏高效的显色培养基是关键。(2)免疫学方法目前对蜡样芽孢杆菌肠毒素检测的免疫学方法比较多，如免疫扩散法、酶联免疫吸附(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)和反向被动乳胶凝集试验(reversedpassivelatexagglutination，BCET-RPLA)等。由于免疫学检出毒素蛋白较灵敏，检出限ng/mL，目前检测肠毒素Nhe和Hbl毒素应用最广泛的是TECRAEIA(酶免疫分析)和BCET-RPLA试剂盒[50]。MousumiBanerjee等[51]检测蜡样芽孢杆菌毒素结果是，采用BCET试剂盒检出Hbl毒素率为67%，而聚合酶链反应PCR(PolymeraseChainReaction，PCR)技术检出hblC有59%，有一定的漏检率。所以常利用免疫学技术与PCR或mPCR技术相结合来检测蜡样芽孢杆菌群的毒素基因和毒素能力。由于蜡样芽胞杆菌呕吐毒素没有抗原性，对cereulide检测采用生物测定方法，如公猪精子动力分析(boarspermatozoanmotilityassay)，Hep-G2细胞毒性分析、HelaS3、Vero以及HEL细胞毒性分析等。AndersChristiansson等发现HEL对肠毒素HBL比其他细胞更敏感。目前MaxMHäggblom等[52]建立了高效液相色谱-质谱(high-performanceliquidchromatography-massspectrometry，HPLC-MS)联用方法来定量检测蜡样芽孢杆菌中呕吐毒素cereulide，毒素含量范围为0.02～230μg/mL，检出限是0.02μg/mL；与公猪精子动力分析检出的毒素具有很好的一致性。(3)分子生物学方法具有快速、特异、灵敏等特点的PCR技术是研究中应用最多的分子生物学技术。研究学者利用该技术对蜡样芽孢杆菌目的基因进行引物设计，检测毒素的存在。T.D.KalyanKumar等[53]建立了采用多重PCR(multiplexPCR)技术对蜡样芽孢杆菌群微生物检测，包括蜡样芽孢杆菌群的hblA、nheA、cytK、cryIA和pag基因；结果显示，B.thuringiensis携带hblA、nheA、cytK和cryIA，而B.anthracis检出有cryIA和pag，B.cereus检出hblA、nheA、cytK。该技10 武汉轻工大学硕士学位论文术提高了最低检出限，下限底至101~102CFU/mL，尤其是检测食品中的菌株比纯培养的对照菌株更灵敏。NotomiT等[54]研发了环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)，AoiY等[55]还设计了实时定量LAMP。其他如DNA芯片技术(DNAMicroarrayTechnologies)[56,57]已成功应用到检测蜡样芽孢杆菌群微生物的肠毒素、磷脂酶和外毒素等；微阵列不仅可以检测微生物，还可用于芽孢杆菌群的基因芯片指纹图谱，芯片技术比常规的易出现假阳性PCR技术更具有高效率。YeB.等[58]设计研制了介观流控微球芯片(bead-basedmesofluidicsystem，BMS)，成功应用于食源性致病菌芯片技术。这些技术可实现在生物、医药、化学分析等领域的高通量检测。传统微生物检测方法简便，但是实验繁杂、时程长、效率低。HPLC灵敏度高、检测样品需量少，但样品前处理过程复杂、仪器化程度高且价格昂贵。因此目前研究成熟且比较快速的检测蜡样芽孢杆菌的方法多采用显色培养基、PCR技术和免疫层析试剂盒。1.4蜡样芽孢杆菌研究现状蜡样芽孢杆菌群微生物基因组具有高度同源性，但它们毒素由不同的毒力质粒编码。目前对B.cereus研究最多的是，关于呕吐毒素cereulide产生的遗传因子，转录调控因子的鉴定，寻找快速检测呕吐毒素的方法，环境对cereulide表达水平的影响以及包括各种食物对毒素表达的影响等。研究蜡样芽孢杆菌群，多集中在对该群微生物基因组的分型、亚群的分类、毒素基因或质粒间水平转移、各种毒力因子等等，与其他各学科交叉渗透，探索更高效快速的检测方法。迄今，在许多食品中均检出有B.cereus，预防B.cereus食物中毒，也是另一个研究热点。食品在加工、运输、储存和销售等过程中均易受B.cereus污染，该菌可以通过泥土、灰尘、昆虫或不洁用具和从业人员的手传播。只有充分彻底的加热食物，才可确保B.cereus芽孢被破坏。快速冷藏是防止B.cereus孢子萌发的必要条件；低pH(<4.5)、降低aw(<0.92)、低温冷藏(<4℃)也会抑制蜡样芽孢杆菌的生长[59]。控制B.cereus的措施同样可以去控制其他芽孢杆菌群。我国的标准正与国际接轨，完善B.cereus的检测，建立其残留限量标准。目前各国对B.cereus的限量均有不同限量标准。如澳大利亚规定婴幼儿乳粉B.11 武汉轻工大学硕士学位论文cereus数<103CFU/g；新西兰对婴儿食用乳粉要求高，菌数<102CFU/g；新西兰(其他食品)、挪威、爱尔兰、加拿大(婴幼儿食品)等限定食品中B.cereus数<104CFU/g；还有荷兰等国家一般限定食品在105CFU/g可能对人类有危害。因此监控食品中的B.cereus，研究出快速准确鉴定B.cereus的方法。控制B.cereus最主要的方案是控制温度和建立HACCP(HazardAnalysisCriticalControlPoint，危害分析和关键控制点)系统。1.5课题主要研究内容了解各区域环境中蜡样芽孢杆菌的生态情况，研究其对环境的适应性有重要意义，对食品行业的安全生产也具有很重要的实践指导意义。对我国市售大米中食源性致病菌蜡样芽孢杆菌进行致病性分析，在国内尚属首次。国外虽有对大米中蜡样芽孢杆菌的相关研究，但只限于研究蜡样芽孢杆菌生理生态及致病性，所以此次研究更应着眼于适应于我国特有地理条件，结合我国易发食物中毒地区进行更深入分析。本课题主要研究内容有以下几个方面：(1)分离和鉴定各个地区大米样品中的蜡样芽孢杆菌，并与国际接轨进行主要生理生化实验，确立快速检测蜡样芽孢杆菌的方法；分析蜡样芽孢杆菌与地理环境的关系。(2)采用PCR技术检测分离菌株的呕吐毒素ces，细胞毒素K基因cytK1、cytK2，溶血素BL基因hblC；非溶血性肠毒素基因nheB。初步筛选有毒素基因的菌株，并分析各毒素在我国地理的分布。(3)对蜡样芽孢杆菌进行生长特性和表型研究，探究该菌生长范围情况和菌株表型与毒素的携带关系。1.6本课题研究的目的和意义引发呕吐型蜡样芽孢杆菌食物中毒的食品主要是炒、蒸、煮(剩)米饭和其他富含淀粉质的米、面制品，而这些食品正是我国的主食。结合国内外蜡样芽孢杆菌的检测标准，本实验对我国市售大米采用MPN法、选择性培养基和形态观察及显微镜检，对蜡样包杆菌计数、分离、鉴定。并采用ITS(核糖体RNA12 武汉轻工大学硕士学位论文基因转录间隔区)序列分析验证蜡样芽孢杆菌群，进一步探讨和完善蜡样芽孢杆菌检测方法。本研究初步统计并预测蜡样芽孢杆菌在我国不同地理条件下的分布模型；检测菌株的产毒素情况，了解大米生产工艺，查明污染源；为制订检测标准、卫生安全标准及应对突发性蜡样芽孢杆菌食物中毒事件提供参考依据，为评价蜡样芽孢杆菌对我国食品行业的影响提供基础资料。我国还须借鉴国外经验，建立在预测模型基础上的风险评估，才能有效地预测食品中蜡样芽孢杆菌的污染情况，确定其在使用后的安全性。有必要对我国食品中蜡样芽胞杆菌群微生物(耐冷菌)的分布情况、毒素基因分布、毒力检测方法以及产毒特性等问题进行调查。根据蜡样芽孢杆菌的控制方法，以提供其监控指导，有效地控制该菌在食品中的污染，保护公众健康。13 第2章蜡样芽孢杆菌的分离、鉴定和地域分布研究第2章蜡样芽孢杆菌的分离、鉴定和地域分布研究2.1材料2.1.1样品来源2011年8月中旬到2011年11月中旬，基本在秋季期间来采集全国各省市在销市售大米(包括白米、黑米、红米、糙米、紫米)，进行蜡样芽孢杆菌的分离与检测。2.1.2主要培养基(1)营养琼脂(Nutrientagar，NA)：牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂15g稀释至1000mL将各成分置于蒸馏水中加热溶解，校正pH7.2±0.1后分装，121℃高压灭菌20min，倾注平板。(2)胰酪胨大豆多粘菌素肉汤(TrypticSoyPolymyxinBroth，TSB)：胰蛋白胨17g植物蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000mL将上述各成分溶解在蒸馏水中，分装大试管，每管15mL，121℃高压灭15min。临用时每管加入过滤无菌的0.5%多粘菌素B溶液0.1mL，混匀。注：多粘菌素B溶液：在33.3mL无菌水中溶解500000国际单位无菌硫酸盐多粘菌素B。(3)甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基(MannitolYolkPolymyxinAgarplate，MYP)：A.基础琼脂牛肉膏1.0g氯化钠10.0g蛋白胨10.0gD-甘露醇10.0g加900mL蒸馏水，校正pH至7.2±0.1，加入酚红2.5mL(1%溶于95%乙14 武汉轻工大学硕士学位论文醇溶液)，分装烧瓶，每瓶225mL，每瓶加琼脂3.75g，121℃高压灭菌15min。B.50%卵黄液：取鲜鸡蛋，彻底洗净蛋壳，沥干，置于75%酒精溶液浸泡1h。无菌操作取出卵黄，加入等体积灭菌的生理盐水。混匀备用。C.多粘菌素B溶液：在50mL灭菌蒸馏水中溶解500,000国际单位的无菌硫酸盐多粘菌素B(27.8mg的18,000IU/mg的多粘菌素B)。将基础琼脂A液加热融化，冷至45~50℃后每瓶加入12.5mL的B液和2.5mL的C液，混匀倾注灭菌平皿。用前应将平板置室温约24h。(4)PEMBA选择性培养基(Bacilluscereusagar)[60,61]：甘露醇10.0g；丙酮酸钠10.0g；磷酸氢二钠2.5g；氯化钠2.0g；胃蛋白酶消化的动物组织1.0g；磷酸氢二钾0.25g；溴百里香酚兰0.12g；硫酸镁0.1g；琼脂15g。加蒸馏水稀释至1000mL，25℃最终pH为7.2±0.2，搅拌、煮沸、充分溶解后分装灭菌121℃，15min；冷却至45~50℃无菌加入50mL无菌的蛋黄液，2mL过滤除菌的多粘菌素B(终浓度100,000单位/L)和20%(w/v)的单独配制灭菌的丙酮酸钠5mL。(5)T3基础培养基：胰蛋白胨3g蛋白胨2g酵母抽提物1.5gNa3PO40.05MMnCl0.005g稀释至1000mL，pH6.8校正pH7.2±0.1后分装烧瓶，121℃高压灭菌20min倾注平板。(6)胰酪胨大豆羊血琼脂(TrypticaseSoySheepBloodAgar，TSSB)：胰酪胨15.0g植物胨5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g将上述各成分于蒸馏水中加热溶解，加蒸馏水稀释至1000mL。校正pH7.0±0.2后，分装烧瓶，每瓶100mL。121℃高压灭菌15min，水浴中冷至45~50℃加入5mL无菌脱纤维羊血，混匀后倾注平板，每皿18~20mL。2.1.3仪器和设备恒温培养箱TermaksseriesKB8000，上海精宏实验设备有限公司；YM50AI全自动灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；80i正置荧光相差显微镜(YS100)，日本Nikon公司；TGL-16C离心机，上海安亭科技仪器厂。TC-312PCR仪，英15 武汉轻工大学硕士学位论文国TECHNE公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；DYY8B型稳压电泳仪，北京市六一仪器厂；SYNGENE凝胶图像分析系统，英国Syngene公司；2.1.4主要试剂(1)菌株保藏液：用1/10的TSB液体培养基，但是盐离子要正常浓度即：酪蛋白胨1.7g植物胨0.3gNaCl5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖0.25g将所配置的0.6mL1/10的TSB液体培养基+0.3mL86%甘油混合作为菌株保藏液。