《伪狂犬病毒pUL37、VP16、VP22单抗制备及免疫电镜方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
密级：论文编号：中国农业科学院学位论文伪狂犬病毒ｐＵＬ３７、ＶＰ１６、ＶＰ２２单抗制备及免疫电镜方法的建立ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＭｃＡｂｓａｇａｉｎｓｔＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓＵＬ３７ｐ，ＶＰ１６ＶＰ２２ａｎｄＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＩｍｍｕｎｏｏｌｄＬａｂｅｌｉｎ，ｇｇＭｅｔｈｏｄｓ硕士研究生：刘慧敏指导教师：王靖飞研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院２０１８年６月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文伪狂犬病毒pUL37、VP16、VP22单抗制备及免疫电镜方法的建立TheDevelopmentofMcAbsagainstPseudorabiesViruspUL37,VP16,VP22andEstablishmentofImmunogoldLabelingMethods硕士研究生：刘慧敏指导教师：王靖飞研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2018年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheDevelopmentofMcAbsagainstPseudorabiesViruspUL37,VP16,VP22andEstablishmentofImmunogoldLabelingMethodsM.S.Candidate：LiuHuiminSupervisor：Prof.WangJingfeiDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinaryMedicineJune2018 独创性声明本人声明所里交的论文是我个人在导师指导：５进行的研宄工作及取得的研宄成果，尽我所知ｔ除了文中特别加以标注和致谢的地方外．论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位ｙ或证书而使用过的材料一Ｉ与我（ＴＩ作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意．研宄生签名时间：年彡月ｑ日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院存关保留、使用学位论文的规定？即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允ｉ午论文被査阅和借阅，可以采用彩印、缩印或扫描等复制手段保存。、汇编学位论文间意中園农业科学院可以用不网方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容９研宄生签名：时间：年５月３１曰：导师签名：时间Ｖ年Ｙ月？／ｆ 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表ＵＬ？论文题目伪犴犬病沿３７、ＶＰ１６、ＶＰ２２中抗制浴及免疫屯镜方法的述、：ｐ：＞论文作者刘慧敏专业兽医学研宂方向丨！丨丨指导教师王靖飞研究员培养单位（研究所）哈尔滨兽医研究所＇１姓名职称Ｔ－位々业签名评硕乳：｜阅＾、ｍ＼＼｝ｒ＼上腳福教授碰版科人％免龄纟￥ｐ雷连成教授吉林大学预防鲁医学李艳华教授东北农业大学，基础兽医学答哈预＿学鱗安同庆職员麵躯学：硕导丨－；员、博译丨；—硕迂丨：硕导ｒ＿＿Ｊ＿＿＿＿Ｊ博士会议记录（秘书）汤艳东？论文答辩时间地点？合尔浪铃振研宄所饽陵学院丨教２０丨８年５Ｍ丨８Ｈ丨３点 摘要伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的可感染多种哺乳动物的急性传染病。猪是PRV的自然宿主，感染可造成怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，新生仔猪急性死亡。PRV属于疱疹病毒科，具有疱疹病毒粒子的典型结构，其中，被膜层是一个复杂的蛋白网络，位于衣壳和囊膜之间。由UL37、UL48、UL49基因分别编码的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒复制及装配中执行着不同的生物学功能，研究这些蛋白的功能对新的抗病毒靶点筛选具有重要意义。然而，对这些蛋白进行检测和定位的方法还没有建立起来。本研究，首先将UL49、UL48、UL37基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS，并采用KCl染色切胶法纯化原核表达的蛋白。分别用真核质粒和纯化的蛋白作为抗原，对Balb/c小鼠进行3次免疫。通过细胞融合及单抗特性鉴定试验获得1株稳定分泌VP22蛋白单抗的杂交瘤细胞株3D6；2株稳定分泌VP16蛋白单抗的杂交瘤细胞株1D4、4B6；3株稳定分泌pUL37蛋白单抗的杂交瘤细胞株1E2、2G2、11C3。间接免疫荧光（IFA）和Western-blot试验表明，抗体株均可与相应蛋白特异性结合；经抗体亚类试剂盒鉴定，单抗亚类均为IgMκ；ELISA检测单抗的效价，1D4为1:8000，11C3为1:6000，3D6为1:3000，4B6为1:4000，1E2、2G2为1:32000。测定PRV分离株HLJ-2013的病毒滴度，并将其（0.1MOI）接种于易感性细胞PK15，16h后收集细胞并制备免疫标记用超薄切片。将以上实验获得的单克隆抗体进行1:50，1:100，1:200稀释作为一抗，商品化抗鼠金标抗体1:100倍稀释作为二抗，进行感染细胞内伪狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫标记和电镜检测。通过对免疫电镜结果的分析，筛选出在亚细胞水平结合特异性强的单克隆抗体株：3D6、1D4、1E2，其最佳稀释比例分别为：1:100、1:100、1:200。综上所述，本研究成功制备出针对PRV被膜蛋白pUL37、VP16、VP22的单克隆抗体，为PRV结构研究提供了生物材料；利用单克隆抗体建立了在PRV感染细胞内pUL37、VP16、VP22蛋白的免疫胶体金标记方法，为这几种蛋白的功能及被膜装配机制的研究提供了技术手段。