《新城疫病毒GM株反向遗传操作系统的建立及重组疫苗的研制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：10564学号：2011128002分类号：S852.65密级：博士学位论文新城疫病毒GM株反向遗传操作系统的建立及重组疫苗的研制孙敏华指导教师：任涛教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：吴清平院士中国·广州2016年12月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南农业大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅或在校园网上发布并供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览（除在保密期内的涉密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。作者签名：日期：导师签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要新城疫（Newcastledisease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的，严重威胁家禽养殖业的重大疫病之一。尽管采取了密集免疫措施，但该病仍然时有发生。自1997年基因Ⅶ型NDV毒株在我国被首次发现以来，该基因型毒株呈流行态势。研究表明LaSota疫苗对一些基因Ⅶ型毒株仅能提供部分保护。由于不同基因型之间的NDV存在一定的抗原性差异，因此开发出与流行基因型相匹配的疫苗无疑是有效防控新城疫的重要手段之一。为了建立新城疫病毒反向遗传操作系统，本研究利用HA效价为8log2的基因Ⅶ型GM纯化病毒作为亲本毒株，将其基因组分5个片段进行克隆。同时通过引入AscI酶切位点作为重组病毒的分子标签以区分亲本毒和重组毒。在将基因组克隆至低拷贝质粒TVT7R(0,0)载体中的过程中，通过引入锤头状核酶序列（Hammerheadribozyme，HamRz）并借助载体上的丁型肝炎病毒的自催化核酶元件（Hepatitisdeltavirusribozyme，HdvRz）构建了其全长cDNA克隆。通过微型基因组和辅助质粒的构建，完成了拯救系统的评估，成功拯救了重组病毒rGM，其分子标签稳定性良好，传代15代不发生回复突变。重组病毒rGM株除分子标签外，基因组还发生了G430T、C4584A、A6927C、G7091A和A7644G突变，它们导致了NP蛋白D103E，F蛋白P12H以及HN蛋白R225H的突变。这3处突变使病毒在12~60h内的体外复制能力提高了近10倍。新城疫F蛋白裂解位点是毒力的主要决定因素。通过融合PCR技术，将GM株F蛋白的裂解位点由112RRQKRF117分别突变为112GRQGRL117和112ERQERL117，所获得的重组毒株分别命名为rGM-Ⅶm和rGM-Im，他们比亲本强毒株rGM的HA效价高4倍，EID50高100倍，是良好的疫苗候选株。通过致病指数MDT和ICPI测定发现，裂解位点的112位和115位非碱性氨基酸对毒力也有一定的影响。随后，通过灭活疫苗和活疫苗免疫试验发现，尽管活疫苗诱导的HI抗体水平比灭活疫苗低2log2，但他们HI抗体水平都大于5log2，都能够起到100%免疫保护作用。GM强毒攻击结果显示，相对于商品LaSota疫苗，以重组基因Ⅶ型疫苗免疫的鸡能够至少减少2d的排毒时间，降低了排毒率。为了研制新城疫重组活载体疫苗，本研究在GM株P和M基因的非编码区中引入了PmeI酶切位点，并构建了含EGFP和H5亚型禽流感病毒HA基因的重组质粒。I 最终仅成功拯救表达EGFP的重组病毒，其HA效价下降了16倍，EID50下降了近1000倍，同时在CEF上的生长滴度下降了约10倍。这说明插入外源基因对病毒复制能力影响较大，因此需要进一步优化外源基因插入策略。综上所述，本研究成功建立了基因Ⅶ型新城疫病毒GM株的反向遗传操作系统，证实了裂解位点第112位和115位非碱性氨基酸对病毒毒力的影响，明确了基因Ⅶ型重组灭活疫苗和活疫苗的优势，实现了活载体疫苗的初步探索，为新城疫病毒毒力及新型疫苗的研究奠定了基础。关键词：新城疫病毒；反向遗传；突变；重组；病毒活载体II ConstructionofReverseGeneticsSystemofGMStrainandDevelopmentofRecombinantVaccinesforNewcastleDiseaseVirusSunMinhua(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,GuangZhou,P.R.China,510642)Abstract:Newcastledisease(ND)iscausedbyNewcastlediseaseviruse(NDV),anditisoneofthemostdevastatinginfectiousdiseasesinpoultryindustry.Althoughintensiveimmunemeasureshadbeenadopted,theoccurrenceofNDisfrequentlyreported.Since1997,NDVofgenotypeⅦwasfirstreportinChina,thenthisgenotypebecamedominant.ResearchshowedafewvirusofgenotypeⅦcanbreakofftheprotectionofLaSotavaccine.SincetheNDVofdifferentgenotypehadantigenicmismatch,therefore,thedevelopmentoffieldisolatesmatchedvaccinewouldbeofvitalimportancefortheeffectivecontrolofND.TogeneratethereversegeneticssystemofNDV,purifiedGMvirusofgenotypeⅦwhohadHAtitersof8log2hadbeenchoosedastheparentalvirus.Then,thegenomeofGMhadbeendividedinto5fragmentsandclonedintoTVT7R(0,0)vector,hepatitisdeltavirusribozymesequenceincluded,byintroducinganAscIenzymecuttingsitesforthediscrimnationofparentalvirusandrecombinantvirus.Inthecloningprocedures,ahammerheadribozymesequencehadbeenintroduceddownstreamoftheT7promoterforthecontructionoffulllengthcDNAcloneofGM.Thefeasibilityofvirusrecoverysystemwasevaluatedbytheminigenomeandhelperplasmids.Soonafter,therecombinantvirus(rGM)wasrecoveredandthebiomarkerwasverystableafter15continouspassages.However,exceptthebiomarkeratnt6789,therewerefiveothersubstitutionsonrGMwhencomparingwithGM,nt430GtoT,nt4584CtoA,6927AtoC,nt7091GtoA,nt7644AtoG,whichresultedintheaminoacidD103EsubstitutionofNPprotein,P12HsubstitutionofFproteinandR225HsubstitutionofHNprotein.Thesemutationsresultedintheincreasementofreplicationat12hpi(hourspostinoculation)to60hpiinvitro.ThecleavagesiteofFproteinisregardedasthevirulencedeterminantofNDV.ThevirulentcleavagesiteofGMwaschangedfrom112RRQKRF117to112GRQGRL117andIII 112ERQERL117byfusionPCR.ThecorrespondingrecombinantviruseswererGM-ⅦmandrGM-Im,whichresultin4-foldhigherHAtitersand100-foldhigherEID50,makingthempotentialvaccinecandidates.PathogenicitytestincludingtheMDTandICPIshowedthatthenon-basicaminoacidsinposition112and115werecontributedtothevirulenceofND.Forvaccinestudy,resultsshowednomatterliveorinactivated,recombinantattenuatedvirus,elicitedHItitersmorethan5log2,couldprovidefullprotectionagainstthechallengeofGMalthoughtheHItitersofinactivatedvaccinewas2-foldhigherthanlivevaccine.What’simportance,therecombinantattenuatedvirusshortentheperiodandreducedthenumbersofvirussheddingthanthecommercialLaSotavaccines.TogeneraterecombinantvectoredliveNDV,aPmeIenzymecuttingsitewasintroducedintothenon-codingregionofPandMgeneofGM.ThentheplasmidscontainingtheORFsofEGFPandHAgeneofH5subtypeAIVweresuccessfullyconstructed.ResultsshowedthatonlyrecombinantvirusvectoredEGFPwasrecovered,buttheHAtitersdecreased16fold,EID50andtitersofvirusreplicationinvitrowaseven1000foldand10foldlowercomparedtorGM-Im.Hence,thestrategyforforeigngenesintroductionshouldbefurtheroptimized.Takentogether,ourstudysuccessfullyestablishedthereversegeneticssystemfortherescueofGM.What’smore,thecontributionofnon-basicaminoacidsinposition112and115tothevirulenceofNDwasdetermined.Meanwhile,theadventagesofinactivatedandlivevaccinespreparedbyrecombinantattenuatedviruswerealsoclarified.Inaddition,theviralvectoredvaccineofGMwasalsoexplored.ThesestudieswouldbefundamentalforthevirulencestudyandvaccinedevelopmentofNDV.KeyWords:Newcastlediseasevirus;Reversegenetics;Mutation;Recombinant;ViralvectoredvaccineIV 缩写词和中英文对照英文缩写英文全称中文全称AIVavianinfluenzavirus禽流感病毒AMPV-1avianparamyxovirusserotype1禽副黏病毒1型bpbasepair碱基对CATchloramphenicolacetyltransferase氯霉素乙酰转移酶cDNAcomplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸CEFchickenembryofibroblast鸡胚成纤维细胞CMVcytomegalovirus巨细胞病毒CPEcytopathiceffect细胞病变效应dday(s)天DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核苷酸dpidayspostinfection感染后天数dpcdayspostchallenge攻毒后天数DTTdithioghreitol二硫苏糖醇EID5050%egginfectiondosage50%鸡胚感染剂量ELD5050%egglethaldosage50%鸡胚死亡剂量Ffusionprotein融合蛋白ggram克Gguanine鸟嘌呤GEgeneend基因结束GSgenestart基因起始hhour小时HAhemagglutination血凝HamRzhammerheadribozyme锤头状核酶序列HdvRzhepatitisdeltavirusribozyme丁型肝炎病毒的自催化核酶HIhemagglutinininhibition血凝抑制HNhemagglutinin-neuraminidase血凝素-神经氨酸酶hpihourspostinoculation接种后小时数ICPIintracerebralpathogenicityindex1日龄雏鸡脑内接种致病指数V IVPIintravenouspathogenicityindex6周龄鸡静脉接种致病指数Llargeprotein大蛋白Mmatrixprotein基质蛋白MDTmeandeathtime鸡胚平均死亡时间mgmilligram毫克minminute分钟mLmilliliter毫升mMmillimolesperliter毫摩尔每升mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核苷酸NAneuraminidaseactivity神经氨酸酶活性NationalcenterforbiotechnologyNCBI美国国家生物技术信息中心informationNDNewcastledisease新城疫NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒NPnucleocapsidprotein核衣壳蛋白ntnucleotide核苷酸OIEOfficeInternationaldesEpizooties世界动物卫生组织ORFopenreadingframe开放阅读框Pphosphoratedprotein磷蛋白PBSphosphatebufferedsalinesolution磷酸盐缓冲液PCRploymerasechainreaction聚合酶链式反应pfuplaqueformingunit蚀斑形成单位polyApolyadenylicacid聚腺苷酸PolⅡRNAPolymeraseⅡ核糖核酸聚合酶Ⅱr/minrevolutionsperminute转/分钟互补脱氧核糖核酸末端快速RACErapid-amplificationofcDNAends扩增技术RTreversetranscription反转录RT-PCRreversetranscription-polymerasechain反转录聚合酶链式反应reactionVI secsecond秒SPFspecific-pathogenfree无特定病原体μLmicroliter微升μMmicromolesperliter微摩尔每升VLPvirus-likeparticle病毒样颗粒VII 目录第1章前言..........................................................................................................................11.1研究背景.........................................................................................................................11.1.1新城疫简介..................................................................................................................11.1.2新城疫反向遗传拯救技术研究进展...........................................................................21.1.3利用反向遗传操作系统研究新城疫病毒的毒力相关基因......................................41.1.4新城疫病毒活载体的研究进展.................................................................................101.2研究目的及意义...........................................................................................................161.3研究技术路线...............................................................................................................17第2章新城疫病毒GM株全长cDNA克隆的构建.......................................................182.1引言...............................................................................................................................182.2材料与方法...................................................................................................................182.2.1毒株、载体和细胞.....................................................................................................182.2.2主要试剂与耗材.........................................................................................................182.2.3主要仪器....................................................................................................................192.2.4主要生物学软件........................................................................................................192.2.5血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）...............................................................192.2.6GM株的蚀斑纯化.....................................................................................................192.2.7GM株传代后病毒的滴度.........................................................................................192.2.8GM株基因片段的扩增及序列测定.........................................................................202.2.9GM株的分子进化分析.............................................................................................212.2.10GM株基因及TVT载体单一酶切位点分析..........................................................212.2.11GM株分子标签的选择及扩增片段分段方法.......................................................222.2.12GM株P1和P5基因片断的克隆及鉴定...............................................................232.2.13TVT-GM全长cDNA克隆的构建及鉴定..............................................................242.2.14辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L基因的克隆及鉴定.......................................252.2.15微基因组的构建及验证...........................................................................................262.2.16GM株的拯救和鉴定...............................................................................................282.2.17拯救的重组病毒rGM的传代稳定性.....................................................................282.2.18亲本毒和重组病毒生长曲线测定...........................................................................282.2.19亲本毒和重组病毒间接免疫荧光鉴定...................................................................292.2.20rGM株ELD50，MDT和ICPI的测定及其与亲本毒株的差异..........................292.3结果与分析...................................................................................................................302.3.1GM株的鉴定及纯化.................................................................................................302.3.2GM株鸡胚传代后病毒的滴度.................................................................................312.3.3GM株基因片段的扩增及序列测定.........................................................................322.3.4GM株分子进化分析.................................................................................................332.3.5GM株基因和TVT载体酶切位点分析....................................................................34VIII 