(2)PCR试剂PCR主要试剂：PCRBuffer、Mg2+、Taq、DNAMarkerDL2000和Goldview荧光染料等分子生物学试剂均为TaTaRa产品。TEbuffer：1moL/LTris-HCl(pH7.5)10mL0.5moL/LEDTA(pH8.0)2mL加超纯水至1000mL，调pH=7.5。TBE电泳缓冲液(10×)：108gTris、7.44gEDTA、55g硼酸，加双蒸水定容至1000mL，工作液为0.5×。琼脂糖凝胶：Agarose1.0g0.5×TBE100mL充分煮沸溶解，室温冷至60℃，倒胶。16 武汉轻工大学硕士学位论文2.1.5方法最初采用稀释平板测数法，发现部分大米样品中蜡样芽孢杆菌数量不高，低于稀释平板计数法检测有效范围(>100CFU/g)。所以结合国内外标准，采用MPN法对样品中蜡样芽孢杆菌进行检测。MPN有效计数范围为3～4100CFU/g，可用于测定一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。(1)样品采集尽量采集全国各省市具有代表性的大米样品，采集足够的样品同时保证各地区样品的均衡性。所采集大米样品均在采集地立刻包装密封，并带入实验室，常温放置。检测时均在无菌条件下进行，保证样品的无交叉污染。(2)样品检测以无菌操作，称取10g样品，放入盛装90ml无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的三角瓶中，手摇5～10min或以18000~20000r/min振荡2min，制成10-1样品稀释液。依次制成10-1～10-3样品稀释液。取10-1、10-2、10-3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，每管接种1mL。置于30℃，培养48±2h。从混浊长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上，倒置于30℃培养24～48h。从MYP琼脂平板上挑取粉红色周围有有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂培养基和T3基础培养基上，再置30℃培养24h供作证实试验。(3)证实试验和蜡样芽孢杆菌鉴定证实试验：将由MYP琼脂平板上挑取的疑似蜡样芽孢杆菌的单菌落，进行显微镜检伴孢晶体（鉴别苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis，基因组同源性分析这两种细菌在DNA水平上无明显的差别），同时选用PEMBA选择性培养基和溶血试验实验、ITS(internaltranscribedspacer，ITS，核糖体RNA基因转录间隔区)序列分析等进一步鉴定确认为蜡样芽孢杆菌群微生物。由上述证实实验确定蜡样芽孢杆菌的管数，再由MPN表计算蜡样芽孢杆菌的MPN值，并作出报告。17 武汉轻工大学硕士学位论文(4)ITS序列分析①PCR引物和条件Table2-1PrimersusedinthestudyPrimersequencesAnnealingProductPrimerGenePrimer(5´-3´)temperaturesizereferenceITS-16S-139GNACACACCG16S/23S750bp2-S-15CCCGTrDNA55°C和[62]ITS-23S-206NCTTAGATGTTITS500bp-A-21TCAGTTCVCY②菌液DNA模板的提取细菌在LB培养基上30℃培养过夜；挑少许菌落到装有200μLTEbuffer的无菌EP管；102℃加热10min；15,000g×5min离心，将上清转入新EP管内，作为DNA模板，4℃保藏。③PCR扩增菌裂解液的制备模板DNA；PCR体系和条件：25μLPCR体系：Taq酶0.25μL；10×PCRBuffer2.5μL；2.5mmoLdNTP2μL；2个10μmoL引物各1μL；菌裂解液模板1.5μL；无菌去离子水17μL。④凝胶电泳和鉴定：取5μLPCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶(EB)染色，自动凝胶成像分析系统观察PCR扩增结果。(5)菌株保藏用1/10的TSB液体培养基，但是盐离子要正常浓度。取0.6mLTSB+0.3mL86%甘油混合。挑选NA培养基上培养3天的形成有孢子的蜡样芽孢杆菌菌落混合，并标记编号，再将各冻存管按顺序装入冻存盒中-80℃保藏。(6)统计分析采用SPSS进行数据统计分析。18 武汉轻工大学硕士学位论文2.2结果和分析2.2.1大米样品采样结果各省市大米样品采集情况，见图2-1。图2-1：中国大米样品采集图Fig.2-1MapofChinashowingdistributionofricesamples2.2.2蜡样芽孢杆菌的分离鉴定结果(1)蜡样芽孢杆菌菌落形态蜡样芽孢杆菌在MYP培养基上的形态：微粉红色菌落，表面微干，微粉色2～5mm沉淀环。极少数菌落无明显沉淀环。在NA培养基上形态：生成的菌落不透明，表面粗糙呈融蜡状，扁平，边缘不整齐，绝大多数为白色，少数会呈现酱粉色。在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，19 武汉轻工大学硕士学位论文生长混浊，有菌膜。ABCD图2-2不同培养基下的蜡样芽孢杆菌的菌落形态A：MYP培养基；B：PEMBA选择性培养基；C：T3培养基；D：TSSB培养基Fig.2-2ColonialmorphologyofB.cereusindifferentisolationculturemediumsA:MYP;B:PEMBA;C:T3;D:hemolysismedium在PEMBA选择性培养基上形态：蜡样芽孢杆菌呈蓝绿色菌落，且有2～5mm蓝绿色沉淀环。在T3培养基上形态：蜡样、边缘不整齐或圆整、表面微干或颗粒样、或同心环样或皱褶扁平(图2-2)。T3培养基是用于培养蜡样芽孢20 武汉轻工大学硕士学位论文杆菌或苏云金芽孢杆菌的基础培养基，在T3培养基上，蜡样芽孢杆菌群微生物生长较慢，菌落较小，更能部分抑制其他芽孢杆菌的生长和孢子萌发[63]。(2)蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的显微形态AB图2-3部分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌分离株的光学显微镜照片Fig.2-3ThelightmicroscopyphotographyofseveralB.cereusandB.thuringiensisisolates图注：A:Bc-65-1;B:Bt-1-3(→所指为Bt晶体)革兰氏染色镜检蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌。蜡样芽孢杆菌显微形态大小如图2-3-A显示，为1～1.3×3～5μm，呈短/长链，形成芽孢，芽孢呈卵圆形，芽孢较菌体小，不突出菌体，位于菌体中央或稍偏一端。而苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌菌体形态相似，且基因组同源性分析这两种细菌在DNA水平上无明显的差别[64]，区别是苏云金芽孢杆菌具有特异的杀虫晶体蛋白(又称δ-内毒素)组成的伴孢晶体(见图2-3-B)。2.2.3ITS序列分析结果ITS(核糖体RNA基因转录间隔区)序列分析，显示分离鉴定的蜡样芽孢杆菌群菌株准确率达100%。21 武汉轻工大学硕士学位论文123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536bp800700600500图2-4部分B.cereus呕吐毒素基因16S/23SrDNAITSPCR结果Fig.2-4PartofPCRanalysisof16S/23SrDNAITSofB.cereusisolatesITS序列分析是利用16SrDNA中的插入片段进行特性性PCR,凡蜡样芽孢杆菌群微生物都会出现2条亮带，基因条带大小分别为500bp和750bp。依次加样顺序为：1.Marker；2.Water；3.炭疽芽孢杆菌DNA提取物；4：58-3；5：58-4；6：59-1；7：59-2；8：59-3；9：60-1；10：60-2；11：62-1；12：62-2；13：62-3；14：62-4；15：62-5；16：62-6；17：63-1；18：63-2；19：63-3；20：63-4；21：63-5；22：63-6；23：64-1；24：65-1；25：65-2；26：65-3；27：65-4；28：66-1；29：66-2；30：66-3；31：67-1；32：67-2；33：67-3；34：68-1；35：68-2；36：Marker2.2.4蜡样芽孢杆菌群在各地区的分布结果共采集138份大米样品，原产地来自国内地区有134份，原产地来自越南的有1份，来自泰国的有3份。分离菌株情况：共分离有285株蜡样芽孢杆菌群微生物。从134份中国大米样品中共检出的蜡样芽胞杆菌群微生物为272株，其中蜡样芽胞杆菌263株，苏云金芽孢杆菌8株，蕈状芽孢杆菌1株。国外(越南和泰国)大米样品4份中检出蜡样芽胞杆菌群微生物为13株，蜡样芽孢杆菌5株，苏云金芽孢杆菌8株。在国内，81.3%(109/134)样品中检出蜡样芽孢杆菌群类微生物。79.9%(107/134)样品检出有蜡样芽孢杆菌，检出率相当高。而苏云金芽孢杆菌检出率较低，5.2%(7/134)，均值含量3.8CFU/g；只有一份样品中检出蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)，含量7.2CFU/g。原料来源于泰国的大米样品中，蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌检出高，但菌量相比较少；而越南只检出有苏云金芽孢杆菌(表2-2)。22 武汉轻工大学硕士学位论文表2-2蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和蕈状芽孢杆菌在各国地区大米中的分布Table2-2OccurrencesofB.cereus,B.ThuringiensisandB.mycoidesinricesamplesofregions中国越南泰国BcBtBmBcBtBcBt检出率79.9%5.2%0.75%—100%100%66.7%均数/CFU/g39.13.87.2—15016.94.7样品数13413注：—-表示未检出。2.2.5大米样品蜡样芽孢杆菌的分布类型分析大米样品来源于全国各地市售或者农家大米，80.0%(107/134)样品检出有蜡样芽孢杆菌。影响蜡样芽孢杆菌检出数量的因素有多种，如不同地域带来的温湿度差异、大米加工工艺等。根据采集的大米样品的来源地，将107份大米首先按省市分类，并进行数据分析。首先对各省市的蜡样芽孢杆菌数据进行描述性统计分析。(1)频数和描述探索性分析表2-3描述统计量表(CFU/g)Table2-3DescriptiveStatistics(lg(CFU/g))均值的标准误标准差偏态Skewness峰度Kurtosis均值nStd.ErrorofStd.标准误标准误MeanCsCeMeanDeviationStd.ErrorStd.Error样品数107230.14138.753400.8691.6650.2340.9570.46323 武汉轻工大学硕士学位论文图2-5各省市样品蜡样芽孢杆菌含量的Z分值直方图Fig.2-5TheZscorehistogramofthecountofB.cereusindifferentdistrictricesamples由表2-3可知，均值为230.141CFU/g，均值标准误和标准差较大，说明数据较离散。