猫杯状病毒全基因序列分析及反向遗传操作系统的建立

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1、分类号：S852.65单位代码：10193密级：公开学号：2012703博士学位论文猫杯状病毒全基因序列分析及反向遗传操作系统的建立CompleteGenomeSequenceAnalysisandEstablishmentofReverseGeneticOperatingSystemofFelineCalicivirus学位授予单位及代码：吉林农业大学（10193）学科专业名称及代码：预防兽医学（090602）作者姓名：赵艳丽指导教师：胡桂学研究方向：动物病毒学学位类别：农学博士2017年12月猫杯状病毒全基因序列分析及反向遗传操作系统的建立CompleteGe

2、nomeSequenceAnalysisandEstablishmentofReverseGeneticOperatingSystemofFelineCalicivirus作者姓名：赵艳丽指导教师：胡桂学论文答辩日期：2017.12.01授予学位日期：2017.12答辩委员会主席：丁壮论文评阅人：汪铭书温永俊孙淑红2017年12月摘要猫杯状病毒（felinecalicivirus，FCV）是一个可引起猫科动物传染性上呼吸道疾病的病原体，该病毒在世界范围内流行，可以感染几乎所有的猫科动物。本研究通过PCR方法对分离自吉林省的3株FCVCH-JL1、CH-JL2、CH

3、-JL3进行序列扩增，扩增获得的序列全长分别为7687nt、7710nt和7710nt，并上传到GenBank数据库中。序列分析显示，CH-JL2、CH-JL3株与其它的31个参考毒株相比在3′非翻译区（UTR）多了20多个核苷酸序列，但毒株HRB-SS、WZ-1、XH、12Q087-1和12Q087-5除外。利用DNAstar软件将每个CH-JL株与其它的32个参考毒株的全基因序列、ORFs的核苷酸序列及ORFs的氨基酸序列分别进行分析，结果显示，CH-JL1、CH-JL2和CH-JL3株的全基因序列与参考毒株的相似性分别为76.2%~82.2%、76.8%~9

4、6.4%、76.8%~96.4%。系统进化分析显示，CH-JL1株与参考毒株FB-NJ-13、GD、12Q087-1和12Q087-5形成一个分支。CH-JL2与CH-JL3株密切相关，与其它的参考毒株形成另一个分支。CH-JL1株与CH-JL2、CH-JL3株的遗传距离较远。本实验提供的FCV全基因序列为病毒的流行病学研究提供参考。反向遗传操作系统的建立可以为病毒基因组功能、分子致病机理、新型疫苗、新型RNA病毒载体等方面的研究提供平台。本研究以自主分离到的吉林省FCVCH-JL2株为研究对象，利用RNA聚合酶Ⅱ体内转录系统，构建FCV反向遗传操作平台。采用pc

5、DNA3.1(+)质粒，通过在FCVCH-JL2株基因组5′末端引入锤头状核酶（hammerheadribozyme，HamRz），3′末端引入丁型核酶（hepatitisdeltavirusribozyme，HdvRz），并在病毒基因组内引入一个遗传标记，通过分段克隆的方法，成功构建了FCVCH-JL2株的感染性cDNA克隆，转染猫肾细胞F81，结果没有出现细胞病变，之后通过PCR方法将HamRz序列从质粒中移除，将FCV基因组第一个碱基置于转录起始位置，转染F81细胞后，产生与亲本病毒相同的细胞病变。最后，通过RT-PCR及酶切实验可以检测到拯救病毒的遗传标记

6、，通过间接免疫荧光实验可以检测到拯救病毒的特异性荧光。这些结果表明本实验成功建立了FCVCH-JL2株的反向遗传操作系统。经测定拯救病毒的滴度为6.3×106IU/ml，拯救病毒与亲本病毒具有几乎相近的增殖曲线。I关键词：猫杯状病毒，全基因序列分析，病毒拯救，反向遗传学，RNA聚合酶Ⅱ体内转录系统IIAbstractFelinecalicivirus(FCV)isahighlyprevalentpathogenthatcancauseaninfectiousfelidupperrespiratorytractdisease.FCVcirculatesworldwi

7、deandcanaffectallfelidsinanyagegroup.AllfelidsaresusceptibletoFCV.InthisstudythreeFCVstrainsCH-JL1,CH-JL2andCH-JL3weresequencedbyPCRtechnique,thelengthofamplifiedcompletesequencewas7687nt,7710nt,7710nt,respectively,andthethreeFCVfull-lengthgenomicsequencesforCH-JL1,2and3weresubmittedt

8、otheG