2.3.6GM株分子标签的选择及扩增片段分段方法.........................................................342.3.7GM株P1和P5基因片断的克隆及鉴定.................................................................352.3.8TVT-GM全长cDNA克隆的构建及鉴定................................................................382.3.9辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L基因的克隆及鉴定.........................................422.3.10微基因组的构建及验证...........................................................................................432.3.11GM株的拯救和鉴定...............................................................................................432.3.12拯救的重组病毒rGM的传代稳定性.....................................................................452.3.13亲本毒和重组病毒生长曲线测定...........................................................................462.3.14亲本毒和重组病毒间接免疫荧光鉴定...................................................................462.3.15rGM株ELD50，MDT，ICPI的测定及其与亲本毒株的差异.............................472.4讨论...............................................................................................................................472.5小结...............................................................................................................................50第3章致弱突变株rGM-Ⅶm和rGM-Im的拯救及其免疫效果的初步研究..............513.1引言...............................................................................................................................513.2材料与方法...................................................................................................................513.2.1质粒、细胞、试剂和仪器.........................................................................................513.2.2引物设计与合成.........................................................................................................523.2.3突变片断的克隆及突变株全长克隆的构建.............................................................523.2.4突变株全长克隆的拯救.............................................................................................523.2.5重组病毒的鉴定及遗传稳定性.................................................................................523.2.6重组病毒的致病性.....................................................................................................533.2.7重组病毒的生长曲线.................................................................................................533.2.8rGM-Ⅶm和rGM-Im灭活疫苗的制备....................................................................533.2.9rGM-Ⅶm、rGM-Im和LaSota灭活疫苗免疫效果的比较研究.............................533.2.10rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗在鸡体内复制能力的研究........................................533.2.11rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗免疫效果的研究........................................................543.3结果与分析....................................................................................................................543.3.1突变片断的克隆及突变株全长克隆的构建.............................................................543.3.2突变株全长克隆的拯救.............................................................................................543.3.3重组病毒的鉴定及遗传稳定性.................................................................................553.3.4重组病毒的致病性.....................................................................................................563.3.5重组病毒的生长曲线................................................................................................563.3.6rGM-Ⅶm、rGM-Im和LaSota灭活疫苗免疫效果的比较研究.............................573.3.7重组rGM-Ⅶm和LaSota株在鸡体内复制能力研究.............................................583.3.8rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗免疫效果的研究..........................................................593.4讨论................................................................................................................................603.5小结...............................................................................................................................62第4章表达EGFP蛋白及表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白重组新城疫病毒载体的构建及拯救......................................................................................................................63IX 4.1引言...............................................................................................................................634.2材料与方法...................................................................................................................634.2.1质粒、细胞、试剂和仪器.........................................................................................634.2.2引物设计与合成.........................................................................................................634.2.3含PmeI酶切位点载体的构建及表达EGFP和HA基因载体的构建.................644.2.4全长克隆的拯救及重组病毒稳定性、致病性、生长曲线等指标的测定.............644.3结果与分析...................................................................................................................644.3.1含PmeI酶切位点载体的构建................................................................................644.3.2表达EGFP和HA基因载体的构建........................................................................654.3.3表达EGFP和HA基因重组病毒的拯救................................................................654.3.4重组病毒rGM-Im-EGFP稳定性的测定..................................................................664.3.5重组病毒rGM-Im-EGFP致病性、生长曲线等指标的测定..................................664.4讨论................................................................................................................................674.5小结................................................................................................................................68第5章全文讨论与结论....................................................................................................695.1全文讨论.......................................................................................................................695.2全文结论.......................................................................................................................715.3论文创新点....................................................................................................................71致谢......................................................................................................................................72参考文献..............................................................................................................................73X 第1章前言1.1研究背景1.1.1新城疫简介新城疫（NewcastleDisease，ND）是由新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV）引起的一种急性高度接触性传染病（Alexander&Senne,2008）。该病自1926年在印尼爪哇岛和英国新城分别发生以来，一直是严重危害养禽业的疫病之一。尽管ND只有1个血清型，但研究表明ND曾经历过4次大流行，并且每次流行的毒株都属于新的基因型（Abolniketal,2004；Czegledietal,2002；Liangetal,2002；Yangetal,1999）。其中，20世纪90年代末期，在亚洲、非洲、中东、南美洲和欧洲流行的ND被认为是该病的第4次大流行，此次流行毒株绝大多数均属于基因Ⅶ型（Lomniczietal,1998；Liuetal,2003）。NDV为单股负链病毒目（Mononegavirales）副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）中的1个成员（Mayo，2002）。其核酸类型为单股负链RNA。基因组长度有3种类型，分别为15186nt、15192nt或15198nt（Czegledietal,2006）。病毒基因组可编码6种蛋白，即核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein,NP）、磷蛋白（Phosphateprotein,P）、基质蛋白（Matrixprotein,M）、融合蛋白（Fusionprotein,F）、血凝素神经氨酸酶（Hemagglutinin-neuraminidaseprotein,HN）和大聚合酶蛋白（Largeprotein,L）。F蛋白和HN蛋白是病毒的囊膜蛋白，也是重要的保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体。其中，F蛋白首先被合成长度为553个氨基酸的无活性前体F0。激活F蛋白融合活性需要蛋白酶进行裂解修饰。弱毒株的F0蛋白只能被胰酶样酶修饰，故仅限于在上呼吸道和肠道细胞中；强毒株的F0蛋白可以被宿主体内广泛存在的蛋白酶裂解，因此使得病毒分布更加广泛（Alexander&Senne,2008）。研究表明F蛋白裂解位点序列是新城疫病毒毒力的主要决定因素（Peetersetal,1999）。HN蛋白根据终止密码子的不同，可分为3个类型：第1类为HN0616，为无活性的前体，需经水解后才能转化为有生物活性的HN蛋白，代表株有V4和Ulster，这类病毒通常为无毒株或者弱毒株；第2类为HN577，为有生物活性的HN蛋白，其代表株有B1，LaSota和BeaudetteC等，这类病毒可能是无毒株也可能是中等毒力毒株；第3类为HN571，也具有生物学活性，其代表株有Victoria、Herts和ZJ1等，一般为强毒株。HN蛋白主要有受体吸附，神经氨酸酶和促融合作用，也和毒1 力相关（Huangetal,2004）。然而最近Zhang等（2014）研究表明，HN蛋白可能存在第4种类型，即HN582。该类型的长度为个别基因Ⅷ型和基因Ⅶ型毒株所共有。NP、P和L蛋白和病毒基因组RNA结合形成核糖核蛋白体（RNP，Ribonucleoproteincomplex），以此作为病毒RNA合成的模板，因此获得NP、P和L蛋白是新城疫反向遗传操作平台工作的基础。NDV病毒6个结构蛋白的各组mRNA之前均有1个保守的转录起始信号3'-UGCCCAUCU/CU-5'，同时每个基因末端也含有转录终止信号3'-AA/UUCUUUUUU-5'。在起始信号和终止信号之间通常还有间隔序列，长度在1~47个核苷酸之间（Schapeetal,1988）。此外，在新城疫基因组的两端还有Leader序列和Trailer序列。1.1.2新城疫反向遗传拯救技术研究进展新城疫病毒基因组核酸类型为单股负链RNA。该类型的病毒核酸本身并不具有感染性，这就意味着，要想人工获得新城疫病毒就必须制造出正链RNA，而该过程需要形成RNP。因此，制造出新城疫病毒的RNP是反向遗传拯救技术成功的关键。而RNP的组成成分中，NP、P和L蛋白是必不可少的，因此需要正确高效表达这3个蛋白。一般而言，通过构建NP、P和L蛋白的真核表达质粒即可实现这3个蛋白的表达，如何获得基因组RNA成为病毒拯救的核心。1994年，狂犬病病毒被成功拯救（Schnelletal,1994），这是第1个被拯救的单股负链RNA病毒，随后VSV（水疱性口炎病毒）以及副黏病毒属的一些成员相继被成功拯救。这些技术的成熟为单股负链RNA病毒的拯救提供了重要指导。起初，拯救新城疫病毒使用的是T7聚合酶驱动的系统（简称T7系统）。简单来说，就是将病毒基因组的cDNA（互补DNA）克隆至含T7启动子载体的下游，然后通过转染表达T7聚合酶的细胞或者通过外源T7聚合酶的帮助，驱动病毒基因组的转录，随后在NP、P和L的辅助下，形成RNP，从而实现病毒的转录和复制。因此，要想成功拯救新城疫病毒，必须成功制备4个质粒。1999年Peeters首次从cDNA克隆成功拯救出LaSota。LaSota病毒基因组cDNA序列首先被利用不同酶切位点克隆至pOLTV5质粒中。该质粒来源于改造后的pOK12质粒，改造后的质粒包含T7DNA依赖的RNA聚合酶启动子，丁型肝炎病毒的自催化核酶以及T7噬菌体的转录终止信号。由于之前有报导称额外的2个G（鸟嘌呤）能够增加病毒的拯救效率（Schnelletal,1994），因此，该克隆方案在cDNA克隆的5’端引入了2个G。而其转录本的3’端，由于有丁型肝炎病毒的自催化核酶（HdvRz）作用，能够实现精准剪切，保证了2 病毒基因组的准确性。众所周知，许多副黏病毒的基因组都遵循“6碱基”规则，即基因组长度必须是6的倍数。而该cDNA克隆并不符合该规则，却能够成功拯救。其具体作用机制仍不清楚，但可能与病毒复制方式有关。在获得全长cDNA克隆的基础上，NP、P和L的基因序列被分别克隆到pCI-neo载体中。在获得这4个质粒后，首先利用FPV-T7（表达T7聚合酶的鸡痘病毒）感染CEF和QM5，按照5：8：4：4的比例将全长质粒、NP、P和L共转染上述细胞。在转染3~6d后接种9~11日龄SPF鸡胚，最终获得了拯救病毒。Römer-Oberdörfer等（1999）将另外1个疫苗株Clone30（LaSota经过30代克隆后的病毒株）基因组序列分段克隆至pX8δT载体（成功拯救狂犬病病毒所使用的载体）中，并将构建好的全长质粒、NP、P、L按照5：2：2：1的比例转染到BSRT7/5细胞中，并在5d后测定病毒HA效价。结果表明，拯救病毒和亲本毒的ICPI值均为0.29，而TCID10.411.050亲本毒为10/mL，拯救毒为10/mL。该研究首次使用BSRT7/5细胞拯救病毒，该细胞系是一种能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK21衍生细胞系。这样在利用T7系统时，转染前就不需要用重组痘病毒处理，为病毒拯救操作提供了便利。后来，另外一些新城疫毒株采用类似的方法均得以成功拯救。这其中包括BeaudetteC（Krishnamurthyetal,2000）、HitchnerB1（Nakayaetal,2001）、Herts/33（deLeeuwetal,2005）、ZJ1（Liuetal,2007）、9a5b（Yuetal,2012）、Banjarmasin/010/10（Xiaoetal,2012）、D90（Chaietal,2014）和SG10（Liuetal,2015）。然而，T7系统中需要额外提供T7RNA聚合酶。加之在一些拯救方法中，额外添加的FPV-T7鸡痘病毒会导致细胞病变，并且也能致死鸡胚。因此在使用的时候需要控制病毒的感染量，并且转染细胞过早病变对病毒拯救是不利的。为了克服这一缺点，后来发展出基于真核细胞RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）驱动的系统（简称PolⅡ系统）。该系统与T7系统最大的不同是：基因组cDNA克隆的转录本必须准确，不能出现多余碱基。