关键词：伪狂犬病毒，被膜蛋白，单克隆抗体，免疫电镜I AbstractPseudorabies,causedbypseudorabiesvirus(PRV),isanacuteinfectiousdiseaseinvariousmammals.Sowsarethenaturalhostsofthevirus.PRVinfectionsmayresultindeathofthefetuses,abortioninsowsandacutedeathinpiglets.PRVbelongstothefamilyHerpesviridae,andhasthetypicalfourlaysstructure.Thetegument,lyingbetweenthecapsidandtheenvelope,composesalayerofredundantproteins.PUL37,VP16andVP22encodedbyUL37,UL48,UL49separately,playdiverserolesintheviralreplicationandassembly.StudyontheseproteinsisofgreatsignificancetoexploringnewantiviralmechanismforagainstthePRVinfections.However,methodsforthedetectionandlocalizationofthosethreeproteinsinPRVinfectedcellshavenotbeenestablishedyet.Todevelopmonoclonalantibodies(McAbs),theUL49,UL48,UL37genesweresubclonedseparatelyintopCAGGSandtheexpressedprokaryoticproteinswerepurifiedbygelslicesafterKClstaining.Thepreparedplasmidsandpurifiedproteinswereusedasimmunematerialsandinjectedintramuscularlyinto6-week-oldBalb/cfemalemice.Threedaysafterthelastimmunization,thecellfusionexperimentswereperformedbyfusingSP2/0cellswithspleencellsofBALB/cmiceimmunized.SixstrainsofMcAbswereobtainedandnamed3D6(VP22),1D4(VP16),4B6(VP16),1E2(pUL37),2G2(pUL37),and11C3(pUL37),respectively.Boththeassays,indirectimmunefluorescence(IFA)andWestern-blot,showedthattheselectedMcAbscouldspecificallyreactwiththecorrespondingproteins.ThesubclassofallthoseMcAbswereprovedtobelongtoIgMκ.ThetitersoftheMcAbs1E2,2G2,1D4,11C3,4B6,and3D6weredeterminedtobe1:32000,1:32000,1:8000,1:6000,1:4000,1:4000,and1:3000,respectively.PRVstrainHLJ2013wasinoculatedintosusceptiblecellsPK15at0.1MOI.Sixteenhoursaftertheinoculation,theinfectedcellswerecollectedandultrathinsectionsampleswerepreparedforthefollowingimmunogoldlabelingexperiments.TheMcAbsobtainedfromaboveexperimentswereatdilutionsof1:50,1:100,and1:200asprimaryantibodies,andcommercializedstandardanti-mousegoldlabeledIgG(1:100dilution)wereusedassecondaryantibodies.TheVP22,VP16andpUL37proteinsexpressedininfectedPK15cellsweredetectedbyelectronmicroscopy(EM).AnalysesoftheEMimagesshowedthatMcAbs3D6,1D4and1E2showedhighspecificityforlabelingVP22,VP16,andpUL37,respectively,andtheoptimizeddilutionsforimmunogoldlabelingmethodswere1:100(3D6/1D4),and1:200(1E2).Insummary,McAbsagainstpUL37,VP16andVP22weredevelopedinthisstudy.UsingtheseMcAbsasprimaryantibodies,wealsoestablishedandoptimizedtheimmunogoldlabelingmethodsfordetectingthethreeproteinsVP22,pUL37,VP16inPRVinfectedcells,whichprovidestechnicalsupportforstudyingfunctionsofPRVVP22,pUL37,VP16andthemechanismofPRVtegumentassembly.Keywords:Pseudorabiesvirus,Tegumentprotein,Monoclonalantibody,ImmunogoldlabelingII 目录第一章前言.............................................................................................................11.1伪狂犬病病毒..................................................................................................11.1.1概述.......................................................................................................11.1.2病毒粒子形态学...................................................................................11.1.3伪狂犬病毒的基因组结构...................................................................11.1.4伪狂犬病毒的结构蛋白及其功能.......................................................21.1.5疱疹病毒被膜蛋白的研究进展...........................................................41.1.6流行病学...............................