分析得，蜡样芽孢杆菌含量的频数：含量在3.0～9.2CFU/g占总量的29.0%；含量为1100CFU/g占16.8%；54.2%的数据集中在11.0～460.0CFU/g。两头数据和中间数据几乎各占一半。集中趋势和离散程度是数据分布的两个重要特征，但要全面了解数据分布的特点，还需要知道数据分布的形状是否对称，偏斜的程度以及分布的扁平程度等。偏态和峰度就是对这些分布特征的进一步描述。偏态是对分布偏斜方向及程度的测度。当分布对称时，Cs=0；当分布不对称时，正值表示正偏离差值较大，可判断为正偏或右偏。反之，绝对值越大，表示偏斜的程度就越大。峰度是分布集中趋势高峰的形态，通常是与正态分布相比较来说的，在归化到同一方差是，若分布的形状比正态分布更瘦更高，则称为尖峰，若比正态分布更矮更胖，则称为平峰分布。由于正态分布的峰度系数Ce=0，当Ce>0时，为尖峰分布，当Ce<0时为扁平分布。从偏态和峰度指标来看：偏态系数Cs为正值1.665，且数值较大；Ce=0.957>0，说明国内蜡样芽孢杆菌数在各省市的分布为明显的右偏或者正偏，并且比较尖峭，即国内大部分省市的大米样品中蜡样芽孢杆菌数目较少。这一结论，24 武汉轻工大学硕士学位论文在变量Z的直方图上，得到了验证。图2-5是蜡样芽孢杆菌含量的Z分值直方图，以及在直方图上的正态曲线。(2)正态性检验表2-4各大米样品中蜡样芽孢杆菌数值的单样本K-S检验(CFU/g)Table2-4One-SampleKolmogorov-SmirnovTestofB.cereusinricesamplesN107NormalParametersa,bMean230.1411Std.Deviation400.869MostExtremeDifferencesAbsolute0.361Positive0.361Negative-0.285Kolmogorov-SmirnovZ3.734Asymp.Sig.(2-tailed)<0.0001a.TestdistributionisNormal.b.Calculatedfromdata.经过单样本K-S检验(表2-4)，得Z=3.734，P<0.0001，所以以菌数值为样本，不服从正态分布。同时，表2-3的偏态和峰度分析也同样说明样本不满足正态分布。(3)分布类型的鉴定上述分析显示，数据与正态分布相差较远，即不满足正态分布，也不可能对影响蜡样芽孢杆菌检出数量的因素进行方差分析等；此时可以采取适当的数据变换。因此必须鉴定数据的分布类型，才能更准确的分析蜡样芽孢杆菌在各省市中的含量分布。因为大部分数据小于1000CFU/g，所以数据变换采用对数变换。经过对数变换后的描述性分析如表2-5。和表2-2相比较，蜡样芽孢杆菌对数值的均值为1.592（即39.084CFU/g，小于230.141CFU/g）；且均值的标准误和标准差都比较小。25 武汉轻工大学硕士学位论文表2-5描述性分析结果(lg(CFU/g))Table2-5DescriptiveStatistics(lg(CFU/g))均值的标准误标准差偏态Skewness峰度Kurtosis均值nStd.ErrorofStd.标准误标准误MeanCsCeMeanDeviationStd.ErrorStd.Error样品数1071.5920.8380070.8668410.4280.234-1.0030.463采用Q-Q(NormalQ-QPlots，正态概率单位分布图)图，将理论分布作为Y轴，观察到样本分布作为X轴，画散点图。如果观察到样本服从预期的理论分布，这些点大致成一条直线；否则说明样本与理论分布有较大差别，如图2-6(A)。AB图2-6鉴定正态分布的QQ图A.观察变量值的Q-Q图；B.观察变量的lg(CFU/g)的QQ图Fig.2-5QQPlotsfortheidentificationofnormaldistributionA.Q-QPlotsofthecountofB.cereus;B.Q-QPlotsofthelgvalueofB.cereus图2-6(A)观察到样本是蜡样芽孢杆菌的含量数值，显然不符合正态分布；(B)X轴是数据转换成log10(CFU/g)或lg(CFU/g)，理论值和常用对数观察值的大多数点成一条直线，说明各地区蜡样芽孢杆菌含量的常用对数值log10(CFU/g)近似符合正态分布。表2-5，偏态系数Cs为正值0.428，数值较小；峰度系数Ce=-1.003<0，说明对数值的分布稍微右偏，且较扁平，明显向正态分布靠拢。为了更好的说明各个数据的有效性，图2-7为菌数对数值的箱形图。箱形图在26 武汉轻工大学硕士学位论文识别异常值方面有一定的优越性，可以直接看出变量值的分布情况。图中灰色区域的方箱为箱图的主体，上中下三条线分别表示变量值的第75、50、25百分位数，因此变量的50%观察值落在这一区域中。方箱中间粗线是中位数，异常值的位置用“＊”或者“Ο”符号表示。显然，箱图中蜡样芽孢杆菌对数值均无异常值。图2-7样品中蜡样芽孢杆菌对数值的箱形图Fig.2-7BoxplotoflgB.cereusinricesamples从图2-6(B)可以直观的看出，对数变换值近似服从正态分布，但是不是服从正态分布，还需正态性检验。表2-6和图2-8即是对对数变换后数值，进行的正态性检验。Z=1.251，P=0.088>0.05，所以以菌数对数值为样本，服从正态分布。表2-6单样本K-S检验(lg(CFU/g))Table2-6One-SampleKolmogorov-SmirnovTest(lg(CFU/g))N107Mean1.592385NormalParametersa,bStd.Deviation0.866841Absolute0.121MostExtremePositive0.117DifferencesNegative-0.12127 武汉轻工大学硕士学位论文Kolmogorov-SmirnovZ1.251Asymp.Sig.(2-tailed)0.088a.TestdistributionisNormal.b.Calculatedfromdata.图2-8单样本K-S检验正态分布的直方图(lg(CFU/g))Fig.2-8HistogramofK-Snonparametrictestfornormaldistribution(lg(CFU/g))2.2.6不同省市大米样品中蜡样芽孢杆菌结果对服从正态分布的对数值log10(CFU/g)进行单因素方差分析。方差分析必须满足主要的三个条件：可加性、正态性、方差齐性[65]。由于各省市中采集的大米样品较少，且检出有蜡样芽孢杆菌的阳性样品占80%，数据偏少。28 武汉轻工大学硕士学位论文图2-9各省市大米样品蜡样芽孢杆菌对数值的误差条形图注：#:一个阳性样品Fig.2-9ErrorbaroflgB.cereusindifferentdistrictricesamples#:onlyonericesample针对25个省市大米中蜡样芽孢杆菌对数值，做了简单的误差条形图(Errorbar)。图中误差线采用均值的2倍的标准差(std.deviation.)，很直观的显示出样本数据的离散程度。不同省市样品数据标准差差异很大，说明蜡样芽孢杆菌在各地分布比较离散；初步分析蜡样芽孢杆菌在各省市中普遍存在。各省市样本可看作均来自正态分布总体，表2-6-1和表2-6-2是样本对数值的单因素方差分析。表2-7-1样本对数值的方差同质性检验/lg(CFU/g)Table2-7-1TestofHomogeneityofVariances/lg(CFU/g)Levene检验统计量df1df2Sig.1.099a21820.366a.在计算方差齐性时只有1个阳性样品的省份省略不计。29 武汉轻工大学硕士学位论文表2-7-2单因素方差分析/lg(CFU/g)Table2-7-2ANOVA/lg(CFU/g)平方和均方差dfFSig.SumofSquaresMeanSquare组间34.771241.4492.6470.001BetweenGroups组内44.879820.547WithinGroups总离差Total79.650106多重比较是采用最小显著差异法(Leastsignificantdifference，LSD)，表2-7-1给出了Levene方差齐性检验结果，Levene统计量对应的P=0.366>0.05，所以得到不同省市地区大米样品中蜡样芽孢杆菌的对数值满足方差齐性。表2-7-2是单因素方差分析结果，F=2.647，由于P=0.001<0.05，说明在α=0.05的显著水平下，F检验是显著的，即各省市地区大米样品中蜡样芽孢杆菌检出数目并不完全相同。2.2.7不同气候区域大米样品蜡样芽孢杆菌情况将国内检出有蜡样芽孢杆菌的阳性样品107份样品结合采集样品图2-1并按气候划区[66]进行分为三类：A.中温带半湿润半干旱区，B.暖温带湿润半湿润区(包括辽宁东)，C.亚热带或热带湿润区(后续简称为A.中温带B.暖温带C.亚热带)。为进一步确认这三组样本是否来自同一总体，采用Kruskal-Wallis检验。Kolmogorov-Smirnov检验是确认这三组样本是否服从正态分布。而游程检验(RunsTest)则是检验分组样本序列是否随机的。由表2-8得知，P值均小于0.05，说明检验通过，三组样本服从正态分布，且序列随机，无聚集分布情况。30 武汉轻工大学硕士学位论文表2-8样本的非参数检验Table2-8Samplesnonparametrictests检验样本N统计量Sig.Kruskal-WallisTestTotal1075.2620.072A130.8910.406Kolmogorov-SmirnovTestB240.7090.696C701.2700.080A136.0000.575RunsTestB2410.0000.310C7028.0000.054接着，对三组样本进行单因素方差分析，即在不同气候区域因素水平上进行比较它们之间的菌数是否有显著差异。表2-9单因素方差分析结果：F=3.671，P=0.029<0.005；说明不同气候区域检出蜡样芽孢杆菌数有显著差异，但未达及显著水平。三组不同气候区域的样本对数值，在图2-9描述的箱图上，一目了然。蜡样芽孢杆菌均值以中温带，暖温带，亚热带，依次增多，分别为6.2CFU/g，19.3CFU/g，56.7CFU/g。表2-9不同气候区域对数值的单因素方差分析/lg(CFU/g)Table2-9ANOVAofB.cereusindifferentclimateareas/lg(CFU/g)SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups5.25222.6263.6710.029WithinGroups74.3891040.715Total76.65010631 武汉轻工大学硕士学位论文图2-10不同气候区域蜡样芽孢杆菌对数值的箱图/lg(CFU/g)Fig.2-10BoxplotsoflgvalueofB.cereusindifferentclimateareas/lg(CFU/g)进一步对三组样本进行多重比较Tamhan’sT2检验，如下表2-10。结果显示，暖温带和亚热带样本的蜡样芽孢杆菌数值间有显著差异；中温带和亚热带之间P=0.073，稍大于0.05，差异不显著；而中温带和暖温带之间无显著差异。表2-10不同气候区域的多重比较Tamhan’sT2检验结果Table2-10MultipleComparisonsofdifferentclimateareasMean95%ConfidenceInterval(I)不同气候区(J)不同气候区Std.ErrorSig.Difference(I-J)LowerBoundUpperBoundAB0.0056660.2912640.985-0.5719200.583253AC-0.4621330.2554350.073-0.9686710.044405BC-0.467799*0.2000650.021-0.864536-0.071062*.Themeandifferenceissignificantatthe0.05level.2.2.8不同工艺分类大米中蜡样芽孢杆菌结果由于采集的大米源自各地，有粳稻、籼稻和糯稻，以及各种地方特色稻米。