并且不需要额外对转染细胞进行处理以获得T7RNA聚合酶或者使用表达T7RNA聚合酶的细胞系（如BSR-T7/5），这样最大限度地保证了拯救的效率。RNA聚合酶Ⅱ拯救系统有如下优点：①避免了长时间体外操作RNA。②RNA聚合酶Ⅱ有校正功能，可降低错配率，保证病毒基因组的准确性。③所有的真核细胞内都有RNA聚合酶Ⅱ，该系统有广泛的细胞适应性。④不需要额外提供T7RNA聚合酶，使用简便（葛金英,2006）。在该系统中，为了获得准确的转录本，在cDNA克隆的5’端需要引入锤头状核酶序列（HamRz），而3’端则含有丁型肝炎病毒的自催3 化核酶序列（HdvRz）。Li等（2011）利用巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）启动子驱动拯救出Mukteswar毒株。利用相似的方法，NDV4-C也获得了成功拯救，但分别使用T7和CMV启动子获得的病毒滴度并没有显著差异（Zhangetal,2013），这说明毒株差异可能是造成病毒滴度差异的原因之一。最近，利用CMV启动子还成功拯救出基因Ⅶ型强毒株NA-1株以及表达EGFP的重组病毒（Wangetal,2015）。Inoue等（2003）将狂犬病毒HEP-Flury分别用T7系统和PolⅡ系统进行了拯救，结果发现PolⅡ系统所拯救的病毒滴度更高，并且由于不需要T7聚合酶的帮助，因此在许多细胞上都可以实现病毒的拯救。此后有研究利用PolⅡ系统进行了新城疫病毒Mukteswar、V4和NA1株的拯救，结果也表明PolⅡ系统的效率优于T7系统（Lietal,2011；Zhangetal,2013；Wangetal,2015）。值得一提的是，在拯救Mukteswar株时也加入了HamRz序列，但是用2个系统拯救出来的病毒生物学特性没有太大差异。在狂犬病毒的拯救过程中，Ghanem等（2012）发现，在T7系统的基础上，将HamRz序列加入到基因组前面，狂犬病毒的拯救效率比传统的方法提高了100倍。由此可见即便是T7系统，基因组的精确性似乎对病毒的拯救更加有利。1.1.3利用反向遗传操作系统研究新城疫病毒的毒力相关基因利用反向遗传操作系统对病毒潜在的毒力基因/位点进行突变，通过表型的变化可以更直接地确定毒力相关因子。起初，研究者将目光投向了强弱毒株的一些明显差异上。Peeters等（1999）拯救出LaSota疫苗株，同时只对F蛋白裂解位点序列进行替换，使弱毒序列112GRQGRL117变为强毒序列112RRQRRF117。这样使得重组毒的ICPI值从0升高至1.28，病毒变成了中强毒。由此证明F蛋白裂解位点序列是新城疫病毒毒力的主要决定因素。随后，Römer-Oberdörfer等（2003）利用Clone-30为骨架，将其HN577类型的对应基因分别替换成HN616和HN571这2个长度，同时还进行了F蛋白裂解位点由弱至强的替换。结果发现，F蛋白的替换对毒力影响明显，而HN蛋白对毒力的影响较小。同年，deLeeuw等（2003）以LaSota为骨架，将F蛋白裂解位点突变为112RRQRRL117、112GRQGRF117、112RRQGRF117、112RGQRRF117和112RKQKRF117。通过ICPI测定，发现这些重组毒株的ICPI值从0~1.3不等。从测定ICPI值时发生死亡的鸡体内分离病毒，经序列测定显示，这些突变株的F蛋白裂解位点已经回复突变为112RRQ(K/R)RF117，并且其ICPI值也超过1.4。这提醒我们如果弱毒株拥有与强毒株裂解位点仅相差1~2个氨基酸序列时，该弱毒株可能变为强毒4 株。也就是说，这些毒株可能是从弱毒株进化成强毒株的中间毒株。上述研究表明，F蛋白裂解位点是新城疫病毒毒力的主要决定因素。然而，随着分离毒株的增多，人们发现了一些特殊的裂解位点序列。例如，部分非洲鸽源毒株和马达加斯加分离株的裂解位点具有112RRRK/RRF117的特点。因此Khattar等（2009）利用BeaudetteC毒株为骨架，进行了Q114R，K115R和I118V的替换。结果发现，Q114R的替换尽管增加了碱性氨基酸的数量，但是却降低了病毒的复制能力和毒力，若再进行I118V替换，病毒毒力进一步降低。尽管强毒株裂解位点换成弱毒株裂解位点通常会致弱病毒，但弱毒株裂解位点换成强毒后，并不一定增强病毒毒力。deLeeuw等（2003）将LaSota株的裂解位点换成强毒裂解位点后，对4周龄鸡的致病力却增加不明显，这说明还有其他因素与毒力相关。然而在脑内传代1次后，其ICPI值即增加到了1.3~1.7，而F蛋白却并没有氨基酸突变。Estevez等（2007）利用pBluescript质粒作为载体，构建了中等毒力毒株Anhinga的cDNA克隆，并将2个强毒株TkND和CA02的HN基因以及F和HN基因同时替换至骨架病毒中。替换强毒株HN基因的重组病毒甚至比亲本毒表现出更弱的致病力。F和HN基因双替换时，尽管ICPI值有所增加，但其致病力仍然不及亲本毒。动物试验表明，HN基因在组织嗜性和增强病毒入侵效率上作用明显，但对致病力的贡献不及F基因。Susta等（2010）在Estevez等（2007）的研究基础上，用4周龄SPF鸡对上述四个重组病毒进行了致病性研究。尽管这些重组毒均不能致死鸡，但是免疫组化显示，rAnhCAFHN和rAnhTKFHN在组织中的抗原量更多，其复制能力也稍强。然而，Huang等（2004）以BeaudetteC和LaSota为骨架，通过分别替换LaSota和BeaudetteC的HN基因，证实HN也与病毒毒力有关。不过将LaSota株HN基因替换成BeaudetteC株的HN基因后，病毒的复制能力同样能够增强。除了整个基因的替换，单个位点对病毒毒力的影响也比较大的。有研究（Khattaretal,2009）对BeaudetteC毒株HN蛋白唾液酸结合位点附近位点以及进行T214S、I219V、R416Q、S494G、E495V、R498Q、Y526Q和N568D突变，发现S494G突变能够降低病毒的ICPI，其MDT值也有所升高，对神经氨酸酶活性和毒力有轻微地降低作用。而Y526Q突变能够使病毒的红细胞吸附能力，神经氨酸酶活性和融合活性降低。同时对病毒的致弱作用还体现在生长滴度较亲本毒降低100倍、MDT值降低为弱毒株特性和ICPI值的降低等方面。而Estevez等（2011）证明有些单个位点突变，如保守位点I192M突变能够降低神经氨酸酶活性，增强促融合活性，尽管复制滴度5 降低了约10倍，但对病毒毒力影响不大。Kim等（2016）通过将BeaudetteC的F蛋白裂解位点替换成LaSota株的，再将F蛋白其他位点替换成强毒AKO株的，结果发现，发生T341S、M384I、T385A和I386L替换时，病毒体外复制能力和融合活性得到提高。如果进行N403D替换则严重影响F蛋白的复制和融合，并且还改变了其构象。还有一些研究通过定位蛋白功能区来研究其对病毒毒力的影响。deLeeuw等（2005）利用pOLTV5作为载体构建了Herts/33的cDNA克隆，其拯救方法与Peeters描述的相一致。通过与LaSota重组毒之间互换HN基因，证实除了F蛋白裂解位点序列，HN蛋白的茎干区（stemregion）和球头区（globularhead）均与病毒的毒力有关。Heiden等（2014）利用Clone30作为骨架，分别将ICPI为1.1的鸽源毒株R75/98株的F蛋白，F蛋白裂解位点，F基因编码蛋白的1~117位、1~527位、112~553位和528~553位与之相对应的序列进行替换。结果发现除了F蛋白裂解位点外，F蛋白尾部的胞质区序列对病毒的毒力影响也较大，这说明F蛋白的其他区域也与病毒毒力有关。Samal等（2013）通过BC株进行Y527A、Y524A突变或者删除胞质区最后2个氨基酸后，病毒的复制滴度可以提高10~100倍。此外，这2个位点的单突变会导致突变株MDT值降低，ICPI值显著升高。这说明F蛋白胞质区的关键氨基酸对病毒的复制和毒力均有影响。除了F和HN基因外，一些其他基因的替换、缺失或者多基因替换也会对病毒的毒力产生影响。Dortmans等（2009）利用Peeters等建立的反向遗传操作平台构建了基因VI型鸽源毒株AV324的cDNA克隆。由于鸽源毒株通常都具有强毒株裂解位点，但其ICPI值可能显示其为中等毒力。因此研究同时还利用Herts/33的F蛋白裂解位点与之互换。结果显示，互换裂解位点后，重组毒株与亲本毒株差异极小，这说明鸽源毒株的毒力可能还有其他基因的参与。随后，Dortmans等（2010）再次利用该平台，将AV324的NP、P、L基因与Herts/33的相应基因进行了单替换，同时还进行了NP和P基因的双替换以及NP、P和L基因的三替换。此次研究表明，NP、P和L基因的三替换对2个亲本毒株的毒力影响较大，M基因的作用较小。然而最近Kai等（2015）研究发现，基因Ⅶ型的M、F和HN基因和病毒导致的病理变化程度关系密切。该研究以基因IV型Hert/33为骨架进行基因Ⅶ型JS5/05株M、F和HN基因的单独替换以及F和HN双替换，M、F和HN三替换。此外还以JS5/05为骨架，同时替换了Hert/33的M、F和HN基因。结果表明，3个基因同时替换时，病毒的复6 制能力以及所造成的病理变化与亲本病毒接近。上述研究结果表明M、F和HN3者共同决定了病毒致病变能力的强弱。Dortmans等（2011）在对鸽源毒株进行传代时发现，AV324毒株在传至第3和第5代时，病毒的ICPI值明显增加，测序发现在L基因和P基因上依次出现了3处点突变。为了验证这些点突变是否与毒力有关，研究者构建了3个cDNA克隆，Herts/33的NP、P和L基因被同时替换成了原始AV324毒株的相应基因。此外用P和L发生点突变的基因替换Herts/33亲本株的相应基因。通过定量检测发现，P和L的点突变使早期病毒基因复制成指数倍增加。体外复制试验表明，这3处突变使病毒聚合酶复合物的活性增强。病毒一旦拥有这些突变后，在鸡体内的病毒载量迅速上升。这说明病毒的毒力和聚合酶有关。Paldurai等（2014）用强毒GBTexas和中强毒BeaudetteC进行基因的单一及组合替换。这2个毒株间核苷酸相似性高达98%以上，裂解位点序列同为RRQKRF，但毒力却存在明显差异，这说明其他位点与病毒毒力有关。研究发现，将BeaudetteC的L基因单独或者NP、P和L基因同时替换后，能使他具备与强毒株GBTexas相似的特性。反之，将GBTexas的L基因单独或者NP、P和L基因同时替换后，也能获得中强毒BeaudetteC相似的特性。然而在进行F基因单替换，F、HN基因双替换，M、F和HN三替换时，结果却有些不同。单独替换F基因可以使强毒株ICPI值最接近中强毒，反之亦然。当进行双替换或者三替换时，尽管ICPI值有明显差异，但并不如单替换差异显著。GBTexas和BeaudetteC的F蛋白裂解位点完全一致，由此可见F蛋白的其他位点对毒力的影响也是显著的，而HN蛋白的影响却较小。Rout等（2008）利用LaSota和BeaudetteC的cDNA克隆，通过将二者的NP、P和L基因相互单独替换，以及将二者的NP和P基因进行双替换。结果表明，NP和P基因无论是单替换还是双替换的重组病毒和亲本毒株的致病力均较为接近。但将BeaudetteC的L基因替换成LaSota株的L基因后，病毒的复制滴度升高了100倍，同时其ICPI和IVPI值均明显升高，并且能致死6周龄SPF鸡。尽管LaSota株的L基因增强BeaudetteC致病力的机制不清楚，但高复制滴度可能是病毒致病力增强的原因之一。由于新城疫病毒V蛋白含有1个锌指结构，因此引发了不少关注。Mebatsion等（2001）在Clone-30反向遗传操作平台的基础上，利用PCR技术分别使新城疫病毒P基因编辑保守序列UUUUUCCC突变为UUCUUCCC，缺失为CC（NDV△6）或者在编辑位点后突变出终止密码子终止V蛋白翻译（NDV-Vstop）。由于利用弱毒并7 未能成功拯救突变的NDV-Vstop和NDV-△6，因此研究者将Clone-30的裂解位点从GRQGRL突变成RRQKRF，并利用V蛋白羧基端肽段的抗体来进行检测。结果表明缺失编辑位点或者终止V蛋白翻译后，RNA编辑功能完全丧失。病毒仅能在Vero细胞和6日龄鸡胚中以极低的滴度复制，与亲本株相比，他们的滴度低了600~5000倍。编辑位点突变的拯救毒滴度比亲本毒低了近100倍，且对8日龄以上的鸡胚丧失了致死能力。此外研究者通过胚内接种研究了18日龄胚内接种免疫的可能性，尽管孵化后小鸡血清的HI抗体仅约4log2，但其免疫保护率可达100%。该研究结果表明V蛋白对NDV的复制是必需的，并且也是影响毒力的1个因素。Park等（2003）研究发现，缺失V蛋白的B1重组病毒在细胞上的滴度下降明显，可达100倍以上，鸡胚中更高达10000倍。但是在流感病毒NS1蛋白的帮助下，病毒在CEF中又能够恢复到较高的滴度，而人源细胞中病毒滴度的恢复不明显。这说明V蛋白不仅是NDV的毒力因子之一，对干扰素的拮抗作用还具有宿主特异性。Huang等（2003）也以BeaudetteC为骨架，通过突变出终止密码子构建了rBC/V-stop质粒，使V蛋白不表达，同时通过将P基因编辑区UUUUUCCC突变为UUCUUUCC构建了rBC/Edit质粒，使得V和W蛋白均不表达。在DF1细胞中，rBC/V-Stop和rBC/Edit的滴度显著低于亲本毒的滴度（100倍），但在不产生干扰素的Vero细胞中，3者的滴度接近。这2个突变株的MDT值从亲本毒的62h增加至大于90h，ICPI值则从1.58降低到0.7左右，IVPI值更是从1.45降低到0左右。这说明V蛋白是病毒毒力的影响因素之一。Qiu等（2016）通过对ZJ1的V蛋白CTD区域进行缺失，结果发现缺失V蛋白对基因Ⅶ型重组病毒的增殖并没有太大影响，这和之前拯救的V蛋白缺失重组毒的特性有较大差别（Mebatsionetal,2001）。重要的是，该研究证实缺失V蛋白的ZJ1株丧失了降解磷酸化STAT1的能力，感染细胞后，干扰素反应基因的表达升高。最终证实V蛋白的CTD区域能够高效降解磷酸化的STAT1以阻断α干扰素信号。除了上述基因以外，糖基化位点以及非编码区也会影响病毒的毒力。Panda等（2004b）以LaSota为骨架，替换BeaudetteC的F基因后，重组病毒的ICPI值比亲本毒BeaudetteC株要低，这说明还有其他因素影响病毒的毒力。同时，Panda等（2004a）将BeaudetteC株HN蛋白上的119、341、433和481位糖基化位点采用不同手段依次或同时缺失。结果显示，任何糖基化的缺失都会影响病毒的毒力。而481位单缺失、119位和341位双缺失会严重延缓病毒的复制。失去糖基化位点不会影响病毒的受体识别能力，但是其NA活性会受到严重影响。481位单缺失的融合能力也8 出现较大地降低。相反，119位和341位双缺失却使融合能力显著升高。这些影响可能是由于糖基化位点对抗原位点的遮盖引起的。F蛋白糖基化位点同样影响病毒的复制。Samal等（2012）通过对BC株F蛋白85、191、366、447、471和541位糖基化位点进行单位点突变，同时还对191位和471位糖基化位点进行N→Q双突变。所有拯救的单位点突变病毒对融合能力没有影响，但双突变病毒的融合能力提高了12倍，繁殖滴度提高了100倍。这些特性使得病毒复制能力增强，相应地，由于病毒的ICPI值显著增加，出现对鸡胚和鸡的致病力增强作用。除了上述研究手法外，Sun等（2012）利用N-乙酰葡糖胺基转移酶缺陷型细胞Lec1来研究N糖基化类型对病毒生物学特性的影响。研究表明，高甘露糖型N-糖基化对病毒的融合至关重要，如果被抑制，病毒的融合和感染水平将出现大幅度降低。其他2种N-糖基化类型（复合型和杂合型）对病毒的融合和感染不是必需的。Yan等（2008）通过增、减BeaudetteC株F和HN以及HN和L之间的间隔序列，结果表明增加间隔区的长度不会影响病毒的拯救和滴度，但是却能使病毒蚀斑减小，下调了下游基因的转录。同时改变间隔序列长度会致弱病毒，且致弱程度和插入间隔序列长度呈正相关。人为减少间隔区序列同样会致弱病毒，与增加序列长度的结果一样，所有突变毒株的ICPI和IVPI值均降低。因此，间隔序列也与病毒毒力有关。随后Yan等（2009）发现，UTR对新城疫病毒的复制和毒力也较为重要。通过删除BeaudetteC株HN基因的5’和3’UTR发现，病毒在体外的复制不会受到明显影响，但完全删除5’UTR以后，HN基因mRNA的转录量出现降低，且病毒粒子表面HN蛋白的含量减少。这些突变毒株ICPI值的降低导致他们在SPF鸡体内病毒载量的降低。Liu等（2014）研究发现，基因组15192nt长度的NA1株缺失其NP基因和P基因之间UTR序列中的6个插入序列（通常为TCCCAC）后，对病毒体外复制能力影响有限，但能够使其ICPI值略微下降，因此可能与毒力有关。NDV反向遗传研究系统的建立促进了NDV致病机制的研究。上述研究通过将NDV的各个基因编码区进行点突变、基因片段替换、缺失等已初步确定了各个基因与病毒复制和毒力之间的关系。以不同病毒骨架进行替换，获得的结果往往不尽相同，这可能与骨架病毒与替换基因之间的差异有关，尤其是强弱毒株间序列差异较大，并且重组病毒并非自然界存在的病毒。利用2株序列相似但致病性差异较大的毒株进行毒力研究的方法在禽流感病毒致病性研究领域较为常见。然而NDV的致病机制尚有9 许多未解之谜，除了研究病毒基因的差异外，宿主也是一个重要的方面。只有全面了解病毒与宿主之间的相互作用关系才能更清晰地呈现NDV的致病机制。1.1.4新城疫病毒活载体的研究进展活病毒载体疫苗通常能够使外源基因高效表达，并能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫，因此其市场前景广阔。目前家禽疫苗研究中常用的病毒载体有鸡痘病毒、火鸡疱疹病毒、马立克病毒、腺病毒和逆转录病毒家族成员。但是这些活载体的安全性、效率和成本仍然需要进一步研究。由于新城疫病毒自身表达的蛋白少，并且其血清型单一，免疫效果确实，更为重要地是新城疫病毒只在感染细胞的胞浆中复制，因此不会整合到宿主的基因组中。此外，新城疫病毒几乎不存在重组的可能，稳定安全，因此作为活载体的优势明显（Huangetal,2003；Nakayaetal,2001；Duanetal,2015）。为了验证外源基因的表达情况，Krishnamurthy等（2000）拯救出中等毒力的BeaudetteC株，同时还在HN和L基因之间插入了氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicolacetyltransferase，CAT）基因并使之成功表达。该研究同样使用T7表达系统，但是在病毒基因组Leader序列前面加入了3个额外的G。该研究利用HEp-2细胞来进行共转染，转染前用重组痘病毒MVA/T7进行处理。该病毒对HEp-2细胞具有严格的宿主特异性，在禽源细胞和鸡胚内不能增殖，不产生CPE，因此不会像FPV-T7一样与拯救的新城疫病毒竞争，从而解决了FPV-T7降低病毒拯救率的问题。该研究利用pBR322/dr质粒作为载体克隆全长cDNA，同时在F和HN的间隔区通过突变设计了1个MluI酶切位点，在HN和L的间隔区设计了1个AgeI酶切位点作为拯救重组病毒的分子标签。所拯救的重组病毒有5处出现核苷酸突变，其中3处导致了氨基酸突变。因此其在12~18h的生长滴度较亲本毒低了10倍，不过30h以后二者的差异不明显。然而，插入外源CAT基因后，重组病毒的蚀斑减小，复制能力减弱，病毒滴度下降超过100倍。此外，还出现了鸡胚平均死亡时间（Meandeathtime，MDT）增加以及1日龄鸡脑内致病指数（Intracerebralpathogenicityindex，ICPI）降低等现象。因此插入外源基因能够导致病毒生长受阻和毒力减弱。不过经过鸡胚连续传代，外源基因的表达并不受到影响，这说明在新城疫病毒中插入的外源基因能够稳定表达，后续研究也有类似的结论。由于BeaudetteC株是中等毒力毒株，尽管可以作为载体插入外源基因，但不能作为疫苗使用。因此，与Krishnamurthy同一课题组的Huang等（2001）利用与之类似的方法将CAT基因插入到LaSota疫苗株中，并且将CAT基因的位置放在了NP基因前面。这就意味着CAT基因在重组病毒中最先且最多地10 被转录，这样大大增加了外源基因的表达量。该研究结果证实，rLaSota/CAT感染细胞后CAT的酶活性比rBC/CAT约高11倍。不过，rLaSota/CAT比亲本毒株LaSota的滴度低10~100倍，同样说明插入外源基因的重组病毒确实会出现生长受阻的现象。随后，Engel-Herbert等（2003）在Clone-30反向遗传操作平台的基础上，在F和HN基因间隔区插入了GFP基因。重组病毒与亲本毒株的复制能力接近，且用表达GFP蛋白的Clone-30重组病毒感染1日龄SPF鸡后，在脑中可以检测到发绿荧光的病毒，这为重组活载体疫苗的研究奠定了基础。外源基因的插入方式和插入位点都会影响活载体的表达效果。Zhao等（2003）对外源基因的插入位点进行了详细研究。该研究以LaSota毒株作为载体，将碱性磷酸酶基因（SEAP）的表达盒分别插入NP和P、M和F、HN和L之间，此外还有基因组的5’端。结果SEAP插入到基因组5’端后表达量较低，SEAP被插入前3个位置，无论是在细胞上还是在鸡胚上都能得到高效表达且活性不受影响。但是插入到NP和P之间会影响病毒的转录和复制。从外源基因插入NDV的位置来看，其插入位置越接近NDV基因组的3’末端，蛋白表达水平越高，但这样会影响新城疫病毒mRNA的绝对含量，从而影响病毒的滴度。此后，Kim等（2010）对BeaudetteC株的6个结构基因的UTR进行了研究，将6个基因的ORF替换成GFP再将他们插入到BeaudetteC骨架病毒的P和M基因之间。由于L的3’UTR表达GFP欠佳，因此用NP的3’UTR进行了代替。为了研究下游基因的UTR对GFP的抑制作用，插入位点还换到了HN和L之间。结果发现，在M和F基因中间的UTR中插入GFP，病毒的复制不受影响，但插入基因在HN和L之间时，前期病毒滴度较低。该研究表明新城疫病毒的UTR对外源基因的表达影响不一，并且这种影响还和插入位点有关。如果想获得最大外源基因的表达，那么选择插入位点后紧随基因的UTR无疑是最佳选择。由于P和M基因之间插入外源基因的效果良好，因此许多研究都选择该位点插入外源基因进行活载体疫苗的研究和评价。Nakaya等（2001）使用pSL1180作为cDNA克隆载体，同时还在P和M基因之间利用XbaI酶切位点来插入外源基因CAT和A/WSN/33病毒的HA基因。HEp-2和A549细胞是拯救病毒时所使用的细胞系，拯救时仍然需要使用重组痘病毒MVA/T7。拯救的rNDV/B1，rNDV/B1-CAT和亲本毒9.0TCIDB1的滴度可达1050/mL，但rNDV/B1-HA的滴度却降低了20倍，同时rNDV/B1-HA的MDT值也相应增加。利用rNDV/B1-HA免疫小鼠，可以完全抵抗105.0pfu禽流感A/WSN/33病毒的攻击。这说明新城疫病毒作为载体表达外源病毒的11 保护性抗原可以使动物获得良好的免疫保护。随后，Huang等（2004）利用LaSota疫苗株为载体，构建了表达传染性囊病病毒（IBDV）变异株GLS-5VP2基因的重组病毒rLaSota/VP2。该基因的插入位点位于NP基因的前面，这正是该研究者构建rLaSota/CAT时所利用的方案。该重组病毒复制滴度略低于亲本株，但56h后仍然可以达到与亲本株接近的水平。该重组毒免疫2日龄SPF雏鸡可有效抵抗IBDV变异株及新城疫强毒GBTexas的攻击，保护率均达到100%。其免疫效果可与IBDV商品疫苗相媲美。最近Kanabagatte等（2014）以LaSota为载体，在P和M基因之间分别插入传染性喉气管炎病毒的gB、gC和gD基因。结果显示，插入gC基因后，病毒滴度至少下降了100倍。单独使用插入gC的重组病毒免疫后仅能产生部分保护，这和gB、gC和gD3个重组病毒同时使用时效果相当。而单独使用gD的重组病毒免疫后就能产生100%的保护，gB重组病毒则无保护作用。这些现象可能与gD的表达情况有关。