................................................................51.2免疫电镜研究方法.........................................................................................71.3本研究的目的及意义......................................................................................8第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达..................................................92.1实验材料.........................................................................................................92.1.1细胞、质粒和毒株................................................................................92.1.2主要试剂................................................................................................92.1.3主要仪器...............................................................................................92.1.4主要溶液的配制...................................................................................92.2实验方法........................................................................................................102.2.1引物设计及合成.................................................................................102.2.2PRV全基因的提取..............................................................................112.2.3UL49、UL48和UL37基因的PCR扩增..........................................112.2.4UL49、UL48和UL37基因真核表达载体的构建...........................122.2.5UL48和UL37原核表达载体的构建................................................152.2.6VP16和pUL37蛋白的诱导表达.......................................................162.2.7VP16和pUL37蛋白的纯化...............................................................17III 2.3实验结果........................................................................................................182.3.1UL49、UL48和UL37基因的扩增...................................................182.3.2真核重组质粒的双酶切鉴定.............................................................182.3.3IFA鉴定真核重组质粒在细胞内的表达...........................................192.3.4原核重组质粒pET-28a-UL48/UL37的双酶切鉴定........................202.3.5原核蛋白Vp16和pUL37的诱导表达.............................................212.4讨论...............................................................................................................21第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定.........233.1实验材料........................................................................................................233.1.1实验动物.............................................................................................233.1.2主要试剂和仪器.................................................................................233.1.3主要溶液的配制.................................................................................233.2实验方法.......................................................................................................233.2.1病毒培养与纯化..................................................................................233.2.2间接ELISA方法的建立.....................................................................243.2.3小鼠免疫..............................................................................................243.2.4SP2/0细胞的复苏................................................................................243.2.5