南方多是籼稻，北方以粳稻居多；具有地理分布特点；由于作物遗传育种的迅速发展，粳型稻和籼型稻的区分比较困难了。因此以大米加工工艺的不同，对大米进行分类分析。分为三类，精白米、糙米(包括黑米、红米、紫米)和未脱32 武汉轻工大学硕士学位论文谷壳米，其蜡样芽孢杆菌的分布情况如表2-11。表2-11不同加工工艺分类大米中蜡样芽孢杆菌的分布情况Table2-11OccurrencesofB.cereusofricesampleswithdifferentprocess大米样品数阳性检出率均值lg(CFU/g)均值(CFU/g)精白米9881.6%1.71952.4糙米3070.0%1.11112.9未脱谷壳米6100%1.58639.2总数13480.0%1.59239.1通过非参数检验的单因素方差分析得P=0.015<0.05，说明三类大米之间蜡样芽孢杆菌数并不完全相同。其中，精白米和糙米的蜡样芽孢杆菌数差异十分显著(P=0.002)，未脱谷壳米与精白米(P<0.05)和糙米(P<0.05)间均无显著差异。2.3讨论2.3.1蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定分析在MYP选择性培养基上，典型的蜡样芽孢杆菌落是为粉红色，周围产生卵磷脂酶沉淀环，不发酵甘露醇。如果培养基上含有大量的发酵甘露醇的背景菌群，则可能疑似的菌落和背景颜色会降低或者不明显。此外，一些疑似蜡样芽孢杆菌株仅产生微弱的沉淀环或者不产沉淀环。所以，凡是疑似菌落均应进行证实试验。相比苏云金芽孢杆菌，蕈状芽孢杆菌的形态容易辨认，产生假根菌落。由于蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌形态基因组差别不大，可通过显微镜检伴孢晶体和cry基因PCR等方法区分。目前我国食品中蜡样芽孢杆菌的检测主要采用国家标准法GB/T4789.14-2003，以及我国进出食品中蜡样芽孢杆菌的检测方法主要还是采用进出口商品检验行业标准(SN0176-1992)。标准中证实试验有生长和菌落形态观察、染色镜检和生化试验。还根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化性状的试验，分为不同型别。由于国标中各种生化实验比较繁琐，且与国际普遍通用的蜡样芽孢杆菌检33 武汉轻工大学硕士学位论文测方法在试验操作和生理生化反应类型上明显不同，致使我国的检测结果与国际上的检测结果没有可比性。本实验结合国外检测蜡样芽孢杆菌的国家标准，对含量较少的蜡样芽孢杆菌食品同样采用MPN法来计数。所不同的是，利用蜡样芽孢杆菌的选择性培养基(如MYP培养基和PEMBA培养基)代替繁冗的生化试验，结合镜检和ITSPCR结果鉴定蜡样芽孢杆菌群微生物，节省了时间，提高准确度。2.3.2蜡样芽孢杆菌的含菌量分析大米样品中79.7%(110/138)检出蜡样芽孢杆菌(3.0CFU/g～>1100CFU/g)。ZhouG.等[67]在21份春季和33份秋季的全脂巴氏杀菌乳样品中，该菌检出率分别是71.4%(3.0~38CFU/mL)和33.3%(3.0~43CFU/mL)；在40份冰淇凌[68]中占60.0%。JacksonEE.等[69]在214份混合筒仓生鲜牛奶中该菌检出率8.91%(3.0~93CFU/mL)。说明，大米中蜡样芽孢杆菌比其他食品的检出率高。(1)对中国、泰国和越南的样品分析蜡样芽孢杆菌检出情况：中国79.9%样品检出该菌为39.1CFU/g(3.0CFU/g～>1100CFU/g)；泰国3份样品均检出为16.9CFU/g；越南未检出；总体来看，蜡样芽孢杆菌检出率很高。AnkolekarC.等[70]报道研究的178份美国大米在加热75℃15min条件下，有52.8%样品检出蜡样芽孢杆菌群微生物，平均含量是32.6CFU/g，其中46.6%样品检出该菌为3.6～460CFU/g。可见，中国和泰国的高检出率，是因为检测时并未加热；而美国样品在外界加热情况下，蜡样芽孢杆菌营养菌体会被破坏，芽孢会存活下来，其检出率和检出含量会相对较低。苏云金芽孢杆菌检出情况：中国5.2%样品检出该菌均值为3.8CFU/g；泰国2份(2/3)检出该菌均值为4.7CFU/g(3.6～6.2CFU/g)；越南的1份样品中该菌占有优势，为150CFU/g；数据初步表明国外苏云金芽孢杆菌比国内检出率和检出数目相当高。这与AnkolekarC.等[70]报道的美国大米6.1%样品检出苏云金芽孢杆菌为3.6～23CFU/g，即使其在加热条件下，其检出率和检出数量与中国的稍微高点。而泰国和越南具有高检出率和/或高含菌量，可能与其所处热带地域性有关。34 武汉轻工大学硕士学位论文蕈状芽孢杆菌：仅中国1份(0.75%)大米中检出该菌，并非优势菌，蜡样芽孢杆菌是该样品优势菌，数量7.2CFU/g。和美国报道也仅检出1份(0.56%)该菌，数量240CFU/g，且是样品优势菌。总体来看，各国地区均可检出蜡样芽孢杆菌群，蜡样芽孢杆菌占优势，其检出率和检出数量在加热条件下有所降低，也具有温度区域性差异。具体分析如下：①.从中国和美国两国地区来看，气候、植被、纬度等都比较类似，所以蜡样芽孢杆菌群比例十分相似；而泰国和越南所处偏赤道的热带区域，该群各菌种比例随温度会发生变化。因泰国、越南的大米采样不足，不排除发生偶然性。②.蜡样芽孢杆菌生长对营养要求不高，空气、土壤、尘埃、水等广泛存在，尤其大米在加工、运输、贮藏、销售等各个环节均易受到蜡样芽胞杆菌污染。原料来自越南和泰国的大米未检出蜡样芽孢杆菌或含量很少，都检出苏云金芽孢杆菌，且检出率非常高，很可能与商业苏云金芽孢杆菌杀虫剂有关。曾在2005~2006年，对丹麦即食食物和零售店的果蔬进行苏云金芽孢杆菌检测。即食食物中某些苏云金芽孢杆菌菌株的表型及基因型特征与某商业化苏云金芽孢杆菌菌株相同，很可能是来自杀虫剂的污染；RAPD分析显示果蔬中苏云金芽孢杆菌有23株就是商业化的苏云金芽孢杆菌菌株（分别来自土豆、黄瓜和辣椒），其肠毒素基因的携带率甚至高于同时分离的其它菌株[71]。由于苏云金芽孢杆菌杀虫剂属于绿色环保的，对作物无害的微生物制剂；近年来的大肆使用，在大米中检出苏云金芽孢杆菌，不排除会有苏云金芽孢杆菌杀虫剂残留的可能。(2)各省市和地域性分析各样品检出蜡样芽孢杆菌均值为39.1CFU/g(3.0CFU/g～>1100CFU/g)。蜡样芽孢胞杆菌在海南、广东、新疆、湖南等地检出菌数较高，这与地方所处自然环境优越、温度适宜蜡样芽孢胞杆菌繁殖有一定联系的。根据样品采集图和中国气候区划新方案[66]综合分析，秦岭-淮河以南地区的大米样品蜡样芽孢杆菌较高，尤以处于热带雨林区的海南省检出的蜡样芽孢杆菌最多(>1100CFU/g)；其次是广东、湖南、广西、湖北等省(271.8～8.9CFU/g)，具有典型的热带或亚热带季风气候。35 武汉轻工大学硕士学位论文其中云南和贵州地处云贵高原，地势起伏曲折，河谷、山间盆地和高山之间不但温度差异明显，降水条件也不同，河谷地区气候往往干暖，而高山地区则湿凉，从而形成了较多气候区[66]。此处海拔较高，地势处于我国第二阶梯(大米采集地点集中在云南昆明市和西双版纳傣族自治州以及贵州的遵义市和惠水县)，蜡样芽孢杆菌检出较少或未检出，原因一是采集样品有限，二是可能与当地气候、海拔、温度等有关，在8、9月份相比秦岭-淮河以南海拔低地区的温度较低。而秦岭-淮河以北处于暖温带的地区，大米蜡样芽孢杆菌普遍偏低，如：陕西、山东、辽宁、河北、河南、江苏、北京(34.3～3.6CFU/g)；处于中温带针叶阔叶林区的黑龙江和吉林省市的蜡样芽孢杆菌的数量检出很少(6.4CFU/g和3.4CFU/g)。秦岭-淮河线是我国是很重要的水分气候带，是北方地区和南方地区的分界线，是暖温带和亚热带的分界线，也是植物、地理和生态从湿润地区转到半湿润地区的重要过渡带[72]。通过分析不同气候区域的大米蜡样芽孢杆菌含量有显著差异，中温带、暖温带、亚热带，依次向南，菌数渐增。可见，蜡样芽孢杆菌对有利生长繁殖的气候区域有一定的选择性。微生物种群数量和生物量主要受其生存的环境条件如气候、植被、土壤理化性质、经纬度和海拔等影响[73]。张华勇等[74]研究红壤地区不同生态系统下芽孢杆菌的物种多样性有所差异，在多样性指数中，Shannon-Wiener指数H’和Simpson指数D显示规律一致，物种多样性程度、丰富度指数和均匀度指数依次为：林地>早地>水田>侵蚀地。不同生境类型中的有机碳和各种活性有机质组分不同，这就决定了不同生境类型中的微生物群落数和种类的不同。此外，本次研究检出来自新疆样品的蜡样芽孢杆菌的检出均数比较高，为263.6CFU/g。新疆位于我国西北部，地处欧亚大陆中心，年均气温11.4℃～11.7℃，昼夜温差大，干旱少雨，光照充足。我国研究学者[75]采用格网抽样和重点抽样相结合的混合随机抽样技术，根据不同地点发不同生境类型进行了样点的设计和采集。实验对新疆4个地点阿克苏地点、喀什地点、阿拉尔市和塔克拉玛干沙漠的14份土壤样本进行了芽孢杆菌微生物的平板分离纯化。采用16SrDNA测序和脂肪酸鉴定，发现蜡样芽孢杆菌是新疆这四个地点共有的优36 武汉轻工大学硕士学位论文势芽孢杆菌，但在不同地方的含量相差很大。可见新疆中芽孢杆菌占有一定优势，尤其是蜡样芽孢杆菌居首，也许与其耐旱芽孢有关，相比其他细菌更易适应干燥少雨温度低的区域。虽然大米在加工、运输、销售等各个环节都会受到污染，结果会有一定影响。AnwarulHaque等[76]的实验也证明了蜡样芽孢杆菌与区域性有一定关系。他们对从孟加拉国的两种高产大米中分离的蜡样芽孢杆菌株进行孢子萌发试验和5～50℃热生长试验，发现芽孢在20℃比在37℃、30℃和10℃萌发较好且孟加拉国的大米分离株在45℃生长最快，可能和稻米来源于热带区域有关。本章实验主要初步分析和探讨大米中蜡样芽孢杆菌检出情况和地理分布的关系。综上分析：影响气候区域和省市不同的主要因素是温度，温度是影响蜡样芽孢杆菌生长的一个重要因素。蜡样芽孢杆菌在不同温度下的生长情况，详见第四章。总之，我国各地样品检出蜡样芽孢杆菌为3.0CFU/g～>1100CFU/g，我国尚未有对蜡样芽孢杆菌限量要求标准，一般认为食品中蜡样芽孢杆菌数量超过105CFU/g或106CFU/g可能会对人类健康产生不利的影响。单从大米含菌量来看，蜡样芽孢杆菌含菌量并不算太高，但是大米经过蒸煮后，含水量、pH值、营养和温度都适合微生物繁殖，而且经过蒸煮，只有蜡样芽孢杆菌等有芽孢的耐热细菌存留下来，在没有其它细菌竞争的情况下，快速繁殖产毒，导致食品中毒的事件屡见报道。我国蜡样芽孢杆菌食物中毒事件中70%以上的案例都是由剩米饭引起的，可见一斑。其中起到关键影响的是蜡样芽孢杆菌在大米中的初始含量和米饭加工后保藏条件和时间。2011年，我国针对金黄色葡萄球菌的限量检测，重新出台了新版速冻米面制品食品安全国家标准(GB19295-2011)，并得到有效的安全评价[77]。而针对各类食品中蜡样芽孢杆菌的限量检测标准还未及时修缮。考虑到该菌生存广泛，在许多食品中都有检出，我国应该尽快制定关于该菌的食品安全法规和制度，进行有效的监督和检测。2.3.3不同工艺大米中蜡样芽孢杆菌分析81.6%(80/98)精白米中检出蜡样芽孢杆菌，阳性检出均值最高，是52.4CFU/g。未脱壳的稻米，检出率达100%，39.2CFU/g。而糙米样品中，检出率37 武汉轻工大学硕士学位论文70.0%(21/30)，阳性检出均值最低，为12.9CFU/g。精白米比糙米的含菌量还高，这与报道的美国大米中，糙米比精白米含菌量高的实验结果相反。微生物生长时，由稻谷外部向内部逐渐侵入，外部细菌总数明显高于内部。此外蜡样芽孢杆菌群细菌一般是土壤中优势细菌，在空气中也是常见细菌，稻谷壳会被蜡样芽孢杆菌污染(细菌总数≥106CFU/g)，其蜡样芽孢杆菌检出率达100%，是正常现象。在净糙脱壳过程中，带有细菌的稻米外壳会被分离到糠中。稻米外壳被脱去，便是糙米，所以含菌量低于带谷壳米。但是令人费解的是精白米比未脱谷壳米和糙米的含菌量都高。胡坚[78]等人研究显示：①.稻谷经净谷、净糙、碾米和抛光后，进入配米仓，含菌量极少(<10CFU/g)；之后进行色选、分级筛成为成品，再打包，菌含量会大量增加(细菌总数为103～104CFU/g)。