Veits等（2008）评价了包括H5N2、H5N9、H5N3灭活疫苗和2个表达HA基因的活载体疫苗（MVA-H5和NDV-H5）在内的几种H5亚型高致病性禽流感疫苗在试验条件下的保护效力，结果重组活载体疫苗NDV-H5组的免疫效果与效果最好的灭活疫苗组相当。Schroer等（2011）以NDVClone30株为骨架拯救出1株表达H6亚型低致病性AIVHA基因的重组病毒NDV-H6，并评价其对3周龄SPF鸡和火鸡的保护效力。试验表明：1次免疫就可以对3周龄SPF鸡起到很好的保护作用，并可有效防止AIV的排毒。而3周龄火鸡1次免疫并不能产生较好的免疫保护效果，对排毒的抑制作用也不明显。这提示受母源抗体的影响，禽流感-新城疫重组活载体疫苗1次免疫可能并不能提供充分的免疫保护。DiNapoli等（2010）研制出表达H5N1禽流感病毒血凝素蛋白的重组弱毒疫苗NDV/HA，并直接通过呼吸道接种非洲绿猴。该疫苗可降低H5N1感染的发病率和死亡率，并可诱导呼吸道局部产生大量的黏膜免疫球蛋白，排毒少，安全性好，可以在禽流感爆发或流行中减少或防止病毒传播，降低向人类传播的风险。NDV/HA已成为人类高致病性禽流感疫苗临床评价的候选疫苗。2013年，当H7N9禽流感病毒感染人事件发生以后，H7亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗被迅速研制出来，并被证明可以诱导小鼠抵抗H7N9流感病毒（Goffetal,2013）。新城疫重组禽流感疫苗研制历史中，尤其值得关注的是，Ge等（2007）将1株H5N1禽流感病毒的HA基因插入LaSota株基因组，重组病毒接种鸡能够同时抵抗速发型NDV以及同源和异源禽流感病毒的攻击，接种BALB/c小鼠也能够激发抗流感保护性免疫。该重组疫苗已于2005年12月23日在中国正式12 批准生产，2006年广泛推广使用。在其他疾病，如狂犬病（Geetal,2007），诺如病毒（Kimetal,2015）等疫苗研究领域，重组新城疫活载体的研制也取得了成功。共表达诺如病毒VP1和VP2的重组病毒诱导的细胞免疫和粘膜免疫水平显著高于VLP，这说明重组新城疫病毒所具备的优势较明显。Liu等（2015）最近也证实以LaSota为载体的重组H5和H7亚型禽流感的活疫苗能够提供100%的保护，而杆状病毒表达的H7蛋白则不能起到保护作用。此外，DiNapoli等（2007）还将SARS-CoV的S和S1蛋白分别插入BeaudetteC和LaSotaF蛋白裂解位点序列突变为强毒株的P和M间隔区中，并获得了重组病毒。研究表明这些重组病毒在DF1细胞上的滴度和亲本毒接近，但在Vero和A549细胞上，他们的滴度约降低了10~100倍。不过他们的MDT值差别不大。动物试验表明NDV-BC/S1免疫后不能对SARS-CoV起到保护作用，但表达S基因的重组病毒在灵长类动物中具有较好的免疫原性和保护性。最近Khattar等（2015）将艾滋病病毒HIV-1的Env和Gag基因单独分别插入到LaSota株的P和M基因之间以及HN和L基因之间，此外还单独将这2个基因按不同顺序插入到P和M基因之间。结果显示，插入到P和M基因之间的2个组合均能产生更高的细胞免疫和体液免疫，对痘病毒重组HIV攻击的保护效果也更好。新城疫病毒作为载体表达外源基因，实现一针防两病，或者作为载体防控人类的烈性传染病均取得了良好的成效。然而外源基因的表达效率关系到疫苗的效果。Kim等（2014）在载体改造方面取得了良好的进展。该研究以BeaudetteC为骨架，通过裂解位点突变将该中强毒改造成弱毒（112GRQGRL117），并在此基础上，将F蛋白的271~330、275~330或者331~390位氨基酸分别与强毒株AKO进行了相应的替换。随后在P和M基因之间插入H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建了rLaSota/HA以及BeaudetteC为骨架的基因替换载体。此外，还构建了1个同时替换裂解位点和LaSota株HN基因的重组禽流感HA基因的载体。研究表明，这些重组病毒的滴度在48h时均较接近，且ICPI值均为0。这些重组病毒中271~330位替换后，HA蛋白的表面表达量可达25%，而替换为LaSota株HN后的重组毒HA蛋白的表面表达量接近35%。但表达量高并不一定免疫效果好，免疫保护试验显示271~330位替换后的重组病毒能够提供100%的保护，无论是免疫后1周龄还是3周龄的鸡，攻毒后均不出现排毒。通过对载体的改造，不仅能够增强重组载体的复制和表达效率还能提高的保护率。由此说明，新城疫病毒活载体疫苗仍然存在丰富的改造空间。13 随着基因Ⅶ型NDV在东南亚国家的流行，一些重组基因Ⅶ型疫苗株被开发出来。Cho等（2008）利用LaSota为骨架，将基因Ⅶd亚型KBNP-4152株的F基因和HN基因一起进行了替换。其F蛋白裂解位点也突变为112GRQAR116，而HN蛋白被突变成577个氨基酸。研究显示，突变株MDT大于168h，ICPI低至0。无论是活苗还是灭活苗，其免疫效果均良好，对不同基因型强毒的攻击保护率可达100%。近期Roohani等（2015）进一步用基因Ⅷ型强毒攻击发现，该疫苗株仍然能够提供100%的保护，且不排毒，而LaSota疫苗株则不能提供完全保护，其排毒量也较高。Xiao等（2012）构建了印度尼西亚基因Ⅶ型分离株Banjarmasin/010/10（Ban/010）的cDNA克隆，并将其裂解位点从112RRQKRF117替换成112GRQGRL117。其构建全长克隆所使用的载体仍然是pBR322/dr，转染细胞是MVA/T7感染后的HEp-2。拯救致弱重组病毒的MDT大于120h，ICPI值从1.88降至0。该重组病毒感染1日龄SPF鸡后，在第4和第6d时肺脏、气管、脾脏、胰腺以及口腔拭子和粪便拭子中均能够检出，第8d时肺脏、气管、脾脏和口腔拭子中仍然能够检出。而B1和LaSota疫苗株只能在第4和第6d时被检出。这说明致弱毒株即使具备和弱毒疫苗株相似的生物学特性，在动物体内仍然保留着良好的复制能力。当鸡的日龄增加到2周时，仅第4d能够在上述器官和拭子中全部检测出重组病毒。第6d时，仅气管、脾脏和口腔拭子中仍然能够检出，而疫苗株只有个别器官和拭子中能够检出。这说明随着日龄的增加，重组病毒在鸡体内的复制时间缩短。在免疫B1、LaSota和重组病毒Ban/AF21d后，用亲本毒Ban/010和强毒GBTexas攻击均能提供良好保护。但是重组病毒Ban/AF免疫后，强毒攻击时，免疫鸡不排毒。这说明致弱重组病毒是良好的疫苗候选。当国外新城疫反向遗传操作系统研究如火如荼地开展之际，我国科学家也进行了积极地探索。Liu等（2007）利用TVT7R(0,0)首次成功拯救出ZJ1，并以此为骨架，在P和M基因间隔区利用ApaI酶切位点插入GFP基因。该拯救系统同样使用T7系统，并且加入了3个额外的G。该研究还发现，携带GFP基因的重组病毒在气管和肾脏中表达量高。随后，Hu等（2009）在此基础上，通过F蛋白裂解位点序列由强至弱的突变，获得了致弱的ZJ1重组病毒，同时利用高HA效价的JS5/05的HN基因替换ZJ1的HN基因，获得了HA效价可达9log2，EID9.0/mL的重组。50达10重组病毒无论是活苗还是灭活疫苗都能使鸡和鹅抵抗基因Ⅶ型强毒株攻击，并减少强毒的排毒。此后，Hu等（2011）构建了JS5/05的cDNA克隆，通过F蛋白裂解位点序列的致弱获得了高繁殖滴度的疫苗候选株，制备成灭活疫苗后，可显著降低基因Ⅶ14 型强毒攻击后造成的排毒。2012年，Li等将红色荧光蛋白（RFP）插入到LaSota疫苗株中，结果插入外源基因的重组病毒和亲本毒的滴度较接近。不过该cDNA克隆是在pLS/aMVP-CG的骨架上进行改造的（Huetal,2011）。骨架LaSota病毒是用改造后的pBluescript载体构建的，该研究过程中，基因克隆方法采用了In-FusionPCR技术，外源基因插入位点在F和HN基因之间。2014年，Chai等利用pBR-THT作为载体获得了具有溶瘤能力D90株的cDNA克隆，其构建方法也是在基因组前面加入额外的2个G，利用T7系统进行病毒拯救。该研究拯救插入EGFP基因的重组病毒和亲本毒株间的滴度没有明显差异，并且重组同样具有良好的溶瘤活性。此后，Wang等（2015）利用NA1为载体，通过突变F蛋白裂解位点序列并在P和M基因间插入小鹅瘟病毒的VP3基因，通过免疫发现，病毒对雏鹅是安全性良好。免疫后小鹅瘟病毒的中和抗体效价可达1：64，新城疫病毒的中和抗体效价可达1：1024，该研究在一针防两病方面取得了良好的进展。Zhang等（2016）在LaSota株P和M基因间插入VSV的G蛋白，重组病毒免疫小鼠后能够产生高水平的中和抗体，并且还能通过母源抗体传递给乳鼠，提供一定程度的保护。研究发现，重组犬瘟热病毒H基因的LaSota株比重组犬瘟热病毒F基因的LaSota株免疫效果好，尽管二者都能产生较高水平的抗体，但重组犬瘟热病毒F基因的LaSota株不能提供100%的保护，而重组犬瘟热病毒H基因的LaSota株则可以（Geetal,2015）。这说明重组病毒表达基因的选择至关重要。利用反向遗传学技术改造出的重组病毒，可以为新城疫的有效防控提供重要保障。尤其是通过改造，制备出标记疫苗以便区分疫苗免疫动物和自然感染动物的意义重大。Peeters等（2001）利用禽副黏病毒4型HN蛋白的球头区结构域替换NDV病毒的相应部位，这样在诱导良好免疫的同时还能够进行鉴别诊断。Mebatsion等（2002）研究发现，以Clone-30为骨架，将其NP蛋白443~460位残基缺失（该片断447~455包含1个B细胞免疫优势表位），并成功拯救出与亲本毒复制能力相当的重组病毒。同时，在缺失位点，插入1个鼠肝炎病毒S2糖蛋白的B细胞表位以实现鉴别诊断。该研究表明，上述表位的缺失和替换不会影响病毒复制。通过该方法制造的标记疫苗，可以用来鉴别免疫动物和感染动物，这一思路将有助于新城疫病毒的根除计划。此外，基于物流运输及基层使用需要，Wen等（2016）成功研制出高滴度的耐热疫苗。方法是将耐热毒株TS09-C和LaSota株的基因进行替换。研究者首先将NP、P和M，F和HN以及L基因进行了毒株间互换。随后又将F和HN基因进行了单独替换。结果15 发现HN是毒株耐热与否的决定因素。若将TS09-C的HN基因替换至LaSota株，能够使其具备耐热特性，并具备良好的免疫效果，这为耐热重组疫苗的研发提供了新思路。此外，一些研究者通过以NDV作为载体，表达细胞因子，在新城疫免疫效果提升、抗肿瘤治疗等方面也起到积极探索的作用。Susta等（2013）利用ZJ1反向遗传操作系统，将γ干扰素（IFN-γ）插入到M和F基因之间，所使用的克隆方法与Liu（2007）所描述的方法一致。所拯救的重组病毒的IFN-γ得到了良好表达，病毒滴度和表达EGFP的重组毒接近，仅比亲本毒低10倍左右，但rZJ1-IFNγ的ICPI值有所降低。研究发现，表达IFNγ能够降低重组病毒的毒力，尤其可能在抑制病毒复制和病毒造成的损伤方面。由于IFNγ的表达和病毒复制是同步的，因此IFNγ的效果完全取决于病毒复制时早期产生IFNγ的量。随后，Susta等（2015）又将鸡的IL2基因插入到ZJ1中。结果发现，rZJ1-IL2感染鸡5d后，体内病毒滴度较亲本株低100倍，同时病理损伤程度也有所减轻。但是插入IL2并没有对病毒的毒力产生较大的影响，因此其效果有待在弱毒株中验证。Ren等（2015）以Clone30为骨架，插入IL12和（或）IL2基因并拯救出单表达或双表达的重组病毒。将重组病毒用于小鼠肝脏肿瘤治疗时发现，双表达的重组病毒效果最佳，肿瘤大小只有对照组的1/8。同时，γ干扰素的表达量也是最高的，因此能够增加小鼠的存活率。上述研究表明，新城疫病毒不仅能够改造成高效疫苗，而且还能够作为载体高效表达外源基因，为其他疫病的防控提供重要手段。以新城疫为活载体的重组疫苗能够产生良好的细胞免疫和体液免疫，解决了部分疾病只能使用灭活疫苗导致细胞免疫水平低下的缺陷。因此，新城疫病毒活载体疫苗的前景广阔。1.2研究目的及意义基因Ⅶ型是我国近年来禽群中新城疫病毒主要流行的基因型，尽管目前基因Ⅶ型重组新城疫灭活疫苗（A-Ⅶ株）已经上市，但市场上对该基因型的疫苗需求大。同时由于基因Ⅶ型毒力强，具有多基因决定毒力的特点，因此也是基础研究的一个重要素材。加之对深入研究基因Ⅶ型NDV致病机制的要求，建立基因Ⅶ型反向遗传操作平台是科技创新的重要基础。为此，本研究通过选择可靠的基因操作系统，经过一系列验证以期建立GM株的反向遗传操作平台，为疫苗和致病性的研究奠定基础。随后，通过融合PCR技术进行突变，拯救获得2种不同F蛋白裂解位点突变的重组病毒，通过致病指数的差异，明确112位和115位非碱性氨基酸差异对毒力的影响。随后评16 价致弱重组毒株的安全性，并利用重组病毒分别制备成灭活疫苗和活疫苗，通过与商品化LaSota疫苗的进行免疫攻毒保护试验的对比，明确基因Ⅶ型疫苗的优势。最后，利用致弱毒株为骨架，将外源基因EGFP和H5亚型禽流感病毒HA基因插入到致弱的重组病毒中，进行活载体疫苗研制的探索，以期制备出安全、高效和廉价的基因工程疫苗。1.3研究技术路线1.3.1利用蚀斑法对GM株进行了3轮病毒纯化，高保真酶扩增获得基因组序列。1.3.2利用TVT质粒分段克隆病毒基因组，并通过1个同义突变引入AscI酶切位点（ggtgcgcc→ggcgcgcc）引入分子标签以示区别。1.3.3构建pCI-NP、pCI-P和pCI-L辅助质粒并通过微基因组验证拯救系统的可靠性。1.3.4拯救重组病毒rGM，连续传代后测定病毒分子标签和突变位点的稳定性，测定其致病指数、体外生长曲线。1.3.5融合PCR技术将F蛋白GM裂解位点突变为112GRQGRL117和112ERQERL117。测定致弱重组病毒的致病指数，分析112位和115位非碱性氨基酸差异对毒力的影响。1.3.6通过致弱重组病毒灭活疫苗和活疫苗免疫与相应商品LaSota疫苗的免疫保护比较试验，评价疫苗抗体产生水平及免疫保护能力。1.3.7构建表达EGFP基因和禽流感病毒HA基因的活载体疫苗以验证插入外源基因的表达能力，进行重组活载体疫苗研究的探索。17 第2章新城疫病毒GM株全长cDNA克隆的构建2.1引言近年来许多研究表明，欧洲、亚洲和非洲等地区广泛流行基因Ⅶ型ND。由于传统疫苗株LaSota、B1和V4株和流行毒株之间序列相似性差异较大（Milleretal,2007），并且同一基因型的疫苗能够提供更好的保护，尤其是在降低排毒率方面作用明显（Milleretal,2009）。因此开发用于预防我国当前流行的基因Ⅶ型NDV的疫苗将有助于减少临床发病，降低“非典型”新城疫的发生，减少ND疫苗的免疫次数，控制养殖成本，增加养殖效益。本研究利用鸡源新城疫GM株作为研究对象，通过构建其基因组全长cDNA克隆，完成基因Ⅶ型NDV反向遗传操作平台的建立，为新型疫苗的研究奠定基础。2.2材料与方法2.2.1毒株、载体和细胞GM株（GenBankaccessionnumber：DQ486859）分离自佛山市高明区发病鸡群，分离时间为2003年，由华南农业大学兽医学院传染病学教研室保存。MVA/T7由华南农业大学兽医学院传染病教研室樊惠英教授惠赠。BSR-T7/5细胞系由哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。克隆载体TVT7R（0.0）由AlabamaStateUniversity吴红专教授惠赠。DF-1细胞由华南农业大兽医学院传染病教研室保存。2.2.2主要试剂与耗材新城疫、H5和H9亚型禽流感（Avianinfluenzavirus，AIV）阳性血清为哈尔滨维科生物技术开发公司产品。SuperscriptIIItranscriptase为Invitrogen公司产品。pGEM-T和pCI-neo为Promega公司产品。Q5High-FidelityDNAPolymerase为NewEnglandBiolabs公司产品。ExTaqDNA聚合酶、随机引物（Random6mers）、低熔点琼脂粉、各种规格DNAmarker，DNAA-TailingKit以及MiniBESTViralRNA/DNAExtractionkit为Takara（大连）公司产品。质粒提取试剂盒QiagenQIAprepSpinMiniprepKit为Qiagen公司产品，DH5α感受态，普通质粒提取以及凝胶回收试剂盒为Tiagen公司产品。DMEM培养基，胎牛血清均为Gibco公司产品。其他化学试剂均为国产分析纯产品。1%（V/V）红细胞悬液取自健康公鸡新鲜外周血，以灭菌PBS缓冲液洗涤，离心后制备而成，供血凝、血凝抑制试验使用。18 9～11日龄SPF（SpecificPathogenFree）鸡胚由广东永顺生物制品股份有限公司提供；1日龄SPF鸡由大华农保健品股份有限公司实验动物中心提供。2.2.3主要仪器生化培养箱（广东省医疗机械厂LRH-250Ⅱ），高速冷冻离心机（Eppendorf5804R），Mastercyclergradient核酸扩增仪（Eppendorf公司），GDS8000PC凝胶成像及分析系统（英国UVP公司），DNA凝胶电泳系统（Bio-rad），Elix100纯净水装置（Millipore），CO2细胞培养箱（ThermoScientific）。2.2.4主要生物学软件序列分析软件为Lasergene7.1，引物设计软件为Oligo6.0，酶切位点分析软件为NEBcutter。2.2.5血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）取GM种毒，经10日龄SPF鸡胚接种后，收获24~60h以内的死亡鸡胚。并按常规微量法进行HA和HI试验，具体操作步骤参照《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）。收获的尿囊液既出现HA，又能被新城疫病毒阳性血清特异性抑制，说明尿囊液中含新城疫病毒。H5和H9亚型禽流感病毒阳性血清不能抑制该尿囊液的血凝活性，则说明尿囊液中不含这2个亚型的禽流感病毒。2.2.6GM株的蚀斑纯化按照孙敏华（2008）描述的方法制备鸡胚成纤维细胞（CEF）后，将细胞接种到6孔板中，37℃培养24h后，待细胞长成致密单层后进行蚀斑纯化。接种的稀释度选择10-4~10-8，留1孔作为正常细胞对照。病毒孵育1h后，以含1%血清的低熔点营养琼脂覆盖，37℃培养箱中倒置培养，逐日观察蚀斑情况。收获单个病毒蚀斑后，再进行10-1~10-5稀释，再次按照上述步骤纯化2次，并挑选生长速度快的大个蚀斑作为纯化后的种毒。随后接种10日龄SPF鸡胚，0.1mL/枚。收获后的病毒分装后置-80℃冰箱保存。2.2.7GM株传代后病毒的滴度将纯化后的GM毒株稀释1000倍，接种10日龄SPF鸡胚3枚，0.1mL/枚。收获死亡鸡胚尿囊液后，再次按照上述方法进行传代5代。记录每个代次死亡鸡胚的血凝效价。19 2.2.8GM株基因片段的扩增及序列测定参考GenBank中新城疫病毒序列，设计了8对引物（表2.1）用于扩增纯化后GM株的基因序列。病毒核酸参照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionkit中的方法进行提取，具体步骤如下：①取200μL病毒尿囊液，加入200μLSolutionA，振荡混匀，静置5min。②加入75μLSolutionB，振荡混匀，12000r/min离心5min。③将上清转移至新的2mLCollectionTube中，加入300μL异丙醇（含1%冰乙酸），上下倒置6~8次，混合均匀。④将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12000r/min离心2min，弃滤液。⑤将500μL的RinseA加入至SpinColumn中，12000r/min离心1min，弃滤液。⑥将700μL的RinseB加入至SpinColumn中，12000r/min离心1min，弃滤液。⑦重复操作步骤6。⑧将SpinColumn安置于CollectionTube上，12000r/min离心2min。⑨将SpinColumn安置于新的1.5mLRNasefreecollectiontube上，在SpinColumn膜的中央处加入30～50μL的Elutionbuffer，室温静置1min。12000r/min离心2min洗脱DNA/RNA。获得病毒核酸后，利用Invitrogen公司的SuperscriptIIItranscriptase进行反转录，待反应体系全部加入后，先25℃作用5min，随后55℃水浴60min进行反转录，获得的cDNA用于随后的PCR反应。反转录具体反应体系如下：组分体积病毒RNA12μLdNTPs（10mM）1μL5×First-StrandBuffer4μL0.1MDTT1μL随机引物（Random6mers）1μLSuperScriptIII1μLPCR体系为50µL。反应条件为：98℃预变性2min，然后按以下参数（变性：98℃5sec；退火：5610℃sec；延伸：681℃min）进行35个循环，循环结束后68℃延伸10min。同时以水作为阴性对照。所扩增的阳性片断直接送Invitrogen公司进行测序。反应体系如下：20 组分体积5×Q5ReactionBuffer10μL5×Q5HighGCEnhancer10μLdNTPs(10mM)1μLForwardPrimer(10µM)2.5μLReversePrimer(10µM)2.5μLQ5High-FidelityDNAPolymerase0.5μLNuclease-FreeWater21.5μL模板2μL表2.1扩增GM株基因组引物序列Table2.1PrimersusedforgenomeamplificationofGMstrain片断引物名称片段大小(bp)引物序列(5’-3’)名称PrimerAmplifiedfragmentPrimersequences(5’-3’)FragmentnamelengthNP1ACCAAACAGAGAATCBGTRAGDTAC2450NPNP2437CCTYCCRTTGTCCATGATATGCTP2220TCARGACCGGAGCAAGCARCT2103PP4303TCAGCRGTCACTGCGACAGCF4225CAGGTDGCYAAGATACTCTGGAG2136FF6331GGCTCCTCTKACCGTTCTACHN6178CCTMGATCAGATGAGAGC2265HNHN8426TGTGACTCTGGTAGGATL8091CGTTCCBTTAYTAGTTGAGAT2245L1L10317CTCCAGTTAAGACARTACTL10245CAAACCGYAATCATGATC2145L2L12371TCTTGGTTGTTGTCATTGGL12258TTCACATATCCAATGATTC1405L3L13644TGAGATRCCTTATACCAAGL13514GATCTAAGTGCYCCAGCAAGGT1678L4L15192ACCAAACARAGATTTGGTGAATB=C/G/T；D=A/G/T；K=G/T；M=A/C；R=A/G；Y=C/T。2.2.9GM株的分子进化分析为了明确基因Ⅶ型GM株的基因亚型，利用MegAlign软件的ClustalV方法对2.2.8中扩增获得的F基因ORF片断与30株不同基因亚型的基因Ⅶ型毒株的序列进行核苷酸水平的进化分析。2.2.10GM株基因及TVT载体单一酶切位点分析经序列测定后，利用NEBcutter进行GM株基因组序列单一酶切位点分析，同时对TVT7R（0.0）载体（以下简称TVT）（图2.1）进行单一酶切位点分析，并保证所选择的酶切位点均为粘性末端，以保证克隆效率。参考黄勇（2003）描述的方法，21 克隆基因组5’和3’两端序列选择的酶切位点为BbsI的同尾酶BsmBI，且保证分段克隆时，两端序列中不含有BsmBI酶切位点，以保证序列能够正确克隆至载体中。图2.1TVT7R（0,0）载体图谱（黄勇，2003）Figure2.1ThemapofTVT7R（0,0）vector2.2.11GM株分子标签的选择及扩增片段分段方法通过GM株基因序列酶切位点分析，在选取单一酶切位点后，根据各片断长度选择最长的一段作为插入分子标签的最佳片断。而所选择的酶切位点必须在载体和病毒基因组上均不存在。