饲养层细胞及脾细胞的制备..............................................................243.2.6阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆..........................................................253.2.7阳性杂交瘤细胞的冻存......................................................................263.2.8单克隆抗体腹水的制备......................................................................263.2.9间接ELISA检测杂交瘤细胞的稳定性.............................................263.2.10间接ELISA检测抗体效价..............................................................263.2.11VP22、VP16和pUL37单抗的Western-blot鉴定.........................273.2.12单克隆抗体亚类的鉴定....................................................................273.2.13VP22、VP16和pUL37单抗的IFA鉴定........................................27IV 3.2.14染色体计数试验................................................................................273.3实验结果........................................................................................................283.3.1间接ELISA方法的建立....................................................................283.3.2细胞融合观察.....................................................................................283.3.3阳性杂交瘤细胞株的筛选.................................................................293.3.4间接ELISA检测杂交瘤细胞的稳定性............................................293.3.5单克隆抗体亚类的鉴定.....................................................................303.3.6ELISA检测抗体效价..........................................................................313.3.7Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性.............................................323.3.8IFA鉴定单克隆抗体的特异性...........................................................333.3.9杂交瘤细胞染色体数的检测..............................................................333.4讨论...............................................................................................................34第四章免疫电镜方法的建立...................................................................................374.1实验材料.......................................................................................................374.2实验方法.......................................................................................................374.2.1PRVHLJ-2013病毒毒价的测定.........................................................374.2.2免疫条件的优化.................................................................................374.2.3免疫样品的制备.................................................................................384.3实验结果........................................................................................................384.3.1PRVHLJ-2013株病毒滴度的测定.....................................................384.3.2细胞病变时间的筛选.........................................................................394.3.3一抗的筛选.........................................................................................404.3.4一抗稀释倍数的优化.........................................................................434.4讨论...............................................................................................................45第五章全文结论.......................................................................................................47参考文献.....................................................................................................................48V 