说明我国精白米在加工、包装、运输、销售过程中进一步受到机械设备、包装袋和加工环境等中的蜡样芽孢杆菌群细菌的污染。如果精白米加工线的卫生监管情况好，加工后的优质大米含菌量比糙米的低，才符合AnkolekarC.等[70]研究的结果。所以我国相关各部门更应该加强对大米的监测和管制。2.4小结(1)实验通过对我国市售大米采用MPN法、选择性培养基和形态观察及显微镜检，对蜡样包杆菌计数、分离、鉴定。并采用ITS（核糖体RNA基因转录间隔区）序列分析验证蜡样芽孢杆菌群。结论是传统方法分离鉴定的蜡样芽孢杆菌100%为阳性。(2)各样品检出蜡样芽孢杆菌为3.0CFU/g～>1100CFU/g。经统计分析，菌数的对数值呈正态分布。秦岭-淮河以南地区的大米样品蜡样芽孢杆菌较高。来自新疆样品的蜡样芽孢杆菌均数也较高，与新疆的蜡样芽孢杆菌是优势芽孢杆菌有关。不同气候区域蜡样芽孢杆菌检出情况不同，蜡样芽孢杆菌均值以中温带，暖温带，亚热带，依次增多。分析蜡样芽孢杆菌对有利生长繁殖的气候区域有一定的选择性。(3)精白米、糙米和未脱谷壳米，这三类不同加工工艺的大米之间的蜡样芽孢杆菌数并不完全相同。均值比较，精白米>未脱谷壳米>糙米。其中，精38 武汉轻工大学硕士学位论文白米和糙米的蜡样芽孢杆菌数差异十分显著。所以建议完善大米加工工艺，减少空气等的污染。精白米在加工、包装、运输、销售过程中都应严格科学储藏。我国应该制定和完善检测标准，杜绝污染源，预防突发性蜡样芽孢杆菌食物中毒事件。39 第3章呕吐毒素和肠毒素基因的PCR检测第3章呕吐毒素基因和肠毒素基因的PCR检测3.1材料和方法3.1.1菌株(1)标准株表3-1：实验所用标准株Table3-1：Bacterialstrainsusedinthestudy菌株编号性质来源蜡样芽孢杆菌呕吐型毒素丹麦畜牧与食品管理Bacillus.cereusF4810/72阳性对照株局ITS和生理生化试验的B.cereusATCC14579丹麦奥胡斯大学阳性对照株cytK1和48℃、50℃高B.cereusNVH391-98丹麦奥胡斯大学温生长的阳性对照株hblC、nheB和cytk2B.thuringiensiskurstakiHD-1丹麦奥胡斯大学阳性对照株(2)实验菌株从所有大米样品分离出的蜡样芽孢杆菌群微生物285株，包括268株蜡样芽孢杆菌，16株苏云金芽孢杆菌，1株蕈状芽孢杆菌。3.1.2仪器和设备同2.1.4章节。3.1.3主要试剂同2.1.5章节的试剂。3.1.4方法(1)PCR反应的引物与条件：40 武汉轻工大学硕士学位论文引物序列：表3-2：各种毒素基因引物序列Table3-2:primersequencesofvarioustoxingenes基因产物长度引物引物序列（5’-3’）参考文献TargetAmpliconPrimerSequencefrom5′to3′endReferencegeneslength(bp)Em1RGACAAGAGAAATTTCTACGAGCAAGTACAATces636[79]Em1FGCAGCCTTCCAATTACTCCTTCTGCCACAGTCK1FCAATTCCAGGGGCAAGTGTCcytK1426[39]CK1RCCTCGTGCATCTGTTTCATGAGCK2FCAATCCCTGGCGCTAGTGCAcytK2585[39]CK2RGTG(AGCT)AGCCTGGACGAAGTTGGnheB-SCTATCAGCACTTATGGCAGnheB770[80]nheB-AACTCCTAGCGGTGTTCCL2AAATGGTCATCGGAACTCTAThblC750[80]L2BCTCGCTGTTCTGCTGTTAATPCR条件：表3-3：呕吐毒素和肠毒素PCR条件Table3-3:PCRconditionsofenterotoxingenesandcereulidegenescescytK1cytK2nheBhblCDNA预变性95℃5min94℃5min94℃5min94℃2min94℃2min95℃45s95℃15s95℃15s94℃45s94℃45s30cycles60℃60s57℃30s57℃30s50℃45s50℃45s72℃90s72℃30s72℃30s72℃90s72℃90s最后延伸72℃5min72℃7min72℃7min72℃5min72℃5min保温12℃12℃12℃12℃12℃41 武汉轻工大学硕士学位论文(2)菌液DNA模板的提取同章节2.1.6(4)。(3)PCR扩增同章节2.1.6(4)。3.2结果3.2.1各菌株毒素的PCR检测结果从138份大米样品中共检出的蜡样芽胞杆菌268株，并对其呕吐毒素基因ces和肠毒素基因cytK1、cytK2、hblC、nheB进行了检测。(1)呕吐毒素PCR检测结果123456789101112131415161718192021222324252627282930313233bp800700600500图3-1部分B.cereus呕吐毒素基因PCR结果Fig.3-1PartofPCRanalysisofvomitoxicgenecesofB.cereusisolates加样顺序：1：Marker；2：B.cereusATCC14579；3：Bacillus.cereusF4810/72；4：5-1；5：5-2；6：5-3；7：6-1；8：6-2；9：12-1；10：12-2；11：13-3；12：13-4；13：13-5；14：15-1；15：15-2；16：17-4；17：18-1；18：18-2；19：22-1；20：22-2；21：23-1；22：23-2；23：24-2；24：24-2；25：25-1；26：25-2；27：25-3；28：26-1；29：26-2；30：27-1；31：27-2；32：27-3；33：Marker.(2)肠毒素PCR检测结果42 武汉轻工大学硕士学位论文123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536bp600500400123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536500bp图3-2部分B.cereuscytk1和cytk2基因PCR结果Fig.3-2PartofPCRanalysisofcytk1andcytk2ofB.cereusisolates加样顺序：上排1：56-4；2：56-5；3：56-6；4：57-1；5：58-1；6：58-2；7：58-3；8：58-4；9：59-1；10：59-2；11：59-3；12：60-1；13：60-2；14：62-1；15：62-2；16：62-3；17：62-4；18：Marker；19：62-5；20：62-6；21：63-1；22：63-2；23：63-3；24：63-4；25：water；26：B.cereusNVH391-98；27：B.thuringiensiskurstakiHD-1；28：63-5；29：63-6；30：64-1；31：65-1；32：65-2；33：65-3；34：65-4；35：66-1；36：66-2；下排，1：66-3；2：67-1；3：67-2；4：67-3；5：68-1；6：68-2；7：68-3；8：69-1；9：69-2；10：69-3；11：70-1；12：70-2；13：71-1；14：71-2；15：73-2；16：73-1；17：73-3；18：：Marker；19：：76-1；20：77-1；21：77-2；22：78-1；23：79-1；24：80-1；25：80-2；26：35：80-3；27：7-1；28：8-1；29：8-2；30：8-3；31：10-1；32：10-2；33：10-3；34：11-1；35：11-2；36：16-1.43 武汉轻工大学硕士学位论文123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536bp800700600500123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536bp800700600500图3-3部分B.cereusnheB基因PCR结果Fig.3-3PartofPCRanalysisofnheBofB.cereusisolates加样顺序：上排：1：water；2B.thuringiensiskurstakiHD-1；3-6：无；7：65-4；8：66-1；9：66-2；10：66-3；11：67-1；12：67-2；13：67-3；14：68-1；15：68-2；16：68-3；17：69-1；18：69-2；19：Marker；20：69-3；21：70-1；22：70-2；23：71-1；24：71-2；25：73-1；26：73-2；27：73-3；28：76-1；29：77-1；30：77-2；31：78-1；32：79-1；33：80-1；34：80-2；35：80-3；36：7-1；下排：1：8-1；2：8-2；3：8-3；4：10-1；5：10-2；6：10-3；7：11-1；8：11-2；9：16-1；10：16-2；11：16-3；12：16-4；13：16-5；14：19-1；15：19-2；16：19-3；17：19-4；18：Marker；19：water；20：B.thuringiensiskurstakiHD-1；21：21-1；22：29-1；23：31-1；24：32-1；25：33-1；26：35-1；27：37-1；28：41-1；29：41-2；30：42-1；31：42-2；32：43-1；33：44-1；34：44-2；35：44-3；36：47-1.44 武汉轻工大学硕士学位论文123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536800bp700bp123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536700bp图3-4部分B.cereushblC基因PCR结果Fig.3-4PartofPCRanalysisofenterotoxicgenehblCofB.cereusisolates加样顺序：上排：1：82-4；2：82-3；3：82-2；4：82-1；5：81-3；6：81-2；7：81-1；8：79-1；9：78-1；10：75-3；11：75-2；12：75-1；13：74-3；14：74-2；15：74-1；16：72-3；17：72-2；18：72-1；19：Marker；20：55-2；21：55-1；22：54-4；23：54-2；24：54-1；25：53-4；26：53-3；27：53-2；28：53-1；29：52-1；30：48-2；31：48-1；32：47-3；33：47-2；34：47-1；35：44-3；36：44-2；下排：1：44-1；2：43-1；3：42-2；4：42-1；5：41-2；6：41-1；7：37-1；8：35-1；9：33-1；10：32-1；11：31-1；12：29-1；13：21-1；14：19-4；15：water；16：B.thuringiensiskurstakiHD-1；17：19-3；18：19-2；19：Marker；20：19-1；21：16-5；22：16-4；23：16-3；24：16-2；25：16-1；26：11-2；27：11-1；28：10-3；29：10-2；30：10-1；31：8-3；32：8-2；33：8-1；34：7-1；35：80-3；36：80-2.3.2.2各地区蜡样芽孢杆菌毒素分布情况大米采集样品涉及国内25个省市及泰国越南，共27个国内外地区，检出45 武汉轻工大学硕士学位论文的条件致病菌蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素和肠毒素的阳性检出情况见表3-4。