通过筛选，最后确定引入AscI酶切位点（ggtgcgcc→ggcgcgcc），在HN基因中（GM基因组第6789位）引入1个同义突变即可实现。确定克隆策略后，利用Oligo6.0最终设计了5对引物（表2.2）。表2.2GM株全长cDNA克隆构建引物Table2.2Primersforthefull-lengthcDNAcloneconstructiona克隆顺序片引物名称序列（5’→3’）Cloning段NamePrimersequencesorderCGTCTCGTATATGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGHam1U-BsmGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCP1IACCAAACAGAGAATCTGTGAG2928L-SpeACTAGTGACAGTGTCCTTCTCCACTCCCATGTCAGG2879U-AgeTTGACCGGTGCAGCACCCCTCTGAATP2V6767L-AscGTTGGCGCGCCACATTCGCTATTGTTCTCAGTAGACCGGTCAATAGCGAATGT6774U-AgeP3GGCGCGCCTGTTCATGACIII8081L-SpeTGGACTAGTAAGGGAACGATCCTAAATT8100U-SpeCGGACTAGTTGAGATCCTCAAGGATGP4IV13030L-MluAAAACGCGTCGAGTGCAAGAGACTAAC12995U-SpeCGGACTAGTGCAGATATAGACTTCGTCGAGGP5CGGACTAGTCGTCTCTACCCACCAAACAGAGII15192L-SpeATTTGGTGAATGACa酶切位点以下划线表示，锤头状核酶以斜体表示。22 2.2.12GM株P1和P5基因片断的克隆及鉴定根据克隆策略，利用Q5High-FidelityDNAPolymerase进行PCR，扩增获得5个目的片段。由于实际克隆过程中第1个片段（对应克隆顺序为I）的扩增效率偏低，因此重新设计了引物，将该片段分成2段进行克隆。其引物为：P1/2-1817L-BstE5’-GGTGACCCGTCCTGGTCTCTGGATGTCTCTCTTC-3’；P1/2-1844U-BstE5’-GGTCACCAAGTTCTCTGTTCTCCCTTCTACCTAG-3’。先利用Ham1U-Bsm和P1/2-1817L-BstE组合进行扩增，获得的PCR产物经回收后（回收方法参考Tiagen胶回收试剂盒说明书），通过Takara公司DNAA-TailingKit加A尾后与pGEM-T载体（图2.2）进行连接，通过PCR鉴定及BamHI酶切鉴定获得了正向插入的阳性质粒pGEM-P1/2（质粒提取方法参考Tiagen质粒小提试剂盒说明书）。随后，利用P1/2-1844U-BstE和2928L-Spe组合进行扩增，获得的PCR产物同样经过加A尾后与pMD18T-simple载体连接后，经BstEII和SpeI酶切后，插入到pGEM-P1/2载体中，以获得pGEM-P1。随后，利用12995U-Spe和15192L-Spe扩增获得P5片段，经加A尾后与pGEM-T载体连接，经测序鉴定后，与pGEM-P1通过同一内切酶SpeI酶切后，将回收的P5段连接至pGEM-P1，得到pGEM-P1+P5质粒。该质粒经过酶切及测序正确后，备用。图2.2pGEM-T载体图谱（Promega）Figure2.2MapofpGEM-Tvector琼脂糖凝胶回收方法：①紫外线灯管照射下迅速割下含目的DNA的琼脂糖块，置于1.5mL离心管中；②每100mg琼脂糖加入300µLPN液，置55℃水浴10min，期间每2min颠倒混匀1次直到琼脂糖块完全溶化；23 ③待溶液温度降到室温时，将上一步的溶液移入吸附柱ColumnA中，静置1min。12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液，再将吸附柱放入收集管；④在吸附柱中间加入600µLPW液，静置1min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入收集管；⑤重复上一步骤1次；⑥12000r/min离心2min；⑦将吸附柱放入1个干净的1.5mL的离心管中，打开吸附柱上盖，室温静置1min；⑧向吸附柱膜中央加入70℃水浴预热的EB溶液30µL，静置1min，离心1min；⑨弃去吸附柱，1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA。Tiagen质粒小提方法：①取1.5mL细菌培养物，12000r/min离心1min，弃上清；②加入250µL溶液P1重悬细菌沉淀，涡旋混匀；③加入250µL溶液P2，盖紧管口，轻轻混匀；④加入350µL溶液P3，盖紧管口，温和混匀；⑤12000r/min离心10min，将上清小心地移入吸附柱中，静置1min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液，再将吸附柱放入收集管；⑥在吸附柱中间加入600µLPW液，静置1min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入收集管；⑦重复上一步骤1次；⑧12000r/min离心2min；⑨将吸附柱放入1个干净的1.5mL的离心管中，打开吸附柱上盖，室温静置1min；⑩向吸附柱膜中央加入70℃水浴预热的EB溶液50µL，静置1min，离心1min。弃去吸附柱，1.5mL离心管中的液体即为质粒。2.2.13TVT-GM全长cDNA克隆的构建及鉴定按照2.2.10中的克隆顺序，首先将pGEM-P1+P5质粒利用BsmBI酶切，回收后与BbsI酶切的TVT载体连接，获得TVT-P15质粒，经SalI和KpnI酶切鉴定正确后，进行序列测定。确认序列正确后，利用AgeI和SpeI双酶切插入P3段，获得TVT-P153质粒。待鉴定正确后，再利用SpeI和MluI双酶切插入P4段，获得24 TVT-P1534质粒。最后利用AgeI和AscI双酶切插入P2段，即可获得TVT-GM质粒（图2.3）。TVT-GM经HindIII酶切鉴定后（体系如下），利用表2.1中的引物PCR扩增各基因片段，扩增程序同2.2.8。获得的PCR产物直接进行序列测定以确认全长基因序列准确无误。图2.3TVT-GM全长质粒构建示意图Figure2.3TheschameticmapforcompletecDNAcloneconstruction组分体积TVT-GM质粒5µL10×Mbuffer1µL灭菌水3µLHindIII1µL2.2.14辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L基因的克隆及鉴定由于新城疫病毒的拯救需要辅助质粒的参与，因此辅助质粒的构建十分关键。参考葛金英（2008）论文，利用pCI载体构建真核表达载体，根据NP，P和L基因序列的酶切位点情况，设计了3对引物分别扩增对应基因。引物设计见表2.3，扩增方法同2.2.8。不过扩增L基因时，由于片断过长，因此选择直接从TVT-P1534质粒中扩增获得，延伸时间也延长到2min。所有构建的质粒都经过对应的酶切和序列测定，以确保序列的准确性。表2.3辅助质粒构建引物Table2.3Primersforhelperplasmidconstruction引物名称序列（5’→3’a）NamePrimersequencesNP-EcoR-FGGTGAATTCGCCACCATGTCGTCTGTTTTCGACGAATACNP-Sal-RATTGTCGACTCAGTACCCCCAGTCAGTGTP-EcoR-FGTTGAATTCGCCACCATGGCCACCTTTACAGATP-Sal-RATTGTCGACTCAACCATTCAGCGCAAGGCL-Nhe-FTTTTAGGCTAGCGCCACCATGGCGGGCTCCGGTL-Sal-RCTTGGTCGACTTAAGAGTCATTATTACTGTa酶切位点以下划线表示。25 2.2.15微基因组的构建及验证为了验证所构建辅助质粒的表达情况，根据新城疫基因组特征，将55nt的Leader序列和114nt的Trailer序列以及NP和L基因的部分调控序列分别进行克隆，同时克隆报告基因EGFP。克隆引物见表2.4。由于克隆Trailer序列所用的引物与15192L-Spe引物序列相似，因此直接使用引物15192L-Spe。在获得M1，M2和M3这3段扩增片段后，利用融合PCR技术（图2.4）获得微基因组并利用BsmBI酶切位点将片断克隆至TVT载体中，经测序鉴定正确后命名为TVT-mini。提取微基因组TVT-mini，pCI-NP，pCI-P和pCI-L的质粒，经Nanodrop测定质粒浓度后，转染BSR-T7/5细胞（图2.5），24~48h期间观察荧光表达情况，同时设置阴性对照组。具体步骤如下：QiagenQIAprepSpinMiniprepKit质粒小提方法：①取1.5mL细菌过夜培养物，8000r/min离心3min，弃上清；②加入250µL溶液P1重悬细菌沉淀；③加入250µL溶液P2，盖紧管口，轻轻颠倒混匀4~6次；④加入350µL溶液N3，盖紧管口，温和颠倒混匀4~6次；⑤13000r/min离心10min；⑥将上清小心地转移到QIAprepSpin吸附柱中，静置1min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液，再将吸附柱放入收集管；⑦在吸附柱中间加入750µLPE液，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入收集管；⑧12000r/min离心2min；⑨将吸附柱放入1个干净的1.5mL的离心管中，向吸附柱膜中央加入70℃水浴预热的EB溶液50µL，静置1min，离心1min。BSR-T7/5细胞培养方法：①将25mL细胞瓶中长满的BSR-T7/5细胞用无菌PBS洗涤3次；②加入0.5mL0.25%胰酶消化30~60sec，期间随时观察细胞贴壁情况，如有脱落及时终止消化；③10%血清的DMEM终止胰酶消化，按照1：2比例传代；④于37℃二氧化碳培养箱培养。转染方法：26 ①于6孔板中培养BSR-T7/5细胞，待细胞生长至80%~90%时，无菌PBS洗3次；②加入1：1000稀释的MVA-T7病毒液10µL，加入500µL培养液Opti-MEM，37℃二氧化碳培养箱孵育1h；③孵育期间，取500µLOpti-MEM于1.5mL离心管中，随后按照2：2：1：1的比例分别加入TVT-mini，pCI-NP，pCI-P和pCI-L质粒，每管质粒总量为3µg，供1个孔使用；④向上述溶液中加入3µLPlusreagent，室温作用5min；⑤加入9µLLipofectamineLTX，轻轻混匀；⑥室温作用30min；⑦弃去MVA-T7感作的细胞上清，无菌PBS洗3次后；⑧加入上述转染复合物，再加入2mLOpti-MEM，37℃二氧化碳培养箱孵育18~48h。表2.4微基因组构建引物Table2.4Theprimersofminigenomeconstruction片段引物名称序列（5’→3’）FragmentNamePrimersequencesMini-1-FCGTCTCGTATATGTTAAGCGTCTGATGAGM1Mini-1-RCTTGCTCACCATAGAAGGTTCCCTCGGGTTCMini-2-FAACCTTCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGM2Mini-2-RCGATTGCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATMini-3-FTGTACAAGTAAAGGCAATCGTACACCAATM3CGGACTAGTCGTCTCTACCCACCAAACAGA15192L-SpeGATTTGGTGAATGAC图2.4融合PCR示意图Figure2.4SchematicmapoffusionPCR27 pCI-NPTVT-GM/minipCI-PpCI-L图2.5病毒拯救示意图Figure2.5Schematicmapofvirusrecovery2.2.16GM株的拯救和鉴定在pCI-NP，pCI-P和pCI-L质粒正常工作的条件下，通过QiagenQIAprepSpinMiniprepKit进行质粒小提，获得TVT-GM质粒。经浓度测定后，按照2.2.14中的方法进行转染。转染48~72h收获细胞，经反复冻融3次后，取混合液接种9日龄SPF鸡胚，每枚0.5~1mL。弃去24h内死亡的鸡胚，收获24~72h期间所有死亡和存活的鸡胚尿囊液，逐个测定血凝效价。若尿囊液有血凝活性，则收集后进行HI试验，以确定拯救病毒未被污染。所获得的具有HA活性的胚液，每1份均单独测定其HN基因序列，确定分子标签AscI酶切位点是否存在。同时进行全长序列的测定，并与亲本毒株GM进行比较，确定是否存在突变，以及突变的核苷酸位点和对应的氨基酸位点。所获得的拯救病毒命名为rGM（recombinantGM）。2.2.17拯救的重组病毒rGM的传代稳定性将测序无误的拯救毒rGM株在SPF鸡胚中连续传代15代，每次3枚鸡胚。记录每代病毒接种鸡胚后的死亡时间。每5代利用PCR扩增HN基因序列，并进行序列测定，确定分子标签AscI酶切位点是否存在回复突变。2.2.18亲本毒和重组病毒生长曲线测定常规方法制备CEF，于感染前1d以1×106.0个/mL的数量将细胞置于6孔细胞培养板中，2mL/孔。待细胞密度为80%~90%时，弃去培养基，用PBS洗2次后，将NDV强毒株GM和重组病毒rGM分别以感染复数MOI=0.001TCID50/细胞的剂量接种病毒。37℃孵育，每隔15min轻轻晃动1次，孵育1h后，弃去病毒液，PBS洗28 细胞2次，加入含2%血清的DMEM培养基作为维持液。每隔12h，收集细胞上清，-80℃冻存，在CEF细胞上测定上清TCID50，绘制曲线，每个时间点做2个重复。将收集不同时间点的细胞上清按照上述方法检测其TCID50，计算并分析结果，绘制病毒增殖曲线。TCID50（Tissuecultureinfectivedose，组织培养半数感染量）测定方法如下：将亲本毒和重组病毒用PBS进行10倍倍比稀释，取10-7~10-115个稀释度的病毒液接种到含CEF的96孔板，每个稀释度接种5孔，25μL/孔。加含2%血清的细胞维持液，培养7d后观察各孔细胞病变，同时吸取各孔上清进行HA试验，有细胞病变或HA试验阳性孔判为有病毒感染，按Reed-Muench法计算各毒株的TCID50。2.2.19亲本毒和重组病毒间接免疫荧光鉴定取GM和rGM鸡胚尿囊病毒液以DMEM进行100倍稀释，取100μL感染生长于6孔板的CEF。24h时，弃去上清液，PBS洗3次后以95%乙醇固定5min，用500μLPBST洗细胞3次。加入1:50稀释的兔抗NDV高免血清作为一抗，以相同稀释倍数的兔阴性血清为对照，37℃孵育60min后，加入1：2000稀释的荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG为二抗（Proteintech），避光37℃孵育60min后进行荧光观察。抗NDV高免血清的制备方法如下：取GM株尿囊液400mL，8000r/min离心去除杂质，收集上清再经过40000g4℃超速离心90min。随后将沉淀重悬后经过20%、40%和60%的蔗糖垫超速离心后，小心吸取40%和60%之间的白色病毒带，经过脱糖后，收获纯化的病毒。取总量为3mg病毒液与等量弗氏完全佐剂混匀，乳化30min，吸取样品滴入水中，静置1min不分散，则乳化成功，否则继续震荡至乳化完全。背部皮下多点注射免疫新西兰白兔，每次注射蛋白1.5mg/只。首免后第21d，使用弗氏不完全佐剂乳化蛋白进行二次免疫，再过28d使用弗氏不完全佐剂乳化蛋白加强免疫1次，1个月后将兔保定后，心脏采血，37℃静置1h，再4℃放置过夜析出血清，8000r/min，5min。取上清，少量分装，于-20℃保存。用HI方法检测血清中抗体效价。2.2.20rGM株ELD50，MDT和ICPI的测定及其与亲本毒株的差异拯救毒株rGM的生物学特性，尤其是ELD50，MDT和ICPI等指标是否与亲本毒株存在较大差异对于后续研究至关重要。由于后续研究以该病毒为骨架，因此拯救的重组病毒在这些指标上不能明显低于亲本毒株。具体测定方法如下：29 ELD50（鸡胚半数致死剂量）测定方法：取病毒尿囊液，用PBS进行10倍倍比稀释，取10-6~10-105个稀释度的病毒液接种9日龄SPF鸡胚，每个梯度接种5枚鸡胚，0.2mL/胚。继续置37℃孵化，弃掉24h内死亡胚，取出24h后死亡胚，用Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量。MDT测定方法：将新鲜病毒尿囊液以无菌PBS分别稀释到10-6~10-9，每个稀释度分别接种9日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1mL。剩下的病毒稀释液置于4℃，8h后再次接种9日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1mL。所有接种鸡胚继续37℃孵化，弃去24h内的死胚，以后每天照胚4次，记录胚胎死亡时间并测定HA效价。至接种后7d，取全部致死鸡胚的最大稀释度的记录，按照OIE推荐的方法计算病毒的MDT。一般强毒株MDT小于60h，中等毒力毒株MDT在60~90h之间，弱毒株MDT大于90h。ICPI测定方法：将新鲜病毒尿囊液（HA＞1：16）以无菌PBS稀释10倍，脑内注射出壳后24~40h的SPF雏鸡10只，每只0.05mL，同时设5只对照（脑内注射灭菌生理盐水0.05mL），隔离饲养，观察8d。记录正常、发病与死亡鸡的每日累计数，正常鸡积分为0、发病为1、死亡为2，最后计算ICPI值。一般强毒株ICPI大于1.6，中等毒力为0.7～1.6，弱毒株为0～0.6。通常情况下，ICPI大于0.7的毒株必须向OIE通报。ICPI=（8d累计发病数×1+8d累计死亡数×2）/8d累计观察鸡的总数2.3结果与分析2.3.1GM株的鉴定及纯化经尿囊腔接种，GM株能够导致SPF鸡胚在48~60h内死亡，胚体全身出血严重。经HA和HI试验检测，结果表明，GM株的HA效价为8log2，其血凝活性能够被新城疫标准阳性血清完全抑制。在此基础上，将病毒梯度稀释后接种CEF，通过覆盖低熔点琼脂糖凝胶，发现病毒于48~72h产生明显的CPE。去掉覆盖的琼脂糖凝胶后可以发现，板中留下明显的病毒蚀斑（图2.6），即为病毒致病变的死亡细胞。如果用0.01%中性红或结晶紫染色后观测效果尤佳（图2.7），病毒感染死亡的细胞不能着色，而活细胞能够被染成红色，因此可见白色单个斑。显微镜下死亡细胞通常破碎、崩解，所产生的蚀斑与正常细胞之间界限清楚，容易辨认（图2.8）。30 AB图2.7GM株在CEF上形成的蚀斑图2.6GM株在CEF上形成的蚀斑Figure2.6PlaquesonCEFformed（中性红染色）byGMFigure2.7PlaquesonCEFformedbyGM(stainedbyneutralred)A：正常细胞对照；B：GM感染细胞A:negativecontrol;B:GMinfected选取大小相同的蚀斑克隆，经冻融后再次10倍稀释后接种CEF，利用相似方法再经过2轮纯化后，获得了纯化的GM毒株。经9日龄SPF鸡胚接种，收获病毒液的HA效价为8log2。图2.8GM株形成的单个蚀斑形态（100×）Figure2.8SingleplaqueonCEFformedbyGM2.3.2GM株鸡胚传代后病毒的滴度经过5代传代，发现鸡胚死亡时间较为集中，多在48~60h左右全部死亡，将所有死亡鸡胚的尿囊液混合后测定，其HA效价稳定在8log2（表2.5）。31 表2.5GM纯化毒株各代次HA效价Table2.5TheHAtitersofpurifiedGMstrain毒株代次HA效价PassagesHAtiters(log2)CE18CE28CE38CE48CE582.3.3GM株基因片段的扩增及序列测定尽管该毒株之前已经在GenBank中提交了序列（DQ486859），但纯化后病毒的序列肯定有所不同。因此，通过各片段序列重叠的方式，利用8对引物对GM株进行核酸序列的分段扩增，获得了8个与预期大小相符的扩增片断（图2.9~图2.12）。所有扩增产物直接送上海生工测序后，获得了纯化后GM株序列。经与DQ486859提交序列比较发现，整个基因组中存在25处核苷酸突变，分别为：G931A、C1306T、C2193T、G3015A、G3123A、G3417A、A3724T、C3743T、C4329T、C4416T、G4502A、C5782T、T8713A、T9623C、G10023A、G10224A、G10247A、C11047T、C11857T、G12849A、T12856C、C13637T、T14077C、G14699T和G15112A。图2.9GM株NP和P片断RT-PCR扩增图2.10GM株F和HN片断RT-PCR扩增Figure2.9TheamplificationofNPandFigure2.10TheamplificationofFandPfragmentofGMHNfragmentofGMM：DL2000；1：NP片断；2：P片断M：DL2000；1：F片断；2：HN片断M:DL2000;1:NPfragment;2:PfragmentM:DL2000;1:Ffragment;2:HNfragment32 图2.11GM株L1和L2片断RT-PCR扩增图2.12GM株L3和L4片断RT-PCR扩增Figure2.11TheamplificationofL1andFigure2.12TheamplificationofL3andL2fragmentofGML4fragmentofGMM：DL2000；1：L1片断；2：L2片断M：DL2000；1，2：L3片断；3，4：L4片断M:DL2000;1:L1fragment;2:L2fragmentM:DL2000;1,2:L3fragment;3,4:L4fragment2.3.4GM株分子进化分析利用MegAlign将GM株F基因ORF序列和GenBank中30株基因Ⅶ型毒株序列进行核苷酸水平的进化分析。结果显示，GM株为基因Ⅶd亚型毒株。和我国广东、贵州、广西等地强毒株关系密切（图2.13），核苷酸相似性为95.5%~98.2%。图2.13F基因核苷酸序列分子进化树Figure2.13PhylogenetictreeofORFsequenceofFgeneGM株以红色方框表示GMwasmarkedbyredbox33 2.3.5GM株基因和TVT载体酶切位点分析在获得GM株全基因序列的前提下，将其序列用NEBcutter进行分析，结果发现，存在25个单一酶切位点（图2.14）。图2.14GM基因组单一酶切位点分布Figure2.14SinglerestrictionenzymecuttingsitedistributionofthegenomeofGM同时将TVT载体也进行分析，选择的酶切位点载体上不能出现。克隆过程初步拟定将全基因克隆分为5段，在选择酶切位点时尽量选择酶切后产生粘性末端的，同时为了便于克隆，每个片断都不能设置过长，同时克隆基因组两端序列中，恰好也不能含有BsmBI酶切位点。最终选定AgeI、MluI和SpeI作为克隆时的酶切位点。同时计划在AgeI和SpeI之间选择1个位点作为分子标签，这样也能降低克隆的难度。2.3.6GM株分子标签的选择及扩增片段分段方法为了区别拯救毒和亲本毒，一般来说，所有经过反向遗传操作拯救的病毒都会人为引入1个或者多个核苷酸的突变以示区别。为了标记拯救毒，同时便于克隆，通过仔细筛选发现，GM基因组和TVT载体上均不存在AscI酶切位点。恰好位于HN基因前段序列GGTGCGCC只需要通过T6789C突变即可变成GGCGCGCC（AscI），而且该突变不会改变该位点的氨基酸残基。