致谢.........................................................................................................................55作者简介.....................................................................................................................56VI 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附剂试验IFAIndirectimmunofluorescence间接免疫荧光FBSFetalbovineserum胎牛血清KanaKanamycin卡那霉素PRVPseudorabiesvirus伪狂犬病毒AmpAmpicillin氨苄青霉素USUniqueshortarea独特短区ULUniquelongarea独特长区PKPorcinekidney猪肾细胞HSV-1HerpessimplexvirustypeI单疱疹病毒I型ERKExtracellularregulatedproteinkinases细胞外调节蛋白激酶NLSNuclearLocationSignals核定位信号IEMImmunoelectronmicroscopy免疫电镜TRTerminalrepeat末端重复序列IRInternalrepeat内部重复序列PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应KSHVKaposi'ssarcomaassociatedherpesvirus卡波济肉瘤相关疱疹病毒PEGPolyethyleneglycol聚乙二醇gGravityunit重力单位BSAAlbuminfrombovineserum牛血清白蛋白MOIMultiplicityofinfection感染复数VII 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言第一章前言1.1伪狂犬病病毒1.1.1概述伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒I型(Kluppetal.,2004;RoizmanBaines,1991)，被广泛用于疱疹病毒分子致病机制的研究(Oláhetal.,2015)。PRV在不同的细胞中生长周期不同，感染PK15细胞后的4h便可以检测到病毒粒子(吴博,2017)。感染细胞后2.5h，病毒DNA开始形成，可以检测到晚期mRNAs，3h后可以检测到蛋白产物。在细胞培养中，PRV具有快速的溶细胞性、嗜神经性和神经潜伏性(唐崎,2014)。伪狂犬病病毒在感染神经细胞的过程中必须逆行前进很长一段距离才能到达胞体进行复制(袁振岳,2016)。在感染非神经细胞时，病毒的入侵，转运至胞体，衣壳在胞核内的形成，出核及病毒在胞体内的形成与在非极化细胞内相似(Miranda-Saksenaetal.,2002)。1.1.2病毒粒子形态学伪狂犬病毒粒子具有疱疹病毒颗粒的典型形态结构(Granzowetal.,2001)，都是由四种不同的结构组成：双链DNA与蛋白质缠绕形成高电子密度的核心，呈现正二十面体结构的核衣壳，包被在核衣壳外面的被膜，包围着被膜并且含有病毒糖蛋白的囊膜(Whitleyetal.,1998)。未成熟的病毒颗粒位于细胞核或细胞浆中,多以包涵体形式呈晶状排列或分散存在(郝飞等，2013)。核心加上衣壳，称为核衣壳或裸露的病毒粒子，它是疱疹病毒的重要组成部分，其直径约为85~110nm。衣壳由三层组成，中层和内层是无特定形态的蛋白质薄膜，外层衣壳的形态结构是疱疹病毒科的重要特征，它是按照T=16由162个互相连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒构成(Changetal.,2007)。VP5是所有162个衣壳粒的结构亚单位(Bowmanetal.,2003)，主要组成六邻体和五邻体。X-射线衍射研究表明，被膜是一个很大的不定型结构，作为一个高密度的蛋白网络，它可以不对称的将衣壳和囊膜连接起来，内层被膜由于与衣壳紧密联系，在局部上表现出二十面体的排列(D.H.Chenetal.,1999;NewcombBrown,2010)。被膜在病毒的整个复制周期中起着重要作用，包括将病毒衣壳转运到细胞核，病毒基因表达，衣壳外出和病毒囊膜的组装。研究表明被膜化开始于细胞核，并在细胞质中继续进行，是一个动态的、连续的过程(Loretetal.,2008;ThomasCMettenleiteretal.,2009)。囊膜是源于宿主细胞膜的双层脂质膜，与被膜外层紧密相连(陈利红，2016)。囊膜表面有呈放射状排列的糖蛋白纤突，长约8~10nm(Homaetal.,2013;陆承平，2007)。1.1.3伪狂犬病毒的基因组结构伪狂犬病毒基因组为线型双链DNA，长约145kb，G+C含量高达74%。由于PRV基因组的组成和排列与HSV-1极其相似，因此它的基因命名采用了HSV-1的基因命名法(T.C.Mettenleiter,2000)。PRV感染细胞后，线性化的DNA进入核内进行环化和转录；根据PRV在感染细胞中复制的时序性和级联方式，病毒基因组可以被划分为立早期基因、早期基因和晚期基因三类。第一1 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言个转录的基因是立早期基因，与大多数病毒不同，PRV只有一个立早期基因，编码IE180，该基因在病毒DNA进入核内后立即进行转录，并聚集在宿主细胞核中，能激活多种病毒基因启动子，调动细胞的转录装置从而有效地起始转录，合成各种蛋白质，进而迅速完成病毒粒子的装配。PRV中的一个早期基因EP0在病毒DNA复制前开始转录，在复制开始后达到最高的转录水平。晚期基因主要编码病毒的结构成分，在最后表达。PRV基因组由独特长区段（UL）、短区段（US）及短区段两侧的末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）组成(F.Chenetal.,2012;Kibengeetal.,2013)，短区段的方向可以与长区段方向一致，也可以与长区段相反，从而有两种异构体，含有这两种异构体DNA的病毒具有相同的生物学特性。1.1.4伪狂犬病毒的结构蛋白及其功能伪狂犬病毒整个基因组至少含有70个基因，约编码100多种蛋白质(王林青等，2014)，组成核衣壳，被膜和囊膜的结构蛋白有30多种(胡勤芹等，2003)。病毒糖蛋白、病毒编码酶和非必需衣壳蛋白是决定PRV毒力的主要因素(Benporatetal.,1983)。被膜位于衣壳和囊膜之间，大量关于病毒衣壳、被膜以及糖蛋白的物理性互作的研究都把被膜描述为一个高密度的蛋白网络。