表3-427个国内外地区B.cereus携带毒素检出情况Table3-4OccurrencesofB.cereuscarriedtoxinsin27areasathomeandabroadcescytK1cytK2nheBhblC毒素基因检出率/%13.8—55.275.043.3B.cereus检出产地个数150232623各地区B.cereus阳性检6.7～75.0－16.7～10020.0～10012.5～100出率范围/%注：—-表示未检出。对三个不同气候区域(详见2.2.5)的不同毒素(ces、cytK1、cytK2、nheB和hblC)在各地区大米样品中检出百分率的分布进行χ2检验，列联表如表3-5。检验P<0.0001，即在不同的气候区域，蜡样芽孢杆菌毒素的分布差异极为显著。表3-5气候区域*毒素基因列联表Table3-5Crosstabulationofclimateareas*toxingene毒素基因累计含量气候区域NcescytK2nheBhblCA10218636B2364940127C2511013470339N371482011165029.3%(25/268)的菌株不含任何毒素基因，大部分的菌株90.7%(243/268)至少携带一种肠毒素或呕吐毒素基因。可见蜡样芽孢杆菌携带呕吐毒素基因和肠毒素基因在各地区的普遍性。(1)肠毒素分布情况46 武汉轻工大学硕士学位论文蜡样芽胞杆菌268株均未检出cytK1(其中PCR检出有4个菌株cytK1是假阳性)；而cytK2、nheB和hblC在大部分地区都有检出，各地区蜡样芽孢杆菌检出率不等(表3-6)。只含cytK2、nheB、hblC其中一个毒素基因的蜡样芽孢杆菌为38.1%(102/268)，携带任何2种的为21.3%(57/268)，三种都携带的占31.0%(83/268)。90.3%(242/268)至少携带一种肠毒素基因。表3-6B.cereus分离株中携带肠毒素基因的检出情况Table3-6OccurrencesofenterotoxinofB.cereusisolates单一基因两个基因三个基因无cytK2+cytK2+cytK+nheB+cytK1cytK2hblCnheBnheB+nonenheBhblChblCHblCN－28659334208326百分率－10.4%24.3%3.4%12.3%1.5%7.5%31.0%总百分率90.3%9.7%经过数据分析，cytK2、nheB和hblC的检出率服从正态分布。采用单因素方差分析，结果显示图3-5，cytK2的气候区域分布差异十分显著(P=0.001)，而nheB和hblC的区域分布无显著差异。经过多重比较，发现cytK2的差异出现在中温带和暖温带之间、中温带和亚热带之间；而nheB的组间区域分布无统计学意义，但比较后发现在暖温带和亚热带之间会有差异(P=0.044<0.05)，也许增加样本量这种差异会有统计学意义。47 武汉轻工大学硕士学位论文图3-5不同气候区域的蜡样芽孢杆菌肠毒素基因cytK2、hblC和nheB的检出率的比较A.中温带；B.暖温带；C.亚热带Fig.3-5ComparisonofthedetectionratesofenterotoxingenecytK2,hblCandnheBofB.cereusindifferentclimateareas.A.semi-aridtemperateclimatezone;B.warm-temperateclimatezone;C.sub-tropicalclimatezone.(2)呕吐毒素分布情况呕吐毒素基因ces的检出率不服从正态分布。我们利用箱形图对三个区域带的呕吐毒素基因分布进行描述，如图3-6。异常值的位置用“＊”分布，显然暖温带有一异常值。在暖温带上的省市有山东、河南、河北、北京、内蒙古、辽宁和陕西，因为采集的样品之地正处此温带区域；只有在内蒙古和陕西省地区采集的大米样品检出了蜡样芽孢杆菌ces基因，其他均为阴性，最显著的异常点是内蒙古大米样品蜡样芽孢杆菌ces基因检出率为25%。48 武汉轻工大学硕士学位论文图3-6不同气候区域带的蜡样芽孢杆菌呕吐毒素基因ces检出率分布的箱形图A.中温带；B.暖温带；C.亚热带Fig.3-6BoxplotofcesgeneofB.cereusindifferentclimateareasA.semi-aridtemperateclimatezone;B.warm-temperateclimatezone;C.sub-tropicalclimatezone.我们排除处于暖温带的蜡样芽孢杆菌检出率的数据，对其他两个温度带进行T检验，发现中温带和亚热带的ces基因检出率差异十分显著。表3-7产ces基因B.cereus在不同气候区的分布及其肠毒素基因检出情况Table3-7Distributioninclimateareasandoccurrencesofenterotoxicgeneofcereulide-producingB.cereus呕吐毒素基因肠毒素基因气候区cescytK1cytK2nheBhblCA.中温带10——9—B.暖温带2—12—C.亚热带25—124—总计37—235—49 武汉轻工大学硕士学位论文表3-7是37株产ces基因蜡样芽孢杆菌在不同气候区中的分布及其肠毒素基因检出情况。含有ces基因的蜡样芽孢杆菌株，较多分布在亚热带，其次是中温带和暖温带区域。肠毒素cytK1和hblC为阴性，但是35株(94.6%)含有nheB基因。37株菌株中，有1株同时含有ces和cytK2基因；但也有1株同时携带ces、cytK2和nheB基因。3.2.3其他蜡样芽孢杆菌群菌株毒素的PCR检测结果国内外共检出有16株苏云金芽孢杆菌，ces和cytK1均未检出；肠毒素基因cytK2、nheB和hblC，各均有93.8%菌株(15/16)为阳性。其中，1株只携带cytK2，另一株只携带nheB和hblC。蕈状芽孢杆菌均未检出任何毒素基因。3.3讨论综上分析，蜡样芽孢杆菌各毒素基因的分布，很大程度上会受气候区域的影响。气候区划是在已有气候区划基本理论依据与区划原则基础上，结合温度带、干湿区、气候区划分指标进行划分的。由于气候不仅受温湿带和干湿区的影响，还受非地带性因素的影响，即使同一温度带与干湿区内，气候和相应的自然景观也会存在明显的差异。所以，在我国的气候区划，采用7月平均气温作为气候区划指标。因为7月平均气温的地理分布较能综合地表现出非地带性因素对气候的影响，且在中纬度地区，夏季气温是决定喜温作物能否种植的关键因素[66]。也就是说，蜡样芽孢杆菌各毒素基因在不同气候区域分布的显著差异性，温度是最重要的影响因子。蜡样芽孢杆菌具有多种毒力相关因子，已有食物中毒案例和分析明确其毒力和毒理的是呕吐毒素cereulide，CytK(其中CytK1极为罕见，但很可能是一个毒力很高的肠毒素，曾导致法国几位老人的死亡，CytK2则是其同源基因，也有毒力)，非溶血性肠毒素Nhe和溶血性肠毒素Hbl。其中由ces参与合成的呕吐毒素cereulide是蜡样芽孢杆菌毒素中危害最大的，因为它非常稳定，已知食物加工方法均不能让其失活，人体摄入后会引发呕吐，严重时能导致死亡，国内外均有死亡案例。而且严重的呕吐型蜡样芽孢杆菌食物中毒多数与米面等50 武汉轻工大学硕士学位论文谷物食品有关，在我国主要是剩米饭。其源头就是大米中污染的呕吐型蜡样芽孢杆菌。米饭经过蒸煮炒制等加工后，活菌数会大大降低，所以由米饭引发的腹泻型蜡样芽孢杆菌食物中毒少见，而且一般比较温和。但是呕吐毒素不会受到影响，如果米饭存放不当，导致毒素大量合成，食用前的再加工不能灭活毒素，常导致爆发性、严重的食物中毒。而米饭恰恰是我国一日三餐的主食，由呕吐型蜡样芽孢杆菌导致的食物中毒在我国不可小视。3.3.1蜡样芽孢杆菌肠毒素的分布分析大米中90.0%(241/268)的蜡样芽孢杆菌至少携带一种肠毒素基因。肠毒素基因nheB、cytK2和hblC分别为75.0%、55.2%和43.3%；31.0%均含有这三个肠毒素基因。细胞毒素cytK2基因的检出率也相当高。BatchounR.等[81]对处于亚热带区的约旦本国的市售47份食品样品检出23.3%为蜡样芽孢杆菌阳性，nheB、cytK、hblC分别为92.3%、53.8%、36.5%；此与RPLA(反相被动乳胶凝集)试剂盒检测Hbl的L2蛋白即hblC的基因产物结果一致。KimJ.B.等[82]检测分析了来自韩国临床和食品样本中的120株蜡样芽孢杆菌的毒素基因检出情况，nheABC、cytK、hblCDA检出率分别为94.2%、52.5%、90.0%；且分别有89.2%、83.3%菌株产毒素蛋白Nhe和Hbl。nheB普遍高于hblC，这与国内外文献报道的关于各种食品如全脂巴氏杀菌乳[83]、海鲜[25]等以及急性腹泻患者[51]分离的蜡样芽孢杆菌的毒素基因检出情况是一致的。而在人们的主食大米中，美国也发现本国大米蜡样芽孢杆菌分离株中，采用PCR技术结合TecraVIA试剂盒检测NheA和RPLA试剂盒检测HblC，高达94.6%的菌株至少含有一种肠毒素基因(nheA、nheB和hblA、hblC、nheD)。MoravekM.等[50]人利用特异性抗体去检测和比较食物中毒菌株和食物或环境中蜡样芽孢杆菌的肠毒素NheB，发现食物中毒蜡样芽孢杆菌株的毒素含量显著高于来自食物或环境中菌株的。研究数据表明，评价蜡样芽孢杆菌的潜在毒性时，对其毒素进行定量分析是十分有必要的。尤其是，nheB基因在蜡样芽孢杆菌株中毒普遍存在，具有更高的潜在致腹泻能力。51 武汉轻工大学硕士学位论文3.3.2蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的分布分析267株蜡样芽孢杆菌中有37株(13.8%)检测出呕吐毒素基因，且分布在15个地区(6.7%～75.0%)，来自泰国大米的5株蜡样芽孢杆菌未检出ces基因。其中在宁夏、新疆、上海、黑龙江、湖南、内蒙古等地区检出率较高(75.0%～25.0%)，可见产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌菌株分部较广，且各地区产毒素菌株检出率各异。产呕吐毒素ces基因蜡样芽孢杆菌中，94.6%携带nheB基因；均不携带cytK1和hblC。13.8%的ces基因高检出率，相比国外学者对蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素检出率高很多。约旦食品中分离的蜡样芽孢杆菌产呕吐毒素菌株占8.5%，均携带Nhe蛋白组分。近年的报道中的零售大米[70]和婴儿食品[84]中的蜡样芽孢杆菌分离株，也未检出呕吐毒素基因。我国主食大米中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素基因检出率如此之高，我国应加强对食品安全的大力监督工作，势在必行。在中温带分离的蜡样芽孢杆菌呕吐毒素ces基因的检出率均值明显高于在亚热带和暖温带的检出率均值，且暖温带的ces检出率是最低的。ces基因在各气候区域都有分布(表3-5和表3-7)。虽然亚热带的蜡样芽孢杆菌平均检出率低于中温带，但是此气候区带的蜡样芽孢杆菌携带ces基因的菌株数量高于中温带的。原因是大米的主产地集中在亚热带或热带湿润区，各区带的大米样品采集不足，尤其是中温带的样品；可能会导致菌株数量的偏斜，所以并不能按照检出的菌株数量来衡量和比较不同气候区域蜡样芽孢杆菌携带ces基因情况。3.3.3其他蜡样芽孢杆菌群菌株分析肠毒素基因cytK2、nheB和hblC的同时存在，在苏云金芽孢杆菌中具有很高检出率，与文献报道一致[70,85,86]。肠毒素基因确实普遍存在于苏云金芽孢杆菌。宋树森等[87]人采用肠杆菌基因间重复一致序列—PCR(ERIC-PCR)技术，发现与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致，也证明了二者在遗传上的高度同源性。依据苏云金芽孢杆菌指纹图谱的保守性和蜡样芽孢杆菌指纹图谱的变异性，推测出，苏云金芽孢杆菌在进化过程中出现较晚，同时支持了国外学者们关于苏云金芽孢杆菌可能是获得携有cry基因质粒的蜡样芽孢杆菌变种的观点。52 武汉轻工大学硕士学位论文蜡样芽孢杆菌群的导致的腹泻性食物中毒，主要是基因组编码的毒素蛋白。