由此，通过设计引物的时候进行该位点突变，GM全基因此时被分成5段克隆，长度分别为3033bp、3922bp、1337bp、4960bp和2220bp（对应片断P1~P5）。为了将GM株基因组3’和5’端序列同时引入载体中，首先通过pGEM-T载体克隆片段P1，随后再通过SpeI酶切后，连接片段P5，通过筛选获得正向插入质粒，再将片断克隆至TVT载体中，后续片段P3、P4和P234 顺序插入即可。利用高保真聚合酶，RT-PCR扩增获得了所有的片断（图2.15），各片断大小与预期条带相符。然而大片断在与pGEM-T载体连接后进行克隆时发现其效率低下，阳性克隆筛选存在一定困难。图2.15GM各基因片段RT-PCR扩增结果Figure2.15TheRT-PCRresultsofgenefragmentofGMstrainM：DL5000Marker；1：阴性对照；2~6分别为片断P1~P5M:MarkerDL5000;1:Negativecontrol;2~6:TheRT-PCRresultofP1toP52.3.7GM株P1和P5基因片断的克隆及鉴定为了解决克隆时存在的实际困难，利用BstEII酶切位点分2段克隆片段P1（大小分别约1.8kb和1.2kb）。通过RT-PCR扩增获得了这2段序列（图2.16），将1.8kb片断经过加A尾后先行克隆至pGEM-T载体中，通过转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经PCR鉴定后，获得的阳性质粒命名为pGEM-P1/2。随后利用BamHI酶切鉴定，结果发现正确质粒的酶切片断大小约3.6kb和1.2kb（图2.17），质粒同时送上海生工测序确认序列准确无误。利用pGEM-T载体上的SpeI酶切位点和上述质粒中的BstEII酶切位点，将P1片断中的1.2kb片断利用相同的酶切位点克隆至pGEM-P1/2中，经PCR鉴定（图2.18），获得的质粒即为pGEM-P1，该阳性质粒同样送上海生工测序后确认序列准确无误。片段P5相对较短，易于扩增，将图2.14中的扩增产物加A尾后连接至pGEM-T载体中。取PCR鉴定阳性的菌液提取质粒后，利用SpeI进行酶切。此时，正确插入的片段酶切后获得了2个条带，大小约为载体的3kb和P5片断的2.2kb（图2.19）。回收P5片断，并将其与SpeI酶切后的pGEM-P1连接。由于是单酶切后的片段连接，因此此时载体在酶切时加入了Fermentas公司的碱性磷酸酶（CIAP），37℃水浴1h后回收DNA片断，即为去磷酸化的载体。此外，为了35 鉴定pGEM-P1+P5质粒插入片断的正向和反向2种顺序，利用Ham1U-Bsm和15192L-Spe引物组扩增菌液，结果显示，PCR扩增出约5.2kb的条带（图2.20）。将该菌液培养后提取质粒，经BstEII酶切鉴定显示，片段大小约为5kb和3kb（图2.21），符合预期大小。至此，pGEM-P1+P5质粒构建成功。图2.16片段P1的两段法扩增图2.17质粒pGEM-P1/2的酶切鉴定Figure2.16TheamplificationofFigure2.17EnzymedigestionofpGEM-P1/2twopartsofP1fragmentplasmidM：DL2000Marker；1~5分别为1.8kbM1：DL2000Marker;M2：DL5000Marker；片断；6~10分别为1.2kb片断1~9分别为BamHI对pGEM-P1/2的酶切结果M:MarkerDL5000;1~5:1.8kbM1：DL2000Marker;M2：DL5000Marker;fragment;2~6:1.2kbfragment1~9:EnzymedigestionofpGEM-P1/2byBamHI图2.18质粒pGEM-P1片断P1的PCR鉴定Figure2.18PCRdetectionofP1fragmentofpGEM-P1plasmidM：DL5000Marker；1~5为P1段扩增产物M:DL5000Marker;1~5:TheproductsofP136 图2.19质粒pGEM-P5片断酶切鉴定Figure2.19EnzymedigestionofpGEM-P5plasmidM：DL5000Marker；1~3为SpeI对pGEM-P1的酶切产物M:DL5000Marker;1~3:EnzymedigestionofpGEM-P1bySpeI图2.20质粒pGEM-P1+P5的PCR鉴定Figure2.20PCRdetectionofP1andP5fragmentsofpGEM-P1+P5plasmidM：DL5000Marker；1~10为P1和P5段扩增产物M:DL5000Marker;1~10:TheproductsofP1andP5图2.21质粒pGEM-P1+P5酶切鉴定Figure2.21EnzymedigestionofpGEM-P1+P5plasmidM1：DL10000Marker;M2：DL5000Marker；1~6为BstEII对pGEM-P1+P5的酶切产物M1:DL10000Marker;M2:DL5000Marker;1~6:EnzymedigestionofpGEM-P1+P5byBstEII37 2.3.8TVT-GM全长cDNA克隆的构建及鉴定取质粒pGEM-P1+P5，BsmBI酶切获得了预期片段大小一致的酶切产物，即约5.2kb和3kb条带（图2.22）。回收该片段后，经过与BbsI酶切的TVT载体连接、转化、鉴定后，获得的质粒命名为TVT-P15。利用SalI和KpnI酶切鉴定后，获得的片段大小分别约6.8kb和1.5kb（图2.23），与预期大小相符，说明TVT-P15质粒构建成功。利用图2.14中克隆的P3片断，经AgeI和SpeI双酶切后与同样经过双酶切的TVT-P15片断进行克隆，以引物6774U-Age和15192L-Spe进行PCR鉴定，正确的菌液可检测出片断的大小为P3和P5片断之和，约3.5kb（图2.24），获得的质粒命名为TVT-P153。随后经过HindIII酶切，琼脂糖凝胶鉴定后获得4个条带，大小分别约为4kb、3kb、1.3kb和1kb（图2.25），与预期相符。将先前PCR获得的片断P4经过克隆，与pMD18T载体连接后，经PCR鉴定出阳性克隆（图2.26），获得的质粒为pMD18T-P4，利用SpeI和MluI双酶切该质粒后，获得了与预期大小相符的片段，正确条带大小分别约5kb和2.7kb（图2.27）。将5kb片断回收后，通过与相同酶切后的TVT-P153片断进行连接后，经过PCR同时鉴定菌液中是否同时存在P3和P4片断。提取2个片断均为阳性的菌液质粒，获得了TVT-P1534。为进一步验证质粒的正确性，利用HindIII酶切，琼脂糖凝胶鉴定后获得4个条带，大小分别约为6kb、4kb、3kb和1.3kb（图2.28），与预期相符。将含片断P2的质粒P2T与质粒TVT-P1534经过AgeI和AscI双酶切后进行连接，对疑似阳性菌液进行片断P2和P5的PCR鉴定，出现了双阳性的菌液（图2.29），将获得的质粒命名为TVT-GM。经过质粒提取后，以HindIII酶切，琼脂糖凝胶鉴定后获得4个条带，大小分别约为7.9kb、6kb、3kb和1.3kb（图2.30），与预期大小相符。随后利用表2.1中的8对引物（扩增3’和5’端使用的引物为TVT载体上的）PCR扩增获得了TVT-GM的各基因序列（图2.31），产物直接送上海生工进行序列测定。经序列比较发现，克隆后GM的序列除了6789位外，还发生了G430T、C4584A、A6927C、G7091A和A7644G。这些突变导致NP蛋白D103E，F蛋白P12H以及HN蛋白R225H突变（图2.32）。38 图2.22质粒pGEM-P1+P5酶切Figure2.22EnzymedigestionofpGEM-P1+P5plasmidM：DL5000Marker；1，2为BsmBI对pGEM-P1+P5的酶切产物M:DL5000Marker;1,2:EnzymedigestionofpGEM-P1+P5byBsmBI图2.23质粒TVT-P15酶切Figure2.23EnzymedigestionofTVT-P15plasmidM1：DL10000Marker;M2：DL2000Marker；1~3为SalI和KpnI对TVT-P15的酶切产物M1:DL10000Marker;M2:DL2000Marker;1~3:EnzymedigestionofTVT-P15bySalIandKpnI图2.24质粒TVT-P153的PCR鉴定Figure2.24PCRdetectionofP3andP5fragmentsofTVT-P153plasmidM：DL5000Marker；1~6为P3和P5段扩增产物M:DL5000Marker;1~6:TheproductsofP3andP539 图2.25质粒TVT-P153酶切Figure2.25EnzymedigestionofTVT-P153plasmidM：DL5000Marker；1，2为HindIII对TVT-P153的酶切产物M:DL5000Marker;1,2:EnzymedigestionofTVT-P153byHindIII图2.26pMD18T-P4的PCR鉴定Figure2.26PCRdetectionofpMD18T-P4M：DL5000Marker；1~3为P4段PCR扩增产物M:DL5000Marker;1~3:ThePCRproductsofP4图2.27质粒pMD18T-P4酶切Figure2.27EnzymedigestionofpMD18T-P4plasmidM：DL5000Marker；1~4为SpeI和MluI对pMD18T-P4的酶切产物M2:DL2000Marker;1~4:EnzymedigestionofpMD18T-P4bySpeIandMluI40 图2.28质粒TVT-P1534酶切Figure2.28EnzymedigestionofTVT-P1534plasmidM：DL10000Marker；1为HindIII对TVT-P1534的酶切产物M:DL10000Marker;1:EnzymedigestionofTVT-P1534byHindIII图2.29质粒TVT-GM片断P2和P5的PCR鉴定Figure2.29PCRdetectionofP2andP5fragmentsofTVT-GMplasmidM：DL5000Marker；1~5为P2和P5段扩增产物M:DL5000Marker;1~5:TheproductsofP2andP5图2.30质粒TVT-GM酶切鉴定Figure2.30EnzymedigestionofTVT-GMplasmidM1：DL10000Marker；M2：DL5000Marker；1为HindIII对TVT-GM的酶切产物M1:DL10000Marker;M2:DL5000Marker；1:EnzymedigestionofTVT-GMbyHindIII41 图2.31TVT-GM8个基因片段RT-PCR扩增结果Figure2.31TheRT-PCRresultsofeightfragmentsofTVT-GMM1：DL2000Marker；M2：DL5000Marker；1~8分别为NP,P,F,HN,L1,L2,L3,L4扩增产物M1:DL2000Marker;M2:DL5000Marker；1~8:fragmentsofNP,P,F,HN,L1,L2,L3andL4图2.32GM亲本毒株和cDNA克隆质粒TVT-GM之间序列比对Figure2.32ThealignmentofpatentalGMvirusandTVT-GMcDNAcloneGM基因组序列起始位点为3047位ThestartingsiteofGMgenomewasatposition30472.3.9辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L基因的克隆及鉴定利用表2.3中的引物，分别扩增获得了GM株NP，P和L基因，分别将它们克隆至pJET1.2/blunt载体中，随后通过双酶切将它们分别克隆至pCI-neo载体中。PCR鉴定，获得疑似阳性克隆，pCI-NP和pCI-P经EcoRI和SalI酶切后出现约5.5kb的载体片断和分别约1.5kb的NP基因片断，1.2kb的P基因片段；pCI-L经NheI和SalI酶切后出现6.6kb的L基因片段和5.5kb的载体片断（图2.33）。所以阳性质粒经测序确认序列的准确性。42 图2.33质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L的酶切鉴定Figure2.33EnzymedigestionofpCI-NP、pCI-PandpCI-LplasmidM1：DL5000Marker；M2：DL10000Marker；1，2分别为EcoRI和SalI酶切pCI-NP和pCI-P的产物；3为NheI和SalI酶切pCI-L的产物M1:DL5000Marker;M2:DL10000Marker；1,2:EnzymedigestionofpCI-NPandpCI-PbyEcoRIandSalI;3:EnzymedigestionofpCI-LbyNheIandSalI2.3.10微基因组的构建及验证利用表2.4中的引物，分别扩增获得了Leader区及NP基因ORF前方的非编码区序列（M1段）、EGFP基因序列（M2段）、L基因ORF后的非编码区和Trailer序列（M3段）（图2.34），获得片段长度分别为196bp，737bp和212bp。回收这3个片断，利用Mini-1-F和15192L-Spe进行融合PCR，获得1条接近1100bp的DNA条带（图2.35），即为minigenome序列，利用BsmBI酶切后与载体连接，即获得TVT-mini。利用Qiagen试剂盒提取阳性质粒，测得质粒浓度为101ng/μL，与pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞。同时设置pEGFP-N1阳性对照。48h时可见TVT-mini出现明显绿色荧光，其荧光强度略低于pEGFP-N1阳性对照（图2.36），说明辅助质粒能够正确包装。2.3.11GM株的拯救和鉴定经质粒提取，获得TVT-GM质粒浓度为350ng/μL，与3个辅助共转染BSR-T7/5细胞后，细胞于转染后48h开始出现死亡，至72h时细胞几乎全部死亡。此时收获细胞液，冻融后接种了3枚鸡胚，鸡胚死亡时间在48~72h之间。无菌收取尿囊液，所收获的重组病毒命名为rGM后，经测定表明只有2枚鸡胚有HA活性，效价分别为4log2和6log2。这和亲本毒株的HA效价8log2之间存在较大差距。为了确认rGM是否为拯救的重组病毒，通过表2.1中8对引物扩增获得了重组病毒全基因序列，经比对，该病毒在43 基因组第6789位含有AscI分子标签（图2.37），说明GM株的cDNA克隆成功被拯救。同时，比对发现，拯救病毒序列和cDNA质粒克隆的序列相一致。图2.34微基因组分段RT-PCR扩增结果Figure2.34ThethreefragmentsofminigenomeamplifiedbyRT-PCRM：DL2000Marker；1~3分别为片断M1，M2和M3的扩增产物M:DL2000Marker;1~3:fragmentsofM1,M2andM3图2.35微基因组融合PCR扩增结果Figure2.35TheminigenomeamplifiedbyfusionPCRM：DL2000Marker；1为片断M1，M2和M3融合扩增产物；2为阴性对照M:DL2000Marker;1:FragmentsM1,M2andM3amplifiedbyfusionPCR;2:NegetivecontrolAB图2.36TVT-mini转染后EGFP的表达Figure2.36TheexpressionofEGFPproteinofTVT-miniA：pEGFP-N1阳性对照；B：TVT-miniA:pEGFP-N1positivecontrol;B：TVT-mini44 图2.37rGM分子标签位点测序Figure2.37ThebiomarkerofrGM2.3.12拯救的重组病毒rGM的传代稳定性为了验证拯救病毒的稳定性，通过在SPF鸡胚上连续传代15代后，每5代测定rGM的分子标签。结果表明，rGM的分子标签较稳定（图2.38），连续传代不影响序列的稳定性。同时每1代尿囊液均测定病毒的HA效价，结果rGM的效价经过3代后即可达到8log2，即亲本毒株水平，后期病毒HA效价则一直稳定在8log2（表2.6）。图2.38rGM第5、10和15代分子标签Figure2.38Thebiomarkerofthefifth,tenthandfifteenthpassagesofrGMA，B，C：第5、10和15代病毒分子标签A,B,C:Thebiomarkerofthefifth,tenthandfifteenthrGMvirus表2.6rGM传代后各代次尿囊液HA效价Table2.6TheHAtitersofdifferentpassagesofrGM毒株代次HA效价（log2）rGMCE14，6rGMCE27rGMCE36rGMCE47rGMCE58rGMCE67rGMCE77rGMCE88rGMCE98rGMCE10845 表2.6rGM传代后各代次尿囊液HA效价（续）Table2.6TheHAtitersofdifferentpassagesofrGM(continued)毒株代次HA效价（log2）rGMCE118rGMCE128rGMCE138rGMCE148rGMCE1582.3.13亲本毒和重组病毒生长曲线测定将2株病毒同时接种CEF细胞，在不同时间点取样后测定病毒效价，2株病毒都是强毒株，因此，细胞在48h时几乎全部病变。通过测定发现rGM的病毒效价在12~60h之间比亲本毒GM高10倍，而在病毒复制初期（6h）和末期（72h）二者效价差异不明显（图2.39）。图2.39重组病毒rGM和亲本毒GM体外生长曲线Figure2.39MultistepgrowthkineticsofrecombinantvirusrGMandparentalvirusGM2.3.14亲本毒和重组病毒间接免疫荧光鉴定为了验证rGM的抗原性，利用制备的高免兔血清（经测定HI效价大于1：128）作为一抗，经过间接免疫荧光试验后观察发现，无论是亲本毒GM还是重组毒rGM，二者感染24h后，几乎所有细胞全部出现明显的荧光。此时，对照组不出现荧光（图2.40）。表明病毒增殖迅速，与血清反应性良好，重组病毒和亲本毒之间抗原性没有差异。46 ABC图2.40重组病毒rGM和亲本毒GM间接免疫荧光鉴定（200×）Figure2.40TheindirectfluorescentantibodytestofrGMandparentalvirusGMA：GM；B：rGM；C：阴性对照A:GM；B:rGM;C:Negative2.3.15rGM株ELD50，MDT，ICPI的测定及其与亲本毒株的差异利用常规方法测定病毒的ELD50、MDT和ICPI值后发现，重组毒rGM基本保持与亲本毒GM相一致的生物学特性，其MDT值和ICPI值保持不变，分别为59h和59h，ICPI值为1.98和2.0。不过rGM株的ELD50升高了10倍，说明拯救病毒的滴度更高。表2.7rGM和GM株部分生物学特性测定Table2.7ThepartialcharacteristicsofrGMandGM毒株MDT（h）ICPIELD50VirusGM591.9810-7.3/0.1mLrGM592.010-8.3/0.1mL2.4讨论对于不同的病毒拯救系统而言，如何使病毒基因组进行转录和复制较重要。在最常使用的T7系统中，由于真核细胞不表达T7RNA聚合酶，因此使用该系统时需要额外引进。也就是说，必须要有T7RNA聚合酶的驱动。最初使用的方法是利用表达T7RNA聚合酶的痘病毒（FPV-T7）预先感染细胞（Peetersetal,1999），然而该痘病毒能够使细胞迅速病变影响病毒的拯救，同时拯救病毒中也混杂有痘病毒，使用时还需要进行分离纯化，过程繁琐，效率低下。随后，人们构建了缺陷型痘病毒（MVA-T7），该病毒对HEp-2细胞具有严格的宿主特异性且不会使细胞病变，此外该病毒在禽源细胞和鸡胚内不增殖，因此没有FPV-T7的缺点（Krishnamurthyetal,47 2000）。与此同时，一种稳定表达T7RNA聚合酶的细胞，BSR-T7/5被成功构建（Römer-Oberdörferetal,1999）。此时，利用细胞就不需要用重组痘病毒处理，直接转染即可。这样病毒拯救的操作过程得到了简化，也保证了拯救病毒的纯净性。PolⅡ系统由于效率高，对细胞无特殊要求，因此越来越受到关注。该系统的运行需要准确的转录本，此时必须在cDNA克隆的5’端引入HamRz，3’端引入HdvRz。但是有研究表明（Lietal,2011），HamRz在T7系统中也能够工作良好，不过由于T7启动子后面的序列偏好2~3个G，因此许多研究者都会额外加入2~3个G。本研究设计之初参考了成熟的T7系统，然而克隆时，T7启动子后面紧跟着额外的3个G并没有加入，取而代之的是HamRz序列。这是因为该序列不仅能够在PolⅡ表达系统中发挥精准切割功能，在T7系统中，对病毒的拯救效率也有提高的作用。为了确认该序列的作用，在引物设计时引入了该序列。实际上，HamRz序列的核心序列并不长，但为了保证切割效率，本研究使用了完整的HamRz序列。自NDV被成功拯救以来，许多不同毒力的NDV都被成功拯救。但目前被成功拯救的基因Ⅶ型毒株并不多，他们包括ZJ1株（Liuetal,2007），NA-1株（Wangetal,2015），SG10株（Liuetal,2015），Banjarmasin/010/10（Xiaoetal,2012）。尽管NDV反向遗传操作系统已经成熟，然而建立一整套系统通常需要良好的克隆策略、稳定的载体以及高效率表达系统。一般来说，构建cDNA克隆需要准确克隆病毒的序列，而分离到的NDV分离株实际上是1个混合物，即存在“准种”。因此对病毒进行纯化是第1步。研究表明，强毒株裂解位点氨基酸残基通常为112R/KRQR/KRF117，而弱毒株常为112G/ER/KQG/ERL117。强毒株裂解位点附近具有连续2对碱性氨基酸，易被宿主细胞的多种酶类切割，因此在细胞上易出现细胞病变（CPE），对宿主的致病力较强；弱毒株由于缺少成对的碱性氨基酸，只能被少数特定的酶类切割，因此无CPE，对宿主的致病力也弱。由于强毒株容易形成CPE，因此可利用蚀斑法进行纯化；而弱毒株则通常需要额外添加胰酶或者进行有限稀释法纯化。在进行3轮蚀斑纯化后，为了获得GM株准确的序列，本研究利用高保真酶扩增的多个PCR产物直接进行测序，尽可能获得准确的序列。随后，本研究将GM基因组分成5段进行克隆，在HN基因中（GM基因组第6789位）通过1个同义突变引入AscI酶切位点（ggtgcgcc→ggcgcgcc），以便区分亲本毒和重组毒。这种引入分子标签的方法在反向遗传操作中经常使用，也有一些方法是去掉酶切位点，或者引入多个酶切位点的。注意最好不要在病毒的调控序列区进行酶切位点引入，除非该位点的突变在其他新城疫病毒中存在或者已经有成功构建的先48 例。由于NDV整个基因组长度约15kb，而且构建的全长质粒中病毒基因组属于外源片段，因此相对不稳定，构建时多利用低拷贝质粒作载体。但近年也有利用高拷贝质粒成功构建和拯救的报道，尤其是使用PolⅡ系统进行拯救的（Lietal,2011；Zhangetal,2013；Wangetal,2015）。目前构建cDNA克隆的方法多数是利用酶切位点重叠分段克隆法，也有不使用酶切位点利用In-Fusion重组技术的（Huetal,2011）。本研究在分段克隆P1段时，与pGEM-T载体连接后难以筛选到阳性克隆，因此将该片段分成2段进行克隆。然而后续发现如果仅仅是将片段克隆至T载体，那么pJET1.2/blunt载体效果要优于常用T载体。在整个克隆过程中，保持序列的正确性比较重要，由于NDV基因组严格遵守6碱基规则，因此克隆时除了PCR、酶切鉴定外，测序也是必不可少的。