坦布苏病毒mm1775株反向遗传操作系统的建立及拯救病毒的生物学特性研究

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1、密级：论文编号:中囯农血科学院学位论文坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立及拯救病毒的生物学特性研究EstablishmentoftheReverseGeneticsSystemofTembusuVirusMM1775StrainandBiologicalCharacterizationoftheRescuedVirus硕士研宄生：闫大为指导教师：李国新研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研究所研究生院2015年6月Secrecy:No.ChineseAcademyo

2、fAgriculturalSciencesDissertationEstablishmentoftheReverseGeneticsSystemofTembusuVirusMM1775StrainandBiologicalCharacterizationoftheRescuedVirusM.S.CandidatesDaweiYanSupervisor：Prof.GuoxinLiDegree：MasterofVeterinaryScienceSpecialty:VeterinaryMedicineJune2

3、015中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：句个知时间：>4年4月jr曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业

4、科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名时间：年月t曰密级:论文编号:中国农业科学院学位论文坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立及拯救病毒的生物学特性研究EstablishmentoftheReverseGeneticsSystemofTembusuVirusMM1775StrainandBiologicalCharacterizat

5、ionoftheRescuedVirus硕士研究生：闫大为指导教师：李国新研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研究所研究生院2015年6月摘要自2010年鸭坦布苏病毒病在我国首次爆发以来，该病给我国鸭养殖业造成了巨大的经济损失。该病主要表现为产蛋鸭产蛋率骤降，并伴有高热、食欲下降、运动障碍等临床症状，严重时可导致鸭死亡。第一株坦布苏病毒分离株（MM1775株），是从马来西亚地区的蚊子体内分离到的。在随后几十年陆续从蚊子体内分离到很多株坦布苏病毒，但却很少有动物感染该病毒的报道。

6、到目前为止，早期坦布苏病毒蚊体分离株在不同动物体内的复制能力、对动物的致病性及在动物间的传播能力等生物学特性尚不可知。了解坦布苏病毒早期分离株与我国现在流行的鸭坦布苏病毒株的生物学特性的差异，对研究坦布苏病毒的致病机制具有重要意义。为了比较MM1775和FX2010这两株病毒基因组序列的差异,本研究测定了MM1775完整的基因组序列。通过5’和3’RACE技术扩增得到MM1775基因组5’和3’末端的序列。利用RT-PCR扩增得到10段两两重叠的涵盖MM1775全基因组的目的片段，序列拼接后得到了MM17

7、75全基因组序列。与FX2010的全基因组序列相比，编码蛋白（C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）依次有5、4、16、21、16、4、8、4、5和18个氨基酸残基不同。这些位点的差异可能决定了两株病毒致病性的差异。使用PCR、克隆和亚克隆等方法将覆盖MM1775基因组全长的3段cDNA插入到克隆载体获得了3个重组质粒。以上述3个重组质粒为模板，利用融合PCR方法扩增得到含有T7启动子的病毒全长cDNA，经体外转录得到感染性的RNA，将RNA转染DF-1细胞后48

8、小时出现细胞病变，当细胞病变达到90%，将细胞上清接种DF-1细胞72小时后，间接免疫荧光试验检测显示接种细胞有特异性的荧光，RT-PCR可以扩增到特异性条带。经序列测定，拯救病毒的全基因组序列与亲本病毒完全一致，表明成功构建了MM1775反向遗传操作系统。本研究比较了坦布苏病毒MM1775拯救毒株(R-MM1775)和2010年在我国分离到的鸭坦布苏病毒FX2010株在鸡胚、小鼠和鸭体内的复制能力和致病性。结果表明，R-MM