二次包膜后的产物以出芽的形式释放到高尔基体小泡中，颗粒与颗粒之间的接触导致了包含小体的形成，而被膜蛋白是产生这种现象的原因(D.H.Chenetal.,1999)。正是由于被膜中冗余蛋白的存在，在细胞培养的过程中可以将其他的被膜蛋白或者细胞蛋白合并入病毒粒子中，从而使病毒适应某些非必须被膜蛋白的缺失。被膜外层的蛋白质主要是通过翻译后的脂质修饰或者与病毒糖蛋白胞质尾区的相互作用，从而有针对性的对二级囊膜化位点起作用(Hollinsheadetal.,2012;Turcotteetal.,2005)。而且，被膜有助于将病毒基因组运送到感染细胞的核心中，被膜蛋白不但能调节感染细胞的免疫系统，而且能指导衣壳通过逆向轴浆运输进入细胞核中，以及病毒基因组的入核。在病毒粒子成熟期间，可以观察到被膜内层在细胞质中的核衣壳上堆积，而被膜外层的蛋白质主要是通过翻译后的脂质修饰或者与病毒糖蛋白胞质尾区的相互作用，从而有针对性的对二级囊膜化位点起作用(Hollinsheadetal.,2012;Turcotteetal.,2005)。被膜的结构还有待进一步的确定，内层被膜的结构主要与UL36（VP1/2）和UL37（pUL37）有关，而且pUL36与pUL37的相互作用是病毒被膜化中最重要的早期步骤(Fanetal.,2015;BarbaraGKluppetal.2002)。对于HSV-1的研究证实，在被膜上存在多种蛋白质，包括UL48基因编码的病毒调控蛋白VP16，以及很多功能性蛋白，主要有UL36、UL37、UL46、UL47、UL49基因编码的蛋白产物(Fuchsetal.,2003b;ThomasCMettenleiter,2002)。而且，在PRV中，同时缺失pUL46、pUL47、pUL48和pUL49这四种蛋白虽不能阻碍组织培养中病毒粒子的装配，但是却大大地削弱了病毒粒子的复制。正是由于大量冗余蛋白的存在，所以某一种蛋白的缺失造成的影响才得以弥补(Fuchsetal.,2003a)。PRV的UL37表达的蛋白pUL37是成熟病毒粒子的组成成分，是PRV的第二大被膜蛋白，可以促进PRV的逆向运输(Krautwaldetal.,2009)，免疫共沉淀和邻位连接试验表明pUL37与PUL20（gK）相互作用，促进细胞质中病毒粒子的包膜(Chouljenko,2014)。缺失UL37的蛋白产物会使细胞质中的二次包膜受损，进而造成衣壳在细胞质中的堆积，而且也会造成病毒复制受到限制(Kluppetal.,2001)。pUL37最初被发现的时候，被认为是非结构化的磷蛋白(Sheltonetal.,1994)，后来通过检测证实是病毒粒子的被膜蛋白(Mclauchlan,1997;Schmitzetal.,1995)。pUL37和pUL36蛋白在所有的α疱疹病毒亚科中是相对保守的，构成被膜最内层的组2 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言成成分（尹贻鑫，2013）。pUL37能够和最大的被膜蛋白pUL36发生相互作用形成复合物，pUL36-pUL37蛋白复合物在被膜和二次囊膜化中起着脚手架的作用(B.G.Kluppetal.,2002;Mijatovetal.,2007)。当pUL37缺失时，病毒的形成过程会严重受损但仍然会继续进行(Kluppetal.,2001)，因此，pUL37对于病毒粒子的形成非常重要，但是对于病毒入侵是非必须的。UL37缺失的PRV病毒，pUL37蛋白的表达可以在细胞中得到补充，但超微结构分析表明，核衣壳在细胞核内的成熟，以及从和周围空间的出芽和释放并未受到影响，然而二次包膜却被大幅度地削弱了，造成了大量含有DNA的核衣壳形成聚合物积聚在细胞质中(Kluppetal.,2001)。在HSV-1和PRV入核的过程中，衣壳需要沿着微管进行双向的和跳跃式的运动进入到细胞核，并且沿着微管的双向运动表明了动力蛋白和马达蛋白被募集到即将合成的衣壳中(Antinoneetal.,2010;G.A.Smithetal.,2004)，最有可能募集马达蛋白的是pUL36和pUL37，因为它们在运输期间一直结合在衣壳上，并且能够在体外募集马达蛋白。UL48基因编码的被膜蛋白VP16（pUL48），对于病毒的复制是必不可少的，而且它还可以通过与细胞转录因子Oct-1和HCF-1的相互作用，来反式激活病毒立早期基因的表达(Campbelletal.,1984;Herr,1998)。作为一个刺激立早期蛋白表达的转导因子，它在早期的PRV中并未被发现。此外，VP16还能调节vhs蛋白的活力，进而抑制病毒mRNA的快速降解(Q.Lametal.,1996)。被膜蛋白pUL47和pUL49也是在成熟的病毒颗粒中较为丰富，这表明在早期的病毒粒子中至少有几种显著的被膜成分不存在，却存在于病毒粒子形态发生的后期。然而，这些蛋白在细胞核中是否与衣壳发生相互作用目前还不太清楚。VP16蛋白的表达发生在病毒复制周期的后期并参与组成成熟病毒粒子的成分，它对于主要立早期基因的高效表达以及成熟病毒粒子的形成是必需的，通过激光共聚焦发现VP16主要在细胞质中，细胞核中只有少量的存在(Fuchs,Granzowetal.,2002)。在α疱疹病毒HSV-1和PRV中，VP16连接了外层和内层被膜(Mossmanetal.,2000)，在PRV和牛疱疹病毒I型中，VP16通过与pUL3.5蛋白相互作用在病毒形成过程中起到了一定作用(N.LamLetchworth,2000)，这在HSV-1中不存在。VP16或pUL3.5这两者的共同缺失会在内层被膜组装结束后的二级囊膜化形成一定缺陷（Fuchsetal.,2007）。UL49基因表达的被膜蛋白VP22（pUL49）有磷酸化和非磷酸化形式，它们在细胞质，感染细胞的细胞核以及成熟的病毒粒子中分布是不同的，表明在不同的位点蛋白成分和功能是不同的，二次包膜理论很好的解释了这一现象(Kluppetal.,2000;Rioetal.,2002)。已有研究发现，VP22可与多种被膜蛋白相互作用，共同参与到病毒被膜的装配中(Kamenetal.,2005;PomeranzBlaho,2000)。在PRV感染的细胞中，VP22和VP16有强而稳定的相互作用，它通过VP16C-末端的激活区控制VP16蛋白的功能(GillianElliottetal.,1995)。VP22与囊膜紧密相连，它能够与糖蛋白gE、gM发生特异性的作用(Fuchs,Kluppetal.,2002;KMaringeretal.,2012)，gE或者gM的存在是病毒结合VP22蛋白所必需的，而且gE和gM的缺失对于病毒粒子形态的形成有严重危害(Bracketal.,1999;Bracketal.,2000)，因此，病毒粒子的糖蛋白-被膜蛋白的相互作用可以保证二次包膜准确进行。病毒囊膜是从高尔基体跨膜区的囊泡中获得的，含有病毒编码的大部分糖基化修饰的蛋白和非糖基化蛋白。目前，在PRV中已发现并被命名的糖蛋白有11种，分别是gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN(Bracketal.,2000)。