水疱性口炎病毒印第安纳株反向遗传操作系统的建立及重组病毒的构建

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1、摘要水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)为弹状病毒科成员，主要以节肢动物为媒介传播，可感染啮齿类动物及牛、猪、马等多种动物，也能感染人类，但多为良性经过。VSV主要分为两个血清型，代表株分别为印第安纳株(Indiana)和新泽西株(NewJersey)。引起的水疱性口炎(Vesicularstomatitis，VS)是一种急性高度接触性传染病，本病被国际兽疫局(oⅢ)列为A类疾病，在我国VS为外来动物病，国家进出境动物检疫对象中将vsv列为二类疫病。VSV的基因组是一单股负链不分节段RNA，基因组含有5个功能基因，分

2、别受控于VSV聚合酶复合物特异性识别的转录起始和终止序列(GS和GE)，构成单独的转录单元，在两个转录单元之间可以耐受较大外源片段的插入；VSV可以在绝大多数体外培养细胞上生长，它增殖迅速在短时间内即可达到很高滴度；VSV是一种高效的干扰素诱生剂，且本身对其高度敏感；VSV只在胞浆内增殖，不会整合到宿主细胞基因组内造成细胞转化。VSV的这些特点使其具有巨大的优势和潜力作为一种活病毒载体和肿瘤治疗载体。本研究利用单股负链RNA反向遗传操作技术，在vsv—Ind株的基因组内糖蛋白基因前、后非编码区分别引入两个供外源基因插入的限制性酶切位点并且成功救获了重组病

3、毒rVSV。在此基础上又进一步构建了表达增强绿色荧光蛋白的重组VSV基因组cDNA克隆，成功救获了重组病毒rVSV-EGFP(M／N)；通过免疫荧光、电镜观察、RT--PCR及生长动力学研究，证实救获病毒保持典型的vsv印第安纳株特点。采用传统的蚀斑分析方法比较分析表明，重组病毒rVSV，rVSV-EGFP(M／N)与野生型VSV-Ind的生长动力学曲线及最高生长滴度基本一致。rVSV-EGFP(M，N)在BHK21细胞连续传代10次仍保持绿色荧光蛋白的稳定表达及所有生物学特性不变。本研究填补了国内此项研究领域的空白，成功建立了VsV—Ind株的反向遗传

4、操作系统，为vsv作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。关键词：水疱性口炎病毒；增强绿色荧光蛋白；反向遗传操作StudyontheEstablishmentofReverseGeneticsSystemofVesicularStomatitisVirusIndianaSerotypeandtheConstructionofRecombinantVirusesAbstractVesicularstomatitisvirus(VSV)belongstotheRhabdovirdae．Itisanarthropo

5、d-bornevirusthatprimarilyaffectsrodents,cattle，swineandhorses，anditcanalsoinfecthumansandotherspeciesbutcommonlyharmless．ItisthoughtthatVSVspreadsbetweenhoofedanimalsandrodentsviainsectvectorsThetwoprevalentserotypesofVSVareIndiana(VSV-ind)andNewJersey(VSV-NJ)．VSVcausesvesiculars

6、tomatitis(VS)whichisahighlycontagiousacutedisease．andisdefinedaslistAdiseasebyOIE．InChinaVSisafoieigndisease，anditisclassifiedaslistBdiseaseintheimportandexportexaminationsThegenomeofVSVisanon-segmentednegativesinglem、ra,itiscontainsfivefunctionalgenes．Thetranscniptionofeachgenei

7、scontrolledundertheVSVpolymerasespecificlyrecognizedgenestart(GS)andgeneend(GE)respectively．TheVSVgenomehasabroadtolarenceoffoieigngeneinsertionbetweenthetwoindipendenttranscriptionunit．VSVCallgrowinthemostofprimrycellsandcelllinesandCanreachuptohightiterinshorttime．VSVCallinduce

8、hi【ghlevelexpressionofIFN,alsoitisextrem