不仅产肠毒素蜡样芽孢杆菌可导致腹泻型食物中毒，其他芽孢杆菌也产致腹泻型肠毒素。NeilJ.Rowan等[88]人从非肠胃型病症感染(如诱导雌性牛羊流产和牛乳腺炎)的动物上分离出的11株芽孢杆菌，包括7株蜡样芽孢杆菌、2株地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、1株多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)和1株凝结芽孢杆菌(B.coagulans)；首次发现这些分离自感染非肠胃型严重疾病动物身上的6株蜡样芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，会携带产毒素蜡样芽孢杆菌具有的致腹泻型毒素HBL；凝结芽孢杆菌也产肠毒素蛋白BceT。近期报道CytK是引起严重的急性病症的主要毒力因子，与溶血素HlyII相近，许多蜡样芽胞杆菌群的细菌均含有该毒素。苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensisvarisraelensisATCC35646)和多数蜡样芽孢杆菌群一样，基因组编码各种肠毒素：细胞毒素K、NheA、NheB、NheC、HblC和HblA。而hblD基因位于该菌的非重叠群基因组区域。cytK的同源基因，hlyΠ，被编码一些噬菌体的相关蛋白基因簇断开。BouzianeMoumen等[89]研究学者们发现该菌的部分基因组序列包含一些潜在的诱导性前噬菌体基因，其中一个可整合到hlyΠ基因上。成功建立了将前噬菌体phIS3501插入到该菌的hlyΠ基因，因前噬菌体编码含有移码突变的赖氨酸基因而阻止了噬菌体粒子的形成；当丝裂霉素C诱导phIS3501从细菌基因组缺失后，可导致hlyΠ基因的连续性，从而编译有活性的溶血素；还发现hlyΠ基因的N端和C端，由两个重叠群分开，当前噬菌体基因缺失时，可使hlyΠ基因恢复其活性功能，这种基因排列与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和梭状芽孢杆菌(Clostridia)的孢子形成基因sigK，以及金黄色葡萄球菌(S.aureus)的β-溶血素基因hbl相似。袁永明等[90]研究发现，苏云金芽孢杆菌的毒性质粒可在蜡样芽孢杆菌群间水平转移。获得质粒的受体菌具备了质粒编码基因的功能，可产生杀虫蛋白晶体。蜡样芽孢杆菌群之间的水平基因转移，使得该菌群的传统分类界限越来越模糊，新特性的获得使得菌群各个体更能适应不同环境，也对食品安全提出了更高的要求。53 武汉轻工大学硕士学位论文3.4小结(1)蜡样芽孢杆菌各毒素基因在不同气候区域分布的显著差异性，温度是最重要的影响因子。各地区产毒素菌株检出率各异，90.0%的蜡样芽孢杆菌至少携带一种肠毒素基因。nheB普遍高于cytK2、hblC。(2)13.8%(37/268)的ces基因高检出率，产呕吐毒素ces基因蜡样芽孢杆菌中，多数(94.6%)携带nheB基因。呕吐毒素和肠毒素的同时存在，更增强了蜡样芽孢杆菌的毒素能力。本次研究得出的大范围检测大米中蜡样芽孢杆菌毒素情况，具有重要的科学价值。(3)肠毒素基因cytK2、nheB和hblC的同时存在，在苏云金芽孢杆菌中具有很高检出率，基于与蜡样芽孢杆菌在遗传上的高度同源性，以及苏云金芽孢杆菌的毒性质粒可在蜡样芽孢杆菌群间水平转移，作为杀虫剂的苏云金芽孢杆菌也是食品中不容忽视的潜在可能致病菌株。54 第4章蜡样芽孢杆菌热生长实验及表型特征研究第4章蜡样芽孢杆菌的热生长实验及表型特征研究4.1材料和方法4.1.1菌株(1)标准株表4-1：实验所用标准株Table4-1：Bacterialstrainsusedinthestudy菌株编号性质来源韦氏芽胞杆菌模式株，呕吐型毒素阴德国微生物与细Bacillus.weihenstephanensis性，6℃生长阳性对照株胞保藏中心DSMZ11821RcytK1和48℃、50℃高B.cereusNVH391-98丹麦奥胡斯大学温生长的阳性对照株ITSPCR和生理生化试验B.cereusATCC14579丹麦奥胡斯大学的阳性对照株(2)实验菌株从大米样品分离出的蜡样芽孢杆菌群微生物284株。4.1.2培养基和试剂(1)T3等培养基：参见第二章2.1.3。(2)淀粉琼脂培养基：马铃薯淀粉/可溶性淀粉9.5g营养肉汤25g琼脂12g稀释至1000mL分装烧瓶，115℃20min灭菌。(3)水杨苷培养基[91]：(NH4)2PO41.0gKCl0.2gMgSO4·7H2O0.2g酵母抽提物0.2g琼脂13.0g稀释至1000mL55 武汉轻工大学硕士学位论文加热溶解，加入3.2mL1%的溴百里酚蓝，pH调至7.1，分装成100mL，115℃20min灭菌。水杨苷需用无菌过滤器过滤。先将水杨苷配制成10%的溶液，需要80℃才能溶解，而且一冷却即结晶析出，过滤需非常快。加入培养基内使终浓度达到1%，分装到试管内，制成斜面。(4)卢氏碘液(Lugal’siodine)：KI，10g；I2，5g；蒸馏水，100mL。用20~30mL水溶解KI，加I2，温和加热，持续搅拌至I2溶化，定容，用棕色带塞的玻璃瓶放暗处存放。4.1.3方法(1)生长温度范围测试将测试菌株点接到T3培养基上放入培养箱孵育，温度波动±0.5℃。观察在不同温度下(6℃培养21d、8℃培养21d、10℃培养15d、48℃培养3～4d、50℃培养3～4d)蜡样芽孢杆菌的生长情况。6℃、8℃和10℃的生长测试，以韦氏芽胞杆菌B.weihenstephanensisDSMZ11821R作为阳性对照，B.cereusATCC14579作为阴性对照。48℃和50℃的生长测试，以B.cereusNVH391-98作为阳性对照，B.weihenstephanensisDSMZ11821R作为阴性对照。判断依据：阳性对照菌株能形成正常大小的菌落，而阴性对照菌株不生长，为正常结果；再转接入30℃培养2d，验证接种菌株是否正常生长。将生长情况分为：—：不生长；＋：生长；＋＋：生长良好；＋＋＋：生长旺盛。(2)淀粉水解试验将测试菌株点接到淀粉琼脂培养基上，在30℃培养48h。生长后取出，在菌落处滴加卢氏碘液少许，菌株周围有透明圈，而培养基呈深蓝色。分别测量菌落的直径和透明圈的直径，然后计算透明圈与菌落面积之比。比值越大，说明淀粉酶能力越强。(3)水杨苷水解试验接种测试菌到水杨苷培养基斜面上，30℃培养不超过5d，观察培养基颜56 武汉轻工大学硕士学位论文色。判断结果，细菌将水杨苷水解后可产生水杨醇，其容易被氧化而产生水杨酸。溴百里酚蓝(pH值指示剂，变色范围6.0～7.6，变化由黄色经绿色到蓝色)，当培养基颜色是黄色，为水杨苷水解阳性；培养基颜色是蓝色，为水杨苷水解阴性。(4)溶血试验详见2.1.3章节。4.2结果4.2.1分离株在不同温度下生长情况表4-2不同温度下268株B.cereus分离株生长情况Table4-2Growthof268B.creusisolatesindifferentcentigradedegree温度/℃菌生长程度68104850—268263165154268＋0425500＋＋0044420＋＋＋0134220生长比例/%—1.937.741.4—注：—：不生长；＋：生长；＋＋：生长良好；＋＋＋：生长很好。表4-2显示，蜡样芽孢杆菌分离株的温度生长范围很广，为8℃～48℃。蜡样芽孢杆菌培养在8℃、10℃、48℃时，其生长菌株所占比例分别为1.9%、37.7%、41.4%。同时可在10℃～48℃之间生长的有22株(8.2%)，其中多数菌株(81.8%)菌株在10℃比在其他温度条件下生长更旺盛。16株苏云金芽孢杆菌中，只有2株可在48℃生长，其他温度未长。1株蕈状芽孢杆菌，在这4个温度下均未生长。此外，分析显示，91.9%（34/37）产呕吐毒素ces基因的蜡样芽孢杆菌可57 武汉轻工大学硕士学位论文在48℃生长良好，其他温度6℃、8℃、50℃均未生长。表4-310℃和48℃培养条件下不同温度带的B.cereus分离株生长情况Table4-3GrowthofB.creusisolatesfromdifferentclimateareasundertheconditionof10℃and48℃10℃48℃ABCABC—1822125942103＋213204937＋＋012329330＋＋＋412182515总数24591852459185注：A.中温带；B.暖温带；C.亚热带χ2检验，分离自不同温度带的B.creus对高温和低温的适应性有显著差异(P<0.01)。暖温度的B.creus较适应低温环境；在8℃培养时，有4株(80%)B.creus分离株来自暖温带区域。4.2.2淀粉和水杨苷水解试验结果表4-4菌株分离株的水解淀粉和水解水杨苷情况Table4-4StarchhydrolysisandSalicinhydrolysisofB.cereusGroupisolates淀粉水解水杨苷水解总计—＋＋＋＋＋＋±—＋±B.cereus268113735919412113210B.thuringiensis16233712102B.mycoides11———B.cereus+cesgene37361361—注：：阴性；＋：水解；＋＋：良好；＋＋＋：很好。±：不确定。表4-4，不能水解淀粉和水杨苷的蜡样芽孢杆菌分别有42.5%(114/268)、58 武汉轻工大学硕士学位论文45.1%(121/268)，7.1%(19/268)的蜡样芽孢杆菌具有强水解淀粉能力。苏云金芽孢杆菌各菌株水解淀粉和水杨苷能力不一。37株ces基因阳性的蜡样芽孢杆菌中，各有36(97.3%)株淀粉水解阴性和水杨苷水解阴性。113株淀粉水解阴性菌株，有36(31.9%)株携带ces基因。4.2.3溶血试验结果国内外标准关于蜡样芽孢杆菌的溶血试验，均认为蜡样芽孢杆菌通常具有β-溶血环，苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。老化的培养基经常会呈现微弱的γ-溶血环。表4-5分离菌株的溶血情况Table4-5HaemolysinassayofB.cereusGroupisolates溶血能力菌株—β-溶血环微弱或局限溶血环B.cereus4614676B.thuringiensis1402B.mycoides1B.cereus+ces41122表4-5结果显示，大部分(82.8%)B.cereus具有β-溶血环或者具有微弱或局限溶血环，只有46株(17.2%)不溶血。B.thuringiensis多数(87.5%，14/16)不溶血，B.mycoides具有β-溶血环，携带ces的B.cereus，89.2%具有溶血性。4.3讨论4.3.1在不同温度下的生长分析定义可在7℃生长的为嗜冷细菌[92]，所以这些蜡样芽孢杆菌都属于嗜中温菌。目前文献报道蜡样芽孢杆菌可在4℃～50℃生长[76]，即使大米在冷藏条件下蜡样芽孢杆菌也会繁殖生长。59 武汉轻工大学硕士学位论文蜡样芽孢杆菌的生长温度的范围受培养基或营养物质丰度的影响。如嗜冷蜡样芽孢杆菌，在7℃时不能在小胡瓜肉汤中生长，却可在丰富的实验培养基中生长良好；在10℃时，在二者培养基里都可生长，但是在小胡瓜肉汤比在丰富的实验培养基上的生长时间明显滞后20倍[93]。产呕吐毒素ces基因的蜡样芽孢杆菌可在48℃生长良好，对食品安全来说，这是很不好的信息。呕吐毒素cereulide非常稳定，耐热(能耐受126℃，90min)、耐强酸(pH2.0)、耐蛋白酶水解，所以食用前的重新加热、胃酸和肠道中的蛋白酶都不能破坏该毒素[71]。尤其是，相比蛋和肉制品及液体食品，蒸煮的米饭和富含淀粉质的食物中cereulide的含量很高。最近研究的热点中，发现环境对cereulide表达有影响，包括各种食物中cereulide的表达量也不一样。4.3.2淀粉和水杨苷水解试验分析之所以选水杨苷试验、溶血试验和淀粉分解试验来做，是因为曾有很多试验发现呕吐型蜡样芽孢杆菌一般是微弱溶血/不溶血，淀粉酶阴性，水杨苷阴性，甚至有人提出以此为依据对呕吐型蜡样芽孢杆菌进行初筛，即不能水解淀粉是产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌菌株的特性。