其中gB、gC、gH、gK、gL、gM、gN是3 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言由位于独特长区（UL）的基因编码，gD、gE、gG和gI由独特短区（US）的基因编码。PRV在感染细胞的过程中会大量产生gG，并将其分泌至细胞外，gB在膜融合的过程中有着重要作用，主要参与到病毒穿入过程中膜的融合，核衣壳被释放到细胞质的过程中，非感染细胞和感染细胞之间的细胞膜融合。PRV的核衣壳顶点是由环状的多聚体复合物形成的门蛋白，形成核衣壳所需的蛋白都是保守的，病毒DNA通过这个门户通道被包装或者被释放。病毒衣壳除了由VP5蛋白质（UL19基因编码）构成外，还包括其他3种含量相对较少的蛋白VP19C（UL38基因编码），VP23（UL18基因编码），VP26（UL35基因编码）(薛念波，2008)。若UL26.5和UL26基因均缺乏，完整的衣壳则不能形成。此外，两个额外的保守蛋白pUL17和pUL25也与病毒核衣壳密切相关，如果缺失与pUL25相关的衣壳蛋白，那么初级囊膜不能产生，PRV的pUL25可以和最重要的大的内层被膜蛋白pUL36的C-末端相互作用，这种相互作用可以发生在细胞核中，pUL17的存在有助于pUL25与异二聚体复合物的结合。1.1.5疱疹病毒被膜蛋白的研究进展疱疹病毒科包括110多种病毒，国际病毒分类委员会规定，根据其生物特性及临床致病特点的不同可以将其分为α、β、γ三个主要的病毒亚科(Bossetal.,2009)。这三种病毒亚科的宿主细胞类型和细胞周期是不同的，α疱疹病毒是一类有较大囊膜的双股DNA病毒，宿主范围广泛，复制较快；β疱疹病毒亚科有最严格的宿主范围和最低的复制速率；γ疱疹病毒通常感染特定的T或B淋巴细胞，并在淋巴组织中建立潜伏感染(RoizmanBaines,1991)。病毒粒子在感染的宿主细胞核内进行复制和包装，因此它们进入和离开宿主细胞核是病毒增殖和扩散的关键，而了解含有多种蛋白质的被膜的形成，对于搞清楚疱疹病毒粒子的内部结构是至关重要的(Mengeling,1991;Nauwynck,1997;Wetal.,2004)。大量关于病毒衣壳、被膜以及糖蛋白的物理性互作中都把被膜描述为一个高密度的蛋白网络，其中pUL46、pUL47、pUL48和pUL49通过与内外层被膜蛋白以及糖蛋白的相互作用，从而在被膜中起着中心组织者的作用，如图1.1所示(Owenetal.,2015)，这些蛋白在成熟的病毒粒子中是最丰富的(Fuchsetal.,2003a)。最近几年关于被膜蛋白之间相互作用的研究取得了很大的进展，在2015年，OwenDJ等人在前人研究的基础上，对核衣壳从感染细胞的细胞核中释放出来并组装成成熟的病毒粒子过程中，分子之间的相互作用进行了研究(Owenetal.,2015)。近年来，关于确定被膜蛋白相互作用的研究取得了很大进展，这有助于被膜装配和二次囊膜化的研究(Owenetal.,2015)。已知的参与PRV感染的被膜蛋白，主要有14种：UL11、UL13、UL16、UL21、UL36、UL37、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49、UL51、US3、US2(余腾，2016)。质谱法测定出宿主细胞外HSV-1蛋白质的组分，鉴别出23个编码病毒衣壳的蛋白，一些宿主细胞酶，分子伴侣蛋白和结构蛋白，其中一些蛋白参与到病毒被膜层(Loretetal.,2008)。通过截短表达，发现了被膜蛋白VP22的两种很关键的核定位信号（NuclearLocationSignals，NLS），NLS1和NLS2，同时缺失这两种核定位信号，会清除积聚的UL49核酸，而缺失其中任何一个，都不会产生这种效果，而且NLS2对UL49的核定位更为重要（QiXLandothers，2014）。在被HSV-1感染的细胞内，发现以被膜蛋白VP22为纽带，最佳复合物gE-VP22-gM-gI-ICP0的形成与病毒粒子形态的高效形成和传播相关(KevinMaringeretal.,2012)。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言被膜蛋白pUL37的表面区域，是一个非常关键的神经入侵感受器，该区域发生突变的HSV-1和PRV粒子，不能通过逆行轴突运输扩散到外周神经节中，选择性地消除病毒的逆向轴突运输的能力，对于哺乳动物神经系统跨突触的研究是很关键的(Richardsetal.,2017)。在UL37的N-末端有一个与细胞的MTCs相似的结构，它控制着膜泡的运输，是病毒的第一个MTCs，并从结构上阐明了UL37对于病毒运输的重要性，进而在此结构突变的基础上，发现了UL37在病毒被运送到细胞连接处后，进行细胞间扩散的过程中起着很重要的作用(Pittsetal.,2014)。PRV被膜蛋白pUL46能够诱导ERK1/2信号通路，并调控NEBD，而且这两种途径是相互独立的(Schulzetal.,2014)。一项人工诱导核胞体形成的研究表明，UL36基因缺失的HSV-1产生的初期蛋白颗粒不能感染多胞体的其他核心；相反，UL37缺失的病毒可以对对其他核心造成感染。而且，HSV-1和PRV缺失pUL36会通过阻止被膜化和囊膜化来阻碍病毒粒子的外出，进而导致初级衣壳在细胞质中的堆积(Desai,2000;Fuchsetal.,2004)。目前，在HSV-1中发现的，一些被膜蛋白在病毒复制和传播中的主要作用如表1.1所示。随着冷冻电镜分辨率的提高，冷冻电镜在病毒基因和蛋白功能的研究及聚合物结构解析中的应用也更为普遍。在分辨率为4.9Å的冷冻电镜下，发现pUL25的二聚物与pUL36和pUL17通过卷曲螺旋形成衣壳-被膜蛋白复合物，并通过PRV和γ-疱疹病毒KSHV重构间的比较，证实了不同亚族之间结构的相似性以及衣壳和被膜界面的差异(Liuetal.,2017)。1.1.6流行病学PR（Pseudorabies，PR）是由PRV引起的，致病性较强，以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种疾病(Pomeranzetal.,2005)。该病感染动物范围较为广泛，在自然条件下可使猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、等多种动物，包括野生动物如水貂、北极熊、银狐和蓝狐等感染发病(Fonsecaetal.,2010)，而猪是本病的自然宿主(BurkhardtPaulsen,1978;Sunetal.,2016)。PRV感染成年猪引起Aujeszky病，又称传染性延髓麻痹病，引起感染猪只产生毁灭性的疾病(Pomeranzetal.,2005)。本病的潜伏期随动物种类和感染途径而不同，最短36小时，最长10天，一般多为3~6天。主要是通过飞沫、摄食和创伤感染，感染公猪可以在交配过程中通过感染病毒的精液将病毒传播给母猪。由于母猪免疫球蛋白不能通过胎盘屏障，而PRV可以通过胎盘垂直传播，因此胎儿感染PRV后，死亡率是100%(李春华等，2008)。随着仔猪月龄增加，病程延长，症状减轻，死亡率也逐渐降低，因此，不同年龄猪的死亡率为0~100%。成年的公猪和母猪常呈现潜伏感染，据有关调查显示成年猪感染后不呈现可见的临床症状，或仅表现为轻微的体温升高，一般不发生死亡，调查证实猪是唯一的感染后可以存活下来的易感物种(Pomeranzetal.,2005)。