通过比较纯化的GM株基因组序列、构建cDNA克隆及rGM的序列发现，除分子标签外，克隆过程中还发生了G430T、C4584A、A6927C、G7091A和A7644G突变，它们导致了NP蛋白D103E，F蛋白P12H以及HN蛋白R225H的突变，这些突变在rGM中同样存在。理想cDNA克隆构建的质粒完全忠实于原基因组序列，然而突变并不意味着克隆失败或者说病毒无法拯救。Peeters等拯救的病毒也存在多处核苷酸和氨基酸的突变（Peetersetal,1999）。本研究也证实，上述这些突变没有影响病毒的拯救。除了全长cDNA克隆的构建，辅助质粒的效率对病毒拯救也起着较大作用。一般为了检测辅助质粒的效率常常利用微基因组来验证，微基因组包含NDV的3’和5’非编码区，同时用荧光蛋白作为指示确认整个系统能够正常工作。本研究通过表达EGFP的微基因组验证了整个系统工作的可行性，随后利用该系统成功拯救出rGM。拯救病毒最初几代的效价偏低，这可能是由于选择T7系统而没有加入额外G的原因，也可能是病毒拯救效率的原因。但是，经过3代传代后，病毒能够迅速升高至和亲本毒相一致的滴度，这说明本研究使用的拯救系统也能够工作良好。rGM经过15代传代后，经过序列测定，所有毒株的分子标签AscI均没有发生突变，血凝效价稳定，这说明病毒传代稳定。然而体外生长曲线和ELD50结果显示rGM的复制能力明显强于亲本毒GM。这很可能是由于cDNA克隆构建过程中的突变造成的。尽管只发生了3个位点的点突变，但有时候个别位点的突变足以影响病毒的复制能力（Khattaretal,2009），不过这有待进一步研究证实。由于rGM在ICPI和MDT数值上并没有显著变化，因此这一现象也有可能是其他原因导致的。49 本研究建立的GM株反向遗传操作平台将为基因Ⅶ型疫苗的研制，活载体疫苗以及新型标记疫苗的研发奠定基础。2.5小结2.5.1利用T7启动子，在HamRz和HdvRz的精准切割下，拯救出重组病毒rGM。由此成功建立了T7聚合酶驱动的基因Ⅶ型NDV反向遗传操作平台。2.5.2重组病毒rGM与亲本毒株GM的HA效价、ICPI值和MDT值比较一致，但其在CEF上的复制能力比GM株约增加了10倍。50 第3章致弱突变株rGM-Ⅶm和rGM-Im的拯救及其免疫效果的初步研究3.1引言目前，新城疫仍然是严重威胁我国养禽业的重大疫病之一。疫苗的广泛使用使得该病的发生率显著降低。然而我国仍然存在不少的散养、混养家禽，疫苗的免疫程序、免疫方式在临床实践中仍然存在一定问题。随着1997年华南地区QY97株和华东地区JG97等基因Ⅶ型强毒株的分离（Jindingetal,2005），此后一段时间内，该基因型的毒株在我国肆虐横行（Liuetal,2007；Liuetal,2008）。由于鹅、鸭等水禽也能够感染并发病，因此对基因Ⅶ型毒株的防控也越来越受到基层的关注。一段时间内，我国禽群中基因Ⅶd亚型毒株所占比例甚至超过60%（Liuetal,2007；Liuetal,2008）。由于基因Ⅶ型毒株与B1、LaSota、Clone30和V4等常用疫苗株之间的核苷酸和氨基酸相似性差异高达20%（Milleretal,2007），加之一些有“非典型”新城疫以及免疫发病的报道，因此研究基因Ⅶ型疫苗将有助于解决这些问题。更为重要的是，使用抗原性与流行毒株相匹配的疫苗后，不仅能够提高保护率，在降低免疫动物的排毒率和排毒载量方面也有着显著效果（Milleretal,2009）。因此，利用基因Ⅶ型新城疫病毒致弱毒株制备的疫苗具有良好的前景。由于反向遗传操作具有对病毒致弱精准，改造方便，成本低廉等优势，因此已经成为疫苗制备的重要手段之一。本研究利用融合PCR技术，突变rGM株的裂解位点（112RRQKRF117），使其具备与LaSota弱毒株相似的裂解位点（112GRQGRL117），实现了致弱突变株rGM-Ⅶm的拯救。同时为了比较含不同裂解位点拯救毒株的差异，还将裂解位点突变为ClassI毒株的常见类型（112ERQERL117）。最后将这2个致弱毒株分别制备成活疫苗和灭活油乳剂疫苗，免疫7日龄SPF鸡后，评价了致弱毒株作为疫苗的潜在可能。3.2材料与方法3.2.1质粒、细胞、试剂和仪器质粒TVT-P1534和P2T，BSR-T7/5和CEF细胞，转染试剂LTX，二氧化碳培养箱等见第2章，化学试剂均为分析纯级。7日龄SPF鸡由大华农保健品股份有限公司实验动物中心提供。IKA乳化机购自艾卡（广州）仪器设备有限公司。51 3.2.2引物设计与合成通过对待突变的位点进行引物的修改使得扩增产物含有突变的核苷酸，经过融合PCR之后即可获得目的片断。突变引物见表3.1，引物由上海生工合成。表3.1F蛋白裂解位点突变引物Table3.1PrimersforthemutationofFproteincleavagesite引物名称序列（5’→3’a）NamePrimersequencesF-Mut-La-LowerTATaaggcgcccctgtctcccTCCTCCAGACATGGACACAGACCCTTF-Mut-La-UpperTGGAGGAgggagacaggggcgccttATAGGTGCTGTTATTGGCF-Mut-I-LowerCTATaaggcgttcctgtctctcTCCTCCAGACATGGACACAGACCCTTF-Mut-I-UpperGGAGGAgagagacaggaacgccttATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGa突变序列以小写字母标示。3.2.3突变片断的克隆及突变株全长克隆的构建以P2T质粒为模板，利用表2.2中上游引物2879U-Age和F-Mut-La/I-Lower引物扩增获得突变产物的上1/2段（简称Fm1），同时利用F-Mut-La/I–Upper和下游引物6767L-Asc扩增获得突变产物的下1/2段（简称Fm2）。随后，以回收产物为模板，利用2879U-Age和6767L-Asc引物扩增，将获得的112GRQGRL117和112ERQERL1172种裂解位点类型的片断与pMD18T载体连接后，分别命名为P2mT和P2ImT。随后，利用AgeI和AscI分别酶切TVT-P1534以及上述2个质粒，随后进行连接、转化和鉴定，获得的阳性质粒命名为TVT-GM-Ⅶm和TVT-GM-Im。质粒经酶切、F片断扩增后，测序确认突变质粒的正确性。3.2.4突变株全长克隆的拯救按照2.2.15中描述的方法进行转染，不过在转染24h后，加入终浓度为1μg/μL的TPCK胰酶或者10%的SPF鸡胚尿囊液以便使弱毒株能够成功拯救。待转染72h后，反复冻融细胞3次，并将混合物接种9日龄SPF鸡胚，0.5mL/胚。弃去24h内的死胚，收获24~120h内所有死亡和存活的鸡胚尿囊液。通过HA和HI试验，二者均为阳性者即为目的拯救病毒，分别命名为rGM-Ⅶm和rGM-Im。3.2.5重组病毒的鉴定及遗传稳定性为了确定致弱毒株F蛋白裂解位点的突变是否成功，利用表2.1中扩增F片断的引物获得了含裂解位点序列的片断，送上海生工测序。同时将获得的病毒在SPF鸡52 胚中传15代，每隔5代测序1次，确认F蛋白裂解位点序列。同时记录每个代次尿囊液的HA效价。3.2.6重组病毒的致病性为了测定致弱病毒rGM-Ⅶm和rGM-Im的致病性，利用2.2.20中的方法测定2株病毒的MDT和ICPI值，同时还测定了2株病毒的EID50，测定方法类似于ELD50，但所有鸡胚均需要经过HA试验，确认未死亡鸡胚是否被感染。3.2.7重组病毒的生长曲线重组病毒rGM-Ⅶm和rGM-Im生长曲线的测定方法与2.2.18相同。但是由于弱毒株无法在细胞上产生CPE，因此额外添加终浓度为1μg/μL的TPCK胰酶，同时以Opti-MEM培养细胞。测定各时间点的TCID50后利用Prism6.0绘制生长曲线图。3.2.8rGM-Ⅶm和rGM-Im灭活疫苗的制备收集rGM-Ⅶm和rGM-Im的尿囊液，然后加入甲醛溶液进行灭活，使其终浓度为0.2%。37℃作用20h后，测定灭活后尿囊液HA效价，使他们的HA效价均为9log2。同时将灭活尿囊液接种SPF鸡胚，并传代1代确认病毒已经灭活彻底。按照水相（灭活尿囊液）和油相（Marcol52）1：2的比例进行疫苗配制，以IKA剪切乳化机进行乳化，5min/次，共乳化2次。制备的疫苗滴于水面，需成团，且1min内不分散则说明已经制备成合格的油乳剂疫苗。3.2.9rGM-Ⅶm、rGM-Im和LaSota灭活疫苗免疫效果的比较研究为了比较不同裂解位点的致弱毒株和LaSota灭活疫苗之间免疫效果的差异，将40只7日龄SPF鸡分成4组，每组10只。按照商品LaSota灭活疫苗的推荐剂量接种上述3种疫苗，每只0.2mL。余下的10只作为对照组。免疫21d后所有鸡均采血5.0ELD分离血清，测定所有鸡的HI效价。同时以1050剂量的GM株对所有鸡进行攻击。记录发病数和死亡数，同时采集攻毒后第1、3、5、7和9d的口咽和泄殖腔拭子，经过5000IU/mL的青链霉素作用后，接种鸡胚进行病毒分离，每个样品接种3枚。通过HA判定病毒分离情况，并据此计算排毒比例。3.2.10rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗在鸡体内复制能力的研究为了明确致弱毒株在体内的复制能力，选取毒力稍强的rGM-Ⅶm与LaSota进行6.0EID对比试验，探讨致弱毒株作为弱毒疫苗的可能性。上述2种疫苗分别以1050免疫7日龄SPF鸡各15只，于免疫后第1、3、5、7和9d分别采集3只鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑、气管、胸腺、法氏囊、咽喉和泄殖腔拭子样品，利用鸡胚进行病毒53 分离，每个样品接种3枚。逐个鸡胚进行HA试验确认，结果呈阳性则说明病毒能够复制。3.2.11rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗免疫效果的研究6.0EID将rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗分别以1050免疫7日龄SPF鸡各10只，免5.0ELD疫21d后所有鸡均采血分离血清，测定所有鸡的HI效价。同时以1050剂量的GM株对所有鸡进行攻击。记录发病数和死亡数，同时采集攻毒后第1、3、5、7和9d的口咽和泄殖腔拭子，进行病毒分离，记录排毒比例。该试验与灭活疫苗评价同时进行。3.3结果与分析3.3.1突变片断的克隆及突变株全长克隆的构建以P2T为模板，分别用上下2对引物分别扩增获得了Fm1和Fm2片断，大小分别约为2kb和1.9kb。利用2879U-Age和6767L-Asc引物经过融合PCR扩增后，获得了与预期大小相符合的片断（图3.1）。采用与构建GM株相似的方法，经过酶切、连接后，获得了TVT-GM-Ⅶm和TVT-GM-Im质粒，经测序鉴定证实所构建的质粒正确无误。图3.1突变片段融合PCR扩增结果Figure3.1ThemutatedfragmentsamplifiedbyfusionPCRM：DL5000Marker；1~3为突变后P2片断融合PCR扩增产物M:DL5000Marker;1~3:P2fragmentsamplifiedbyfusionPCR3.3.2突变株全长克隆的拯救按照rGM株相同的拯救方法进行病毒的拯救，加入TPCK胰酶后，转染细胞的死亡速度加快，一般48h时已经死亡，少量细胞能够维持到72h。空白对照组细胞添加胰酶后也出现细胞状态差、死亡数增多等现象。收获细胞rGM-Ⅶm接种5枚鸡胚后，逐个鸡胚测定HA效价。结果发现，120h前死亡的2枚鸡胚中有1枚出现血54 凝，而3枚未死亡的鸡胚冷冻后，有2枚出现血凝，他们的效价均为7log2（图3.2A）。此外，2枚阳性对照rGM尿囊液均具有HA活性，阴性对照无HA活性。而rGM-Im接种的6枚鸡胚全部出现血凝，效价可高达10~11log2（图3.2B）。AB图3.2拯救后重组病毒rGM-Ⅶm和rGM-Im血凝效价Figure3.2TheHAtitersofrGM-ⅦmandrGM-Imaftervirusrecovery图3.3rGM-Ⅶm突变序列测定及氨基酸分析Figure3.3NucleotidesequenceandaminoacidanalysisofmutatedsitesofrGM-Ⅶm图3.4rGM-Im突变序列测定及氨基酸分析Figure3.4NucleotidesequenceandaminoacidanalysisofmutatedsitesofrGM-Im3.3.3重组病毒的鉴定及遗传稳定性通过F基因扩增及序列测定发现，突变的rGM-Ⅶm毒株的序列与预期一致，其F蛋白裂解位点变为112GRQGRL117（图3.3）。同样，rGM-Im毒株的F蛋白裂解位点也变为112ERQERL117（图3.4）。经过传代15代，同时每5代测序后发现，所获得的2株重组病毒遗传稳定性良好，裂解位点不发生回复突变。同时传代过程中发现，rGM-Ⅶm第2代时HA效价可达10log2，随后一直保持稳定。而rGM-Im经过传代55 以后，其HA效价也稳定在10log2。由此可见，致弱毒株的HA效价较强毒株rGM升高了4倍。3.3.4重组病毒的致病性为了比较致弱毒株rGM-Ⅶm、rGM-Im与强毒株rGM株的致病性差异，通过ICPI、MDT值比较发现，rGM-Im的ICPI值最低，MDT值大于120h，这就意味着其毒力更弱。也就是说F蛋白裂解位点含112GRQGRL117序列时，被胰酶裂解的能力要强于112ERQERL117。此外，致弱突变后，由于病毒变得更弱，因此EID50有了大幅度提高，他们的滴度提高了约100倍。表3.2重组病毒的致病指数Table3.2Pathogenicityofrecombinantvirus毒株ICPIMDT(h)EID50VirusrGM-Ⅶm0.499.010-10.3/0.2mLrGM-Im0.2123.210-10.7/0.2mLrGM2.05910-8.6/0.2mL3.3.5重组病毒的生长曲线致弱毒株rGM-Ⅶm与强毒株rGM株相比，rGM-Ⅶm在各个时间点的病毒滴度接近rGM株，他们的复制能力可媲美。然而rGM-Im毒株的滴度在36h时和rGM株差异达到峰值，rGM比rGM-Im的滴度甚至可高达100倍。然而至72h时，rGM-Im的复制滴度超过了另外2个重组病毒。也就是说体外rGM-Im的复制出现了一定地延缓。/0.1mL)50Virustiter(-lgTCID图3.5重组病毒rGM-Ⅶm，rGM-Im和亲本毒GM体外生长曲线Figure3.5MultistepgrowthkineticsofrecombinantvirusrGM-Ⅶm,rGM-ImandparentalvirusGM56 3.3.6rGM-Ⅶm、rGM-Im和LaSota灭活疫苗免疫效果的比较研究将3种不同的灭活疫苗免疫SPF鸡后，分别在14d和21d时采血测定HI抗体。结果显示，当以LaSota作为检测抗原时，LaSota、rGM-Im和rGM-Ⅶm灭活疫苗免疫后14d时HI抗体平均值分别为5.1log2、4.5log2和6.6log2；然而当检测抗原为GM时，3组抗体依次为3.5log2、6.5log2和6.7log2。除了O-rGM-Ⅶm免疫组用2组抗原测定的结果差异不大外，另外2组使用与疫苗相匹配的抗原检测时，HI平均抗体水平高1.5log2~2log2（表3.3）。当免疫后21d时再次用2种抗原测定HI抗体水平，结果发现，这3组的HI效价均超过5log2，但匹配抗原比非匹配的高0.7log2~1.3log2。无论在14d还是21d时测定HI效价，重组病毒免疫组均比LaSota免疫组至少高2倍（表3.4）。攻毒后，O-LaSota免疫组一直排毒到第7d，其中1~5d时排毒比例高，其中第3d位排毒高峰，口咽拭子中的比例可达50%，泄殖腔拭子则为30%。重组病毒制备的灭活疫苗免疫后攻毒，排毒高峰也出现在第3d，但最高不超过30%，并且只排毒到第5d。值得注意的是，以LaSota为抗原测定的HI抗体，尽管O-LaSota组抗体水平最高，但排毒却是最高的（表3.5）。表3.3灭活疫苗免疫14d时HI抗体效价Table3.3TheHItitersofchickensreceivinginactivatedvaccineat14dpi检验抗不同鸡只免疫14d时HI抗体效价（log2）组别a平均值标准原12345678910（log2）差GM33443433443.50.5O-LaSotaLaSota55565456645.10.7GM87754787766.51.3O-rGM-ImLaSota66542554554.51.2GM87578657876.71.1O-rGM-ⅦmLaSota76567778686.61.0GM000000000000PBSLaSota000000000000a“O-”表示油乳剂。a“O-”meansoilemulsion.57 表3.4灭活疫苗免疫21d时HI抗体效价Table3.4TheHItitersofchickensreceivinginactivatedvaccineat21dpi检验抗不同鸡只免疫21d时HI抗体效价（log2）组别平均值标准原12345678910（log2）差GM77655655655.70.8O-LaSotaLaSota76577766676.40.7GM78688777777.20.6O-rGM-ImLaSota68747745676.01.4GM57698778787.11.1O-rGM-ⅦmLaSota47645875765.81.4GM000000000000PBSLaSota000000000000表3.5不同灭活疫苗免疫组攻毒后的病毒分离率Table3.5FrequencyofisolationofchallengevirusindifferentinactivatedvaccineimmunedgroupsHItiter排毒率（阳性数/总数）(log2)a组别Numbersofviralsheddingchickens(positive/total)Group1dpc3dpc5dpc7dpc9dpc14dpi21dpibcOCOCOCOCOCO-LaSota5.16.44/100/105/103/102/102/100/101/100/100/10O-rGM-Im4.56.01/100/102/101/101/101/100/100/100/100/10O-rGM-Ⅶm6.65.82/100/103/100/100/101/100/100/100/100/10PBS0010/1010/1010/1010/10NSdNSNSNSNSNSaHI效价以几何平均值表示，数值为LaSota测定值；bO,口咽拭子；cC,泄殖腔拭子；dNS,没有幸存。aHItitermeansgeometricmeanHItiter,measuredbyLaSota;bO,oropharyngealswabs;cC,cloacalswabs;dNS,nosurvivors.3.3.7重组rGM-Ⅶm和LaSota株在鸡体内复制能力研究LaSota株在生产中广泛使用，效果良好。病毒分离结果显示（表3.6），rGM-Ⅶm和LaSota株的排毒周期均不超过9d。尽管在心脏和脑中2种病毒都无法检出，但是在第3d和第5drGM-Ⅶm在气管被检出，而LaSota未检测出病毒。此外，脾脏、肾脏、口咽拭子和泄殖腔拭子病毒分离结果显示，rGM-Ⅶm的检出率要高于LaSota，持续时间也较长，尤其是第3~5d是rGM-Ⅶm的1个复制高峰，而LaSota则是在第1~3d复制能力相对较强。58 表3.6rGM-Ⅶm和LaSota感染7日龄SPF鸡后病毒的组织分布Table3.6TissuesdistributionandvirussheddingofrGM-ⅦmandLaSotain7day-oldSPFchickens样品rGM-ⅦmLaSotaSample1dpi3dpi5dpi7dpi9dpi1dpi3dpi5dpi7dpi9dpi脑（brain）-a---------气管（trachea）-++-------肺（lung）-++--++---胸腺（thymus）---+--+---心脏（heart）----------肝脏（liver）-+-----+--脾脏（spleen）+b++--++---肾脏（kidney）+-++--+---法氏囊（bursaof-+---+--+-Fabricius）口咽拭子-++---+---（oropharyngealswab）泄殖腔拭子（cloacal-+++---+--swab）a-，HA阴性；b+，HA阳性。a-,hemagglutinationtestnegative;b+,hemagglutinationtestpositive.3.3.8rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗免疫效果的研究以相同剂量免疫7日龄SPF鸡后，分别于免疫后第7d、14d和21d时以NDV标准抗原进行HI检测。结果发现（表3.7），活疫苗诱导的HI抗体滴度较接近，免疫14d时HI效价已经可以达到5log2以上，免疫21d与14d时的抗体抗体水平没有显著差异。然而攻毒后病毒分离结果表明，rGM-Ⅶm免疫攻毒组仅在第5d的泄殖腔拭子中分离到了病毒，LaSota免疫攻毒组则在第1d的口咽拭子以及第3d的口咽和泄殖腔拭子中均分离到了病毒。在第7d和第9d时2个免疫组均没有分离到病毒。LaSota免疫攻毒组最高排毒比例可达到30%，而rGM-Ⅶm免疫攻毒组仅为10%。表3.7不同免疫组攻毒后的病毒分离率Table3.7FrequencyofisolationofchallengevirusindifferentimmunedgroupsHItiter排毒率（阳性数/总数）(log2)a组别Numbersofviralsheddingchickens(positive/total)Group1dpc3dpc5dpc7dpc9dpc7dpi14dpi21dpibcOCOCOCOCOCrGM-2.55.25.40/100/100/100/100/101/100/100/100/100/10ⅦmLaSot1.75.15.22/100/101/103/100/100/100/100/100/100/10aPBS00010/1010/1010/1010/10NSdNSNSNSNSNS59 aHI效价以几何平均值表示，数值为LaSota测定值；bO,口咽拭子；cC,泄殖腔拭子；dNS,没有幸存aHItitermeansgeometricmeanHItiter,measuredbyLaSota;bO,oropharyngealswabs;cC,cloacalswabs;dNS,nosurvivors.3.4讨论本研究利用成功建立的GM株反向遗传操作平台，采用融合PCR方法扩增获得了突变核苷酸位点的P2段序列。经过鉴定正确后，通过与载体连接，成功拯救出裂解位点突变的致弱毒株。众所周知，利用强毒株制备疫苗首先要解决种毒的安全性问题，这就需要人工致弱病毒。加之NDV强毒株致死鸡胚时间短，其HA效价难以达到10log2。因此，一个良好的种毒是必不可少的。为了获得高滴度的疫苗株，Hu等（2011）将HA效价达到9log2的强毒株的F和HN基因替换到ZJ1骨架中，最终拯救出HA效价为9log2的疫苗株。由此可见，合适的种毒也是较关键的。由于rGM具有相对较高的HA效价，因此可以作为骨架。F蛋白是NDV的主要毒力蛋白，因此在突变时，最常用的方法是突变F蛋白裂解位点。由于F蛋白的免疫原性最佳（Kimetal,2013），因此一般来说对F蛋白其他位点不作突变。然而在突变时，为了获得优良特性的疫苗候选株，我们选择了将强毒株原本的112RRQKRF117分别突变成112GRQGRL117和112ERQERL117。这是因为LaSota疫苗株的F蛋白裂解位点序列是112GRQGRL117，而许多天然NDV弱毒株（ClassI）的裂解位点序列是112ERQERL117。相对来说，LaSota比ClassI的毒力更强，尽管二者的生物学特性都表明他们是弱毒株。强毒株的拯救相对比较容易，由于F蛋白能够被细胞中的多种酶类切割，因此转染细胞后接种鸡胚即可获得拯救病毒。而弱毒株由于不能被有效切割，因此需要额外添加胰酶。