犬瘟热病毒反向遗传学操作系统的建立及其作为活病毒疫苗载体的研究

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1、分类号：单位代码：密级学号：蝴，戈犬令博士学位论文犬瘟热病毒反向遗传学操作系统的建立及其作为活病毒疫苗载体的研究研究生李智丽指导教师刘维全教授申请学位门类级别理学博士专业名生物化学与分子生物学研究方动物分子病毒学所在学生物学院二一五年六月ChinaAgriculturalUniversityPh.D.DissertationConstructionofreversegeneticsystemofcaninedistempervirusandevaluationofitspotentialasalivevaccinevect

2、orPh.D.Candidate:ZhiliLiSupervisor:Prof.WeiquanLiuMajor:BiochemistryandMolecularBiologyResearchField:AnimalMolecularVirologyCollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversityBeijing100193,China.Jun2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中已经注明引用

3、和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：嗜爾时间：年（月关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人吋总屮国农业火学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被査阅和借阅：本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内咨授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优

4、秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：时间：月：曰导师签名：时间月摘要犬痕热病毒（属于副粘病毒科麻疫病毒属，病毒粒子有囊膜，基因组为单股负链，大小为。自基因组的’端至’端，依次为’引导序列、结构蛋白（、、、、、基因、’尾随序列。可感染肉食目大多数动物而致病，免疫接种是目前唯一有效防治该病的措施。不分节段单股负链病毒（由于其只在细胞质复制，避免与宿主基因组发生整合，安全性高；病毒各蛋白的模块式表达方式，方便外源基因的表达；病毒基因组包装容量大，可插入长达的外

5、源基因；外源基因于重组病毒中能稳定、高效的得到表达等诸多优点，常用作重组疫苗载体的研究。作为的员，有极大的作为活病毒疫苗载体的潜力。本课题拟建立弱毒株反向遗传学操作平台，并探究其用作活病毒疫苗载体的潜力。对本实验室保存的弱毒株进行序列测定，在此基础之上，分段对全长进行扩增，最后利用无缝连接技术构建病毒基因组全长克隆载体，并于基因组’端引入聚合酶启动子，’端引入丁肝核酶序列。构建核衣壳蛋白、、基因的辅助表达载体。建立了一株稳定表达聚合酶的细胞系将上述各质粒共转染该细胞系成功拯救了。将基因插入基因组、之间的非编码区，拯救成功的

6、重组病毒感染细胞内有绿色荧光蛋白的产生，证明可作为载体表达外源蛋白。进一步，分别将狂犬病毒（株蛋白和水貂肠炎细小病毒（蛋白基因插入病毒基因组，拯救重组病毒和并探究作为活病毒疫苗载体的能力。实验结果证实，感染细胞内蛋白得以表达，且插入到重组病毒粒子的囊膜中。免疫小鼠和狗，二者体内均能产生抗和的中和抗体证明具有双价疫苗的潜质，具有活病毒疫苗载体的能力。重组病毒，基因的插入虽然不影响病毒的拯救，但病毒感染的细胞内检测不到的表达。将端一段具有抗原表位的小肽段基因与蛋白基因进行无缝连接，重组病毒感染细胞内虽然有外源蛋白的表达，但将重

7、组病毒免疫小鼠，免疫小鼠血清中未能检测到的中和抗体。具体原因有待进一步研究。本课题成功构建了反向遗传学操作平台，并证实具有一定的活病毒疫苗载体的潜质。关键词：犬瘟热病毒、病毒拯救、活病毒疫苗载体、狂犬病毒蛋白、水貂肠炎病毒蛋白AbstractCaninedistempervirus(CDV)isanenveloped,single-stranded,negative-senseRNAvirusoftheMorbillivirusgenuswithinthefamilyParamyxoviridae.ThesizeofCDV

8、genomeis15690nucleotideswithashort3，，，，，immunizationofmicewiththerecombinantvirusfailedtoelicitprotectiveneutralizingantibodyagainstMEV.Inthestudy,wedev