由于长期带毒但不表现症状，使得整个猪群的免疫力水平低下，而且往往分离不到病毒，只有用聚合酶链式反应（PCR）或者核酸探针才能检测出PRV的存在(Maesetal.,1997)。1813年，伪狂犬病在美国最先被报道(Hanson,1954)，直到1902年，Aujeszky最先提出该病是由伪狂犬病毒引起的。目前，在世界50多个国家和地区均有分布，给全球养猪业造成重大的经济损失(Kluppetal.,2004;Pomeranzetal.,2005;刘澜等，2008)。2012年以来，中国分离并鉴定HNB株、HeN1株、HNX株、TJ株、ZJ01株，HLJ-8株、JS-2012株等20多种PRV新毒株，Bartha-K615 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言疫苗已经不能提供完全的保护(Wangetal.,2014;Yeetal.,2015)。赵青等对国内8个省市进行了2013-2016年PRV野毒抗体监测，发现猪场的PRV野毒感染率均不低于70%，血清样品阳性率为30%~50%，说明我国规模化的猪场普遍存在PRV野毒感染(赵青等，2017)。近几年，欧美一些国家通过使用gE基因缺失疫苗，并定期进行检测，淘汰并销毁，已成功将PR净化(李树清，陈志飞，2002)。在我国，宋春莲等对云南省部分地区72家规模化养猪场的净化效果进行监测，通过PCR检测发现2012-2015PRV感染率呈逐年降低趋势，说明我国的PRV净化工作已经取得一定成效(王钊哲等，2017)。PRV净化实践证明，即使野毒阳性率很高，通过猪伪狂犬疫苗的合理免疫，仍然可以有效减少野毒循环并控制临床症状，再通过生产管理和生物安全措施的合理实施，可以逐步降低猪场的PRV阳性率(祖海涛等，2017)。图1.1蛋白网络图青色：囊膜蛋白；蓝色：被膜蛋白；黄色：衣壳蛋白；红色：棕榈酰基；灰色：肉豆蔻酰基；蓝色虚线：与门户顶点相关的被膜。Fig.1.1Thenetworkofproteins(KMaringeretal.,2012;Owenetal.,2015)Thegreen:Membraneproteins；Theblue:Tegumentproteins；Theyellow:Capsid；Thered:Palmitoylgroup；Thepurple:Myristoylgroup；Thebluedashed:Portalvertexassociated.6 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言表1.1PRV主要被膜蛋白的作用Table1.1PropertiesofprimaryPRVtegumentproteins基因蛋白大小（kDa）蛋白名称功能UL117未知病毒出核UL1341.1VP18.8蛋白丝氨酸-苏氨酸酶UL1634.8未知与UL21互作UL2155.2未知与衣壳相关，与UL16互作UL4140.1VHSRNA酶，基因调控UL3798.2未知病毒外出、与UL36互作UL36324.4VP1/2最大的被膜蛋白、病毒外出、与UL37互作UL3130.4未知核外出、与UL34互作UL4675.5VP11/12未知UL4780.4VP13/14二级囊膜UL4845.1VP16基因调控（反式激活因子）、二级囊膜UL4925.9VP22与UL16、UL48、gE和gM的羧基端互作UL5125未知二级囊膜(G.Elliottetal.,1995;Harperetal.,2010;B.G.Kluppetal.,2002;Leeetal.,2008;Owenetal.,2015)1.2免疫电镜研究方法免疫电镜技术（Immunoelectronmicroscopy,IEM）是一种利用电子显微镜从超微结构水平，通过抗原与抗体的结合，检测样品中抗原存在位置的方法(罗土炎等，2008)。Faulk和Taylor首次将胶体金运用到免疫电镜，该技术具有易于制备、灵敏度高、特异性强、非特异性吸附少、易于辨认、定位精确等优点，在保持原本超微结构的前提上对抗原进行定性、定位分析和观察(杨冬华，覃汉荣，1998)。胶体金是目前应用最广的免疫电镜标记物，被广泛地应用于细胞表面、细胞内抗原的定性定位研究，在细菌、病毒、肿瘤、自身免疫性疾病的研究中得到普遍应用(李东卫，王靖飞，2012;吴鹏等，2005)。胶体金（Colloidalgold），即金的胶体溶液，胶体金的表面带有负电荷的颗粒，介于颗粒间的疏水性和静电排斥力，使它们以溶胶的形式存在于水溶液中。胶体金作为标记物，利用它带负电荷的性质，可以与许多生物大分子共价结合，进行抗体标记，用于免疫电镜负染技术检测相应抗原(程安春，汪铭书，廖德惠等，1994)。在电镜下观察免疫胶体金样品时，由于胶体金电子密度很高会出现强烈的反差，在视野中清晰可辨，有利于超微结构的观察，并很大地提高了检测效果(李锦添，黄宝珍，1992)。IEM分为两类：一类是免疫凝集，通过抗体吸附抗原进行凝集，再利用负染色在电镜下观察；7 中国农业科学院硕士学位论文第一章前言另一类是免疫电镜定位，使带有胶体金的抗体与相应的抗原结合，从而将抗原精准定位。免疫电镜方法对抗原和抗体的要求都非常高，抗原需要有较高的免疫活性，抗体要求要有较高的纯度，最佳选择是单克隆抗体。1.3本研究的目的及意义伪狂犬病毒是一种可引起猪和其他多种哺乳动物感染并发病的重要病原体，其被膜层含有多种蛋白质，这些被膜蛋白在病毒复制及装配中起着关键作用。有报道表明VP22、VP16、pUL37是参与组成被膜的重要蛋白，又同囊膜蛋白和衣壳蛋白存在相互作用。然而，这三种蛋白在病毒复制及装配中的具体作用还不明确。因此，为了更加深入的理解伪狂犬病毒的复制及装配机制，研究这三种蛋白在此过程中的重要生物学功能，需要建立免疫学细胞定位方法。本论文旨在制备出VP22、VP16和pUL37三种被膜蛋白的单克隆抗体，建立免疫电镜胶体金标记平台，为深入研究伪狂犬病毒在感染细胞过程中蛋白在细胞内的定位提供技术手段，也为伪狂犬病毒的防治提供重要的参考。8 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达2.1实验材料2.1.1细胞、质粒和毒株PRVHLJ-2013株由本实验室分离并保存；pCAGGS载体、pET-28a载体、SP2/0细胞、PK15和293细胞均由本实验室保存；DH5α、BL21感受态购自天根生化科技有限公司；PRVHLJ-2013株鼠源阳性血清由本实验室制备并保存。2.1.2主要试剂羊抗鼠IgG-FITC二抗均购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（IgG-HRP）购自Biosharp公司；限制性内切酶和T4QuickDNALigase均购自NEB公司；胎牛血清购自PAN公司；各种限制性内切酶及PrimerSTARHSDNAPolymerase购自Takara公司；甘油购自AMRESCOLIFESCIENCE公司；Tris平衡酚和酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）购自Solarbio公司；氟利昂购自国药集团；甘油购自AMRESCOLIFESCIENCE公司；TMB底物显色液、质粒提