而胰酶的添加对细胞的状态将产生直接影响，因此需要控制添加的浓度。研究表明（Xiaoetal,2012；Zhangetal,2013；Liuetal,2015），不同的拯救浓度（1~3μg/μL）均能成功，但为了保证细胞维持时间，增加拯救病毒的成功率，本研究选择了1μg/μL的添加终浓度。第一代拯救病毒rGM-Ⅶm效价为7log2，而rGM-Im效价为11log2。不过经过传代1代后，二者的HA效价均维持在10log2。所拯救的病毒经F基因序列测定和氨基酸推导后发现，拯救病毒经过传代15代后依然十分稳定，说明所拯救的病毒不会发生回复突变。这与先前的许多报道相一致（Xiaoetal,2012；Liuetal,2015）。但是在致病指数方面，突变毒株rGM-Ⅶm的MDT和ICPI值与LaSota相接近，rGM-Im的值也与ClassI类型毒株相似。rGM-Ⅶm比rGM-Im的致病指数高，这正好印证了F蛋白裂解位点是毒力的主要决定因素，同时也说明112位和115位的60 氨基酸残基对病毒的毒力有一定影响。然而同样是弱毒株，rGM-Ⅶm的复制能力更接近亲本毒株rGM，而rGM-Im在复制初期的滴度比他们低10~100倍。细胞病变的过程与病毒滴度的高低也有一定关系，添加胰酶后，rGM-Ⅶm的病变速度略快于rGM-Im，这可能是导致rGM-Im复制延缓的原因之一。不过，72h时rGM-Im的滴度略高于rGM-Ⅶm和rGM，这说明rGM-Im的复制速度略有延迟。然而2株致弱病毒的EID50较亲本毒rGM提高了100倍，这使得他们成为良好的疫苗候选。目前基因Ⅶ型重组新城疫灭活疫苗（A-Ⅶ株）已经上市，但市场上对该基因型的疫苗需求大，许多研究者也制备出相应疫苗，如aSG10、mNA1等。为了验证本研究致弱毒株作为基因Ⅶ型灭活疫苗的可能，首先将病毒灭活后尿囊液的HA效价调整到9log2，小量制备疫苗后与商品化LaSota疫苗进行免疫比较后发现，以GM为检测抗原时，rGM-Ⅶm和rGM-Im灭活疫苗免疫动物后14d和21d时鸡群的HI效价比LaSota灭活苗要高。而以LaSota为检测抗原时，他们的HI效价甚至还略低于LaSota灭活苗免疫组。然而，攻毒后，重组病毒灭活疫苗组的排毒率更低。这与之前的许多报道相一致。也就是说抗原性相匹配的程度决定疫苗的免疫效果，尤其是降低排毒率。由于灭活疫苗提供的黏膜免疫效果较弱毒低，因此本研究随后比较了rGM-Ⅶm和LaSota接种SPF鸡后病毒在体内的复制能力及排毒情况，结果发现尽管致病指数与LaSota较接近，但rGM-Ⅶm却具有更强的复制能力，其复制高峰在第3~5d，排毒时间也比LaSota要长，不过该毒株并不会导致鸡出现不良反应，因此其安全性良好，这和Xiao等（2012）的研究结果类似。由于使用SPF鸡的日龄不同，因此结果不尽相同，但是和该研究结果一致的是在脑中都没有检测到重组病毒的复制，这可能也是致弱病毒低毒力的1个特性。经过免疫攻毒后发现，rGM-Ⅶm和LaSota活疫苗接种SPF鸡后，二者的HI效价较接近，但滴度比灭活疫苗低2~4倍。然而，低HI抗体并不意味着保护效果差，在排毒率上，活疫苗的效果要明显优于灭活疫苗。另外一个值得关注的现象就是活疫苗免疫14d时的抗体水平和21d几乎相当。这对于机体迅速产生免疫力尤为重要，这也说明新城疫活疫苗的使用是十分必要的。有研究发现，传统疫苗对一些基因Ⅶ型毒株的保护率降低，甚至攻毒后出现死亡（Yuetal,2001；Qinetal,2008）。然而，本研究发现无论是灭活疫苗还是活疫苗，按照推荐的免疫剂量免疫SPF鸡后，均有良好的免疫保护效果。不过，在同样HI效价的条件下，无论是基因Ⅶ型灭活疫苗还是活疫苗，在基因Ⅶ型强毒株的攻击下，排毒率和排毒时间均出现降低。61 3.5小结3.5.1通过裂解位点突变，成功拯救出致弱毒株rGM-Ⅶm和rGM-Im，致病指数显示他们都是弱毒株。相对而言，rGM-Im比rGM-Ⅶm的毒力更弱，因此，裂解位点112位和115位的非碱性氨基酸对毒力也有一定影响。3.5.2rGM-Ⅶm和rGM-Im比亲本强毒株rGM的HA效价高4倍，EID50高100倍，是良好的疫苗候选株。3.5.3rGM-Ⅶm和rGM-Im灭活疫苗能够产生比LaSota灭活疫苗更高的HI抗体（以GM为检测抗原），强毒GM株攻击后，能够降低排毒率。3.5.4rGM-Ⅶm活疫苗比LaSota活疫苗具有更强的体内复制能力，免疫效果优于LaSota活疫苗。62 第4章表达EGFP蛋白及表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白重组新城疫病毒载体的构建及拯救4.1引言NDV是良好的病毒载体，这是因为NDV在鸡胚以及许多细胞中生长良好，繁殖滴度高，尤其是在体内能够诱导强烈的体液和细胞免疫。NDV疫苗应用广泛，安全性好，价格低廉，因此其优势明显（Duanetal,2015）。加之NDV是通过呼吸道和消化道自然感染的，因此可以作为载体输送呼吸道病原的保护性抗原。由于H5亚型禽流感病毒严重威胁我国养禽业的健康发展，而市场上常见的灭活疫苗在免疫初期的保护效果并不理想，加之已经有商品化的rL-H5禽流感疫苗产品，因此，研究针对目前流行的H5亚型禽流感病毒的活疫苗将对禽流感疫苗产品起到一个重要补充作用。基于反向遗传学的改造技术可以使NDV作为良好的疫苗载体。研究表明，通过删减干扰素拮抗基因V，可以使病毒在致弱的同时仍然保持良好的免疫原性，因此适用于胚内免疫（Mebatsionetal,2001）。至于插入外源基因的报道更是数不胜数。为了探讨构建活载体的可能，本研究利用突变技术，在NDV最佳插入位点P和M之间引入1个平末端酶切位点PmeI，同时为了保证插入基因的成功拯救，所插入序列的长度设置为6的倍数。在插入EGFP基因的基础上，还对禽流感病毒的HA基因进行了尝试。4.2材料与方法4.2.1质粒、细胞、试剂和仪器质粒TVT-P1534和P2T，BSR-T7/5和CEF细胞，转染试剂LTX，二氧化碳培养箱等见第2章，化学试剂均为分析纯级。4.2.2引物设计与合成首先通过突变P和M基因之间的引物使得P2T质粒中引入1个PmeI酶切位点。为了插入外源基因，将P和M基因之间的非编码区也置于插入基因的前后。引物见表4.1，引物由上海生工合成。63 表4.1插入位点突变和外源序列克隆引物Table4.1Primersfortheinsertionandcloningofforeignsequences引物名称序列（5’→3’a）NamePrimersequencesPme-6200UAATCCACGTTTAAACACCCCATACAACAGCCCTCTPme-6193LTGTTGTATGGGGTGTTTAAACGTGGATTTGCAAGGGTTTAAACTTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCatggtgagcEGFP-Pme-FaaggEGFP-Pme-RGTTTAAACttacttgtacagctcgtccatgccgaGTTTAAACTTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCatggagaaaH5HA-UpperatagtgcttH5HA-LowerGTTTAAACTTAAATGCAAATTCTGCAa外源基因序列以小写字母标示。4.2.3含PmeI酶切位点载体的构建及表达EGFP和HA基因载体的构建以含弱毒株裂解位点的突变质粒P2ImT为模板，利用表2.2中上游引物2879U-Age和Pme-6193L引物扩增长度290bp的片段，同时利用Pme-6200U和下游引物6767L-Asc扩增获得长度3629bp的片段。随后，以回收产物为模板，利用2879U-Age和6767L-Asc引物扩增，将获得的片断与pMD18T载体连接后，命名为P2ImT-Pme。随后，利用PCR扩增获得EGFP基因和禽流感HA基因，将克隆片段与pMD18T进行连接，阳性质粒经过PmeI酶切后与同样经过PmeI酶切的P2ImT-Pme质粒进行连接，构建P2T-Pme-EGFP/HA质粒。利用AgeI和AscI酶切后与同样酶切后的TVT-P1534进行连接、转化和鉴定，最终获得的阳性质粒命名为TVT-GM-Im-EGFP/HA。质粒经酶切、PCR鉴定及测序后确认突变质粒的正确性。4.2.4全长克隆的拯救及重组病毒稳定性、致病性、生长曲线等指标的测定按照3.2.4中描述的方法进行转染。拯救的病毒分别命名为rGM-Im-EGFP和rGM-Im-HA。重组病毒经引物2879U-Age和6767L-Asc扩增后送上海生工测序。同时将重组病毒按照3.2.5、3.2.6和3.2.7中的方法进行稳定性、致病性和生长曲线的测定。4.3结果与分析4.3.1含PmeI酶切位点载体的构建位于P和M之间的序列GCTTCAAC经过突变为GtTTaAAC后即可引入PmeI酶切位点。以P2ImT为模板，经过PCR扩增，获得了与预期大小相符的片段（图4.1）。64 随后经过融合PCR技术，扩增获得了含PmeI酶切位点的片段并成功克隆获得了P2ImT-Pme载体。4.3.2表达EGFP和HA基因载体的构建通过PCR克隆获得了720bp的EGFP基因和1704bp的HA基因，通过PmeI酶切位点将他们分别克隆至P2ImT-Pme载体中，再经过AgeI和AscI酶切后，连接到TVT-P1534骨架中。EGFP基因中由于含多个HindIII酶切位点，因此没有选择酶切，而是测序确认。TVT-GM-Im-HA中的HA基因由于不含有HindIII酶切位点，因此通过酶切后的大小分别约为9.6kb，6.2kb，3kb和1.3kb（图4.2）。图4.1含PmeI片段的分段PCR扩增Figure4.1ThePCRresultsoffragmentsflankedPmeIcuttingsiteM1：DL2000Marker；M2：DL5000Marker；1~6分别为290bp和3629bp扩增产物；7为阴性对照M1:DL2000Marker;M2:DL5000Marker;1~6:fragmentsinlengthof290bpand3629bp;7:Negativecontrol图4.2质粒TVT-GM-Im-HA酶切鉴定Figure4.2EnzymedigestionofTVT-GM-Im-HAplasmidM1：DL5000Marker；M2：DL10000Marker；1~3为HindIII酶切TVT-GM的产物M1:DL5000Marker;M2:DL10000Marker；1~3:EnzymedigestionofTVT-GMbyHindIII65 4.3.3表达EGFP和HA基因重组病毒的拯救按照3.2.4中的方法，通过TPCK胰酶添加，成功拯救出具有血凝活性的rGM-Im-EGFP（图4.3），其血凝价分别为4log2和5log2。然而rGM-Im-HA却未能获得拯救。4.3.4重组病毒rGM-Im-EGFP稳定性的测定重组病毒rGM-Im-EGFP由于能够表达EGFP，因此在细胞中极易被观察到。为此，利用CEF感染rGM-Im-EGFP后，添加TPCK胰酶24h时观察，发现细胞中发出明显的绿色荧光，而对照组则没有荧光（图4.4）。通过测序进一步确认了插入的EGFP序列完全正确（图4.5）。经过传代测序后发现rGM-Im-EGFP的序列稳定，不发生回复突变。不过rGM-Im-EGFP的HA效价一直稳定在6log2，其EID50也维持-7.3~10-7.8/0.2mL，较亲本毒的HA和EID在1050分别下降了16倍和1000倍。图4.3拯救后重组病毒rGM-Im-EGFP的血凝效价Figure4.3TheHAtitersofrGM-Im-EGFPaftervirusrecovery4.3.5重组病毒rGM-Im-EGFP致病性、生长曲线等指标的测定经测定，重组病毒rGM-Im-EGFP的ICPI值为0，而MDT值为128.2h，说明病毒为弱毒株。该病毒体外生长特性表明，rGM-Im-EGFP的复制速度在前期更快，尤其是6h时病毒已经生长至约100TCID50/0.1mL。然而24h后，重组病毒的复制能力减弱，滴度也不如亲本毒株高。24h前rGM-Im-EGFP比rGM-Im高1个滴度，而24~72h时结果恰恰相反（图4.6）。66 ABC图4.4重组病毒rGM-Im-EGFP感染CEF后的荧光Figure4.4ThefluorescenceofrGM-Im-EGFPafterinfectionofCEFA：普通视野的CEF；B：A视野下的细胞荧光；C：阴性对照A:CEF;B:FluorescenceofpictureA;C:Negativecontrol图4.5重组病毒rGM-Im-EGFP与GM株的序列比对Figure4.5ThealignmentofrGM-Im-EGFPandGM图4.6重组病毒rGM-Im-EGFP和rGM-Im体外生长曲线Figure4.6MultistepgrowthkineticsofrecombinantvirusrGM-Im-EGFPandrGM-Im4.4讨论以新城疫病毒为载体插入外源基因的关键是使外源基因能够成功表达，这就需要遵循新城疫病毒复制的一些规则。首先插入位点选择在P和M基因之间是最常见的，尽管该位点不会使外源表达量最高（Huangetal,2001），但却是最佳的（Kimetal,67 2010）。引入外源基因的方式多采用自身或者突变获得的酶切位点，同时为了保证外源基因的复制，需要将NDV基因通用的GS（GeneStart）和GE（GeneEnd）序列置于外源基因ORF两侧，此外还要保证插入序列必须是6的倍数，即遵循6碱基规则（Huangetal，2001）。由于向全长cDNA克隆中直接连接外源基因时，二者片断差异太大，因此本研究利用含P2的质粒为媒介，通过突变获得PmeI酶切位点，再将外源片断（EFGP/HA）连接入其中，最后再将含外源基因的片断克隆至骨架质粒中，这样也避免了平末端连接效率低下的问题。插入外源基因对病毒复制的影响不一。多数研究结果对病毒复制的影响较低，然而也有一些研究表明，插入外源基因能够导致病毒滴度降低100倍（Huangetal,2001）。本研究通过插入EGFP基因后能够成功拯救重组病毒rGM-Im-EGFP，但是该重组病毒的HA效价下降了16倍，EID50下降了近1000倍，同时生长滴度下降了约10倍，这说明插入外源基因对病毒复制能力影响较大。同时，重组病毒ICPI和MDT值的下降也从侧面印证了插入外源基因对病毒毒力的影响。有研究表明，使用与插入位点后面一个基因相一致的调控区序列能够使外源基因的表达量增高（Kimetal,2010），因此如何优化插入基因前的非编码序列以提高重组病毒的复制能力有待进一步研究。通过感染CEF细胞，证实了所拯救的重组病毒rGM-Im-EGFP能够表达外源基因，即绿色荧光蛋白，这说明使用该方法进行构建是可行的。然而即便插入HA基因的质粒已经构建成功，经过多次尝试后尚未获得成功，这可能是由于未突变HA基因中胞质区序列的原因，因为有研究表明，相同的胞质区能够增加病毒拯救的效率（Samaletal,2011）。因此，后续研究将进一步优化构建方案，以实现外源基因的高效表达。4.5小结成功构建了表达标记蛋白EGFP和H5亚型禽流感HA基因的重组质粒，并拯救出表达EGFP的重组病毒，为新城疫活载体疫苗的研究奠定了基础。68 第5章全文讨论与结论5.1全文讨论ND是严重威胁家禽养殖业的重大疫病之一。尽管采取了密集免疫措施，但该病仍然时有发生，养殖场面临的防疫压力巨大。目前，世界范围内至少发生过4次ND大流行，每次几乎都与亚洲国家有关，而远东和中东地区被认为是大流行毒株的来源地。尽管ND只有1个血清型，但其流行的基因型较多。我国自1997年在鹅群中首次发现基因Ⅶ型毒株以来，该基因型迅速占据优势，长期流行。Liu等（2003）分析表明，基因Ⅶ型毒株在南方鸡群和鹅群中呈流行态势，随后分离的一些毒株几乎都是强毒株（Liuetal,2007；Liuetal,2008）。不过Liu等（2003）发现LaSota疫苗免疫后仍然能够100%保护。然而，Yu等（2001）发现，Ch/A7/96株能够突破LaSota疫苗株的保护，免疫保护率仅40%。Qin等（2008）同样发现LaSota疫苗对基因Ⅶ型毒株仅能提供部分保护。研究表明，不同基因型之间的NDV存在一定抗原性的差异（Milleretal,2007），因此开发出与流行毒株基因型相匹配的疫苗无疑是解决问题的一个重要手段。传统的疫苗研发方法可以直接利用强毒株接种鸡胚或者细胞灭活后制备疫苗或者连续传代致弱制备弱毒苗。然而强毒株制备疫苗存在毒价低、易散毒、成本高的缺点，而传代致弱的弱毒苗驯化周期长。反向遗传操作技术的出现及成熟加快了疫苗研发进度，禽流感系列产品的成功就是该技术实现从实验室到工业生产转化的最佳证明。目前，基因Ⅶ型新城疫重组疫苗业已问世，不过由于生产企业不多，因此市场需求大。为了满足市场需求，本研究利用HA效价达到8log2的GM株为亲本毒株，构建了其全长cDNA克隆。为了保证克隆的稳定性，选择低拷贝质粒TVT。在克隆过程中，一些大片断与T载体连接时通常效率低下，最终我们发现pJET1.2/blunt效果较好。然而为了保证成功率，有时候仍然难免进行分段克隆。In-Fusion技术由于不受酶切位点的限制，因此也是一个实用的克隆方法。为了获得纯化的病毒，本研究利用蚀斑法进行了3轮病毒纯化，在高保真酶扩增下获得了准确的基因序列。由于NDV基因组的3’和5’端都较保守，因此无需进行RACE。为了区分亲本毒和重组毒，本研究通过1个同义突变引入AscI酶切位点（ggtgcgcc→ggcgcgcc）。事实上，这也是必要的鉴别手段，因为实验室内的污染也是必须考虑的。本研究选择了成熟的T7系统，尽管PolⅡ系统成功的报道也不少见，69 但多数研究还是使用了T7系统（见1.1.2）。在整个克隆过程中，保持序列的一致性较重要，然而克隆过程出现突变也是允许的（Peetersetal,2001），并且对病毒拯救没有影响。除分子标签外，GM基因组克隆过程中还发生了G430T、C4584A、A6927C、G7091A和A7644G突变，它们导致了NP蛋白D103E，F蛋白P12H以及HN蛋白R225H的突变。研究表明，这些突变并没有影响病毒的拯救。辅助质粒的效率及拯救系统的验证是利用微基因组来完成的，在此基础上，本研究成功拯救出rGM。rGM以及随后拯救的初代重组病毒的HA效价低可能是由于选择T7系统而没有加入额外G造成的，因为HamRz和HdvRz的核酶组合对病毒的拯救效率有提高作用，而T7启动子后面如果是G则有利于转录（Schnelletal,1994）。不过经过1~3代鸡胚传代后，病毒就能够迅速升高至和亲本毒相一致的滴度并保持稳定，这说明初代病毒的复制能力稍弱。经过测序发现，所有重组病毒的分子标签和突变位点都具有良好的稳定性，不会发生回复突变。尤其是致弱毒株，已经有研究表明，致弱毒株在鸡体内进行传代后病毒复制能力越来越弱（Xiaoetal,2012）。由于rGM体外生长曲线和ELD50均明显强于亲本毒GM，因此NP蛋白D103E，F蛋白P12H以及HN蛋白R225H的突变可能影响了病毒的复制能力，不过这有待进一步研究证实。强毒株GM反向遗传操作平台的建立为基因Ⅶ型疫苗、活载体疫苗以及新型标记疫苗的研制奠定了坚实基础。众所周知，新城疫F蛋白裂解位点是毒力的主要决定因素。为了致弱GM株，我们采用了2套方案，即突变成常用疫苗株LaSota样的裂解位点112GRQGRL117和天然弱毒株ClassI常见毒株一样的裂解位点112ERQERL117。由于疫苗株LaSota的毒力比ClassI常见毒株强，因此除了致弱外，这也是裂解位点差异的一个比较。结果显示正如我们预期的一样，含112ERQERL117的重组毒株无论是MDT还是ICPI更接近于ClassI毒株的特征，而含112GRQGRL117的重组毒株则与LaSota株的特征较接近。这从侧面也证实了裂解位点的112位和115位非碱性氨基酸对毒力也有一定的影响。通过灭活疫苗和活疫苗免疫试验发现，尽管活疫苗诱导的HI抗体水平略低于灭活疫苗，但他们都能够起到良好的免疫保护作用。GM强毒攻击结果显示，以基因Ⅶ型疫苗免疫的鸡在排毒时间和排毒率上要优于LaSota疫苗。不过活疫苗的复制能力比LaSota疫苗强，这可能是强毒株骨架的其他基因参与了病毒的复制，因为新城疫病毒毒力是多基因决定的（Dortmansetal,2011）。为了解决临床实践中禽流感灭活疫苗产生细胞免疫能力不足的问题，本研究试图进行活载体疫苗的研制，以达到一针防两病的目的。首先，利用突变技术在最佳插入70 位点引入PmeI酶切位点，并随后克隆EGFP基因以验证插入外源基因的表达能力。然而，成功拯救带EGFP基因的重组病毒后，其HA效价大幅降低，伴随着EID50和体外生长滴度的降低。这说明插入外源基因对病毒复制能力影响较大，因此需要进一步优化插入基因以及他们两侧GS和GE基因的序列及其长度。尽管插入HA基因的质粒已经构建成功，但尚未获得成功拯救，这可能和胞质区序列有一定关系（Samaletal,2011）。因此后续的活载体疫苗研究仍有待优化。5.2全文结论5.2.1本研究建立了基因Ⅶ型新城疫病毒GM株的反向遗传操作平台。5.2.2本研究成功拯救出裂解位点突变的致弱重组病毒rGM-Ⅶm和rGM-Im，证实裂解位点第112位和115位非碱性氨基酸之间的差异也能影响病毒毒力。5.2.3无论是重组病毒灭活疫苗还是活疫苗都能诱导7日龄SPF鸡产生良好的免疫力，能够抵抗GM强毒株的攻击，在减少排毒时间和降低排毒率上优于商品LaSota疫苗。5.2.4成功拯救出表达EGFP的重组病毒，为新城疫活载体疫苗的研究奠定了基础。5.3论文创新点5.3.1利用T7启动子、HamRz和HdvRz核酶元件，在不依赖额外鸟嘌呤（G）的条件下成功构建了拯救基因Ⅶ型新城疫病毒GM株的反向遗传操作系统。5.3.2证实了F蛋白裂解位点为E112和E115的重组病毒rGM-Im比G112和G115的重组病毒rGM-Ⅶm的毒力更弱。5.3.3证实了基因Ⅶ型重组灭活疫苗和活疫苗的效果均优于相应的LaSota疫苗。71 致谢一篇论文的完成，不仅仅倾注着研究者的心血，更凝聚着导师的期盼、教诲和关爱。在此，首先向导师任涛教授表示最崇高的敬意和最衷心的感谢。论文的研究过程也是个人成长的过程，从论文选题、试验设计和实施，一直到论文的撰写等方面导师都给予了精心的指导。尽管科学研究的道路并不顺利，但导师给予了我不懈的支持与鼓励。在导师身上，我学到了严谨的治学态度、勤奋忘我的工作精神以及积极乐观的人生态度，这将指引了我的一生。五年求学路，难忘师恩！感谢广东省农业科学院动物卫生研究所的领导、同事在我求学期间给予的关心、帮助和支持！科学研究往往不是一帆风顺的，在遇到困难的时候许多老师都给予了热情帮助。感谢樊惠英教授、亓文宝教授、焦培荣副研究员、宁章勇教授、徐成刚高级实验师和贾伟新高级实验师在试验中给予的关心、鼓励和支持！衷心感谢传染病学教研室所有老师的热情帮助！此外还要感谢高诗敏博士、汪招雄博士和博士研究生韦娜娜、李亚玲、谢鹏、康银峰、向斌以及硕士研究生林秋燕、高佩、李艳玲、谭阳通、冯敏莎、朱雯娴、梁健鹏、于得水以及其他未能一一列出姓名的师弟师妹们，感谢你们在试验过程的支持和帮助！本研究是在华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室和广东普通高校人兽共患预防与控制重点实验室完成。本课题在研究过程中得到了国家自然科学基金项目（项目名称：鸡源、鸭源NDV致病性差异的分子机理研究，项目编号：31072319；项目名称：细胞NF-κB和IRF7信号转导途径介导的固有免疫反应对NDV复制影响的研究，项目编号：31372412）；公益性行业（农业）科研专项项目（项目名称：鸡新城疫防控技术研究与示范，项目编号：201303033）；广东省战略性新兴产业核心技术攻关（项目名称：生物反应器生产高效动物疫苗关键核心技术研究及产业化，项目编号：2012A020800006）以及教育部博士学科点专项科研基金（项目名称：NDVv/w蛋白对CEFNF-κB和IRF7信号转导途径调控机制的研究，项目编号：2012440411016）的资助，特此表示感谢！72 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