而本研究中，只有1株(2.7%)产呕吐毒素ces基因菌株可水解淀粉，同时携带cytK2和nheB基因；还有1株(2.7%)可水解水杨苷，同时携带cytK2基因。通过淀粉酶试验和水杨苷试验结果显示，这些单一的表型与产呕吐毒素基因型并无相关性，所以采用此法筛选呕吐毒素阳性菌株不准确，有一定的漏检率(2.7%)，这与最近文献报道是一致的[94]。淀粉水解阳性株中0.65%(1/155)为携带ces基因，而淀粉水解阴性菌株中31.9%(36/113)携带ces基因；大米等淀粉质丰富的食品往往是引发呕吐型Bc食物中毒的食品，但是呕吐型Bc决大多数确实不能利用淀粉的，这一点一直令人费解。4.3.3溶血试验分析B.cereus有46株不溶血。这与大量研究的蜡样芽孢杆菌普遍具有溶血现象特征不一致。MousumiBanerjee等[51]在急性腹泻患者分离出的蜡样芽孢杆菌菌株中，76%具有溶血现象，而其余不溶血菌株均不含任何hblDCA基因。但并60 武汉轻工大学硕士学位论文非不含任何hbl基因就没有溶血现象，可能这些非连续溶血的蜡样芽孢杆菌株含有hblDCA基因的操纵子，而有完全溶血现象的菌株缺乏其中一个基因。蜡样芽孢杆菌的这种不溶血现象的解释和机理还有待进一步研究。B.thuringiensis多数(87.5%，14/16)不溶血，B.mycoides具有β-溶血环，携带ces的B.cereus，大部分(89.2%)具有溶血性。4.4小结(1)对蜡样芽孢杆菌进行生长特征实验，发现，蜡样芽孢杆菌的温度生长范围很广，为8℃～48℃，均属嗜中温菌。菌株在48℃或10℃生长较好，说明菌株是生长范围在不断扩大。产呕吐毒素ces基因的蜡样芽孢杆菌也可在48℃生长良好，因呕吐毒素具有耐热性质，这类菌株通常会引起呕吐型食物中毒。(2)通过淀粉酶试验和水杨苷试验结果显示，这些单一的表型与产呕吐毒素基因型并无相关性。(3)并不是所有的B.cereus都具有β-溶血环，溶血试验发现，还发现，仅有的一株B.mycoides具有β-溶血环，且其不携带这5种任何毒素基因，携带ces基因的B.cereus，cytK1和hblC阴性，多数具有溶血性，。本实验数据对研究蜡样芽孢杆菌群的表型和基因型关系，具有重有17.2%不溶血。所以通过溶血现象来判断和鉴定蜡样芽孢杆菌，不是完全100%。要的价值。同时我们的合作方还采用HPLC-MS分析定量呕吐毒素(数据未显示)，与PCR结果一致，凡含有ces基因的蜡样芽孢杆菌均产呕吐毒素；这也与文献报道一致[95]。61 第5章结论第5章结论国内对蜡样芽孢杆菌检测还是比较传统，且存在漏检；实验采用MPN法检测蜡样芽孢杆菌总数并分离，然后利用选择性培养基并结合ITS(核糖体RNA基因转录间隔区)序列分析，显示分离鉴定的蜡样芽孢杆菌群微生物准确率很高，达100%，说明蜡样芽孢杆菌群基因具有高度的同源性。对全国各地区大米进行蜡样芽孢杆菌检测并进行统计分析，来自25个省市地区均有蜡样芽孢杆菌检出，含菌量为39.1CFU/g(3.0～1100CFU/g)。不同气候区域的蜡样芽孢杆菌有显著差异，温度是影响蜡样芽孢杆菌生长的一个重要因素，在秦岭-淮河以南的亚热带，温度最适宜蜡样芽孢杆菌生长，且实验发现含ces基因的蜡样芽孢杆菌在48℃生长良好。实验发现土壤(<1%)和食品(米粉、巴氏乳、冰激淋、生蔬菜类等，<8.5%)中产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的检出率不高，但是在大米中却相当高(13.8%)。这个结果具有重要的研究意义。研究表明，美国大米样品中蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素基因未检出，但国内的检出率十分较高；反之，国外比国内的肠毒素基因检出率较高；这可能与国内蜡样芽孢杆菌食物中毒症状主要是呕吐为主，国外为腹泻为主有关。由于蜡样芽孢杆菌生长对营养要求不高，空气、土壤、尘埃、水等广泛存在，加之大米的流通性强，在加工、运输、贮藏、销售等各个环节均易受到蜡样芽胞杆菌污染。国外主要研究各种快速检测大米中蜡样芽孢杆菌的方法。因为呕吐毒素无抗原性，不能用免疫方法进行定性定量，目前常采用HPLC-MS和公猪精子动力法。而肠毒素可以采用TecraVIA酶免疫试剂盒检测Nhe的45kDa蛋白和BCET-RPLA(反相被动乳胶凝集)检测Hbl毒素的L2。但是ChandrakantAnkolekar等发现与PCR相比，也会存在漏检性。日本早先研究蒸煮大米中蜡样芽孢杆菌，孟加拉国是针对本地高产大米种类，而美国相对研究的比较全面，但也局限于采样区域不够广。本次实验的关键步骤首先是大米样品的采集的难度很大。根据全国大米产地分布情况，进行采样，尽量做到具有地区代表性，62 武汉轻工大学硕士学位论文同时又要保障采样的准确性、可靠性。所以主要针对各省市市售普遍食用的大米进行了检测。本实验研究结果显示，79.9%样品检出有蜡样芽孢杆菌，菌数的对数值服从正态分布。实验中，通过淀粉酶试验和水杨苷试验等生化试验的表型特异性快速检测蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素基因，具有很高的准确性97.3%，但是不能达到100%，往往会有遗漏，表明这些单一的表型与产呕吐毒素基因型并无相关性。含ces基因菌株常常会存在于大米等淀粉质食品中。目前，我们采用MLST和PanC基因对蜡样芽孢杆菌高毒株进行了分子分型等前期的工作，之后准备在大米分离株中继续深入做。我们还采用HPLC-MS分析定量呕吐毒素，凡ces基因阳性的蜡样芽孢杆菌其呕吐毒素cereulide也能检出高峰值；反之，ces阴性菌株其cereulide未检出。化学定量分析和PCR结果显示一致。希冀利用免疫技术，结合分子生物学方法、计算机等技术，使食源性致病菌的检测逐步向灵敏度高、特异性强、重复性好等方向发展。在科研方面不断加强对食源性致病菌的检测和致病性研究。本研究旨在初步对我国主食大米中食源性致病菌蜡样芽孢杆菌及其毒素因子在不同区域的分布进行分析，结合全国频发食物中毒事件，深入挖掘蜡样芽孢杆菌的信息，有效预测食品中蜡样芽孢杆菌的污染情况，寻求有效控制该菌的方法，保护食品安全和卫生，确保公众安全。63 武汉轻工大学硕士学位论文参考文献[1]史海根，王建明．2000－2009年全国重大食物中毒情况分析[J]．中国农村卫生事业管理，2011-8，31(8)：835-838[2]ElaineScallan，RobertM．Hoekstra，FrederickJ．Angulo，etal．FoodborneIllnessAcquiredintheUnitedStates—MajorPathogens[J]．EmergingInfectiousDiseases，2011，17(1)：7-15[3]刘秀梅，陈艳，王晓英，等．1992~2001年食源性疾病暴发资料分析——国家食源性疾病监测网[J]．卫生研究，2004-11，33(6)：725-727[4]毛雪丹，胡俊峰，刘秀梅．2003－2007年中国1060起细菌性食源性疾病流行病学特征分析[J]．中国食品卫生杂志，2010，22(3)：224-228[5]C．W．Hedberg，K．L．Palazzi-Churas，V．J．Radke，etal．Theuseofclinicalprofilesintheinvestigationoffoodborneoutbreaksinrestaurants：UnitedStates，1982－1997[J]．Epidemiol．Infect，2008，136：65-72[6]SoniaSenesi，andEmiliaGhelardi．Production，SecretionandBiologicalActivityofBacilluscereusEnterotoxins[J]．Toxins，2010，2：1690-1703[7]RitsukoKuwana，aisukeImamura，HiromuTakamatsu，etal．DiscriminationoftheBacilluscereusGroupMembersbyPatternAnalysisofRandomAmplifiedPol-ymorphicDNA-PCR[J]．BiocontrolScience，2012，17(2)：83-86[8]MichaelE．Zwick，SandeepJ．Joseph，XavierDidelot，etal．Genomicchara-cterizationoftheBacilluscereussensulatospecies：BackdroptotheevolutionofBacillusanthracis[J]．GenomeResearch，2012，22：1512-1524[9]GuinebretièreMH，AugerS，GalleronN，etal．Bacilluscytotoxicussp．nov．isanovelthermotolerantspeciesoftheBacilluscereusGroupoccasionallyassocia-tedwithfoodpoisoning[J]．IntJSystEvolMicrobiol．2013，63(1)：31-40[10]JungMY，PaekWK，ParkIS，etal．Bacillusgaemokensissp．nov．，isolatedfromforeshoretidalflatsedimentfromtheYellowSea[J]．JMicrobiol．2010，48(6)：867-7164 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武汉轻工大学硕士学位论文致谢衷心感谢尊敬的导师周帼萍副教授三年来对我的悉心栽培和辛勤教导。常青花园的樟树绿了一年又一年，马上就要毕业了。在三年研究生时光里，虽然和周老师相处时间不多，但是周老师的话每每都让我醍醐灌顶，得使实验顺利进行。周老师不仅在学习和研究工作中给予我耐心指导和鼓励，并且在生活上也给我无微不至的关怀，让我倍受感激。周老师严谨的科学思维、求实的科研精神、渊博的知识、敏锐的科研判断力以及对教学和科研的兢兢业业，严于律已、平易近人又亦师亦友，让我在学到许多知识的同时，也在工作、为人处事等方面都受益匪浅。在论文的选题、研究和撰写过程中，始终得到周老师的支持和指导。谨此向我的导师周帼萍老师致以崇高的敬意和衷心的感谢！祝周老师身体健康、阖家美满！衷心感谢生物与制药工程学院的刘志国院长、杨江科教授、李睿教授等在课题设计和实验数据处理中提出的中肯建议，以及对我的关心、信任和厚待！感谢曾池副教授、王继刚老师、周林萍老师、彭芳老师在生活和学习上给与我的指导和帮助。感谢本实验室的王洋师姐，在实验工作中给予我无私的帮助和指导，耐心的教我实验技术和方法。感谢实验室的研究生陈雅蘅和刘勇，在生活中对我的照顾。感谢2011届本科毕业的师弟师妹们池海峰、曾维剑、柳超、刘晓云等，参与了课题实验，使实验能够顺利的完成。感谢在样品搜集工作中的所有朋友们！感谢2010级硕士生班的全体同学给予我最深厚的友谊！感谢学校的领导、老师和同学们！最后衷心的感谢我的父母、亲人和朋友对我不懈的支持、鼓励和谅解。蒋荣荣二零一三年五月于武汉74 武汉轻工大学硕士学位论文攻读学位期间的研究成果1雷鸣，蒋荣荣，鞠荣华，肖云，周帼萍．低温肉制品中微生物检测及优势菌群的鉴定和分析[J]．中国酿造，2013，32(3)：83-862蒋荣荣，刘晓云，陈雅蘅，周帼萍．豆豉中蜡样芽孢杆菌污染情况分析[J]．中国酿造，2013，32(3)：67-693蒋荣荣，赵炜，王洋，周帼萍．酸菜包外包膜污染菌分析[J]．中国酿造，2013，32(1)：133-1364王洋，蒋荣荣，周帼萍．我国首例因Asaiasp．污染而导致含果汁及果肉饮料变质的案例分析[J]．中国酿造，2012，31(11)：138-1415蒋荣荣，王洋，周帼萍．干浆米线的变质微生物及其污染源分析[J]．武汉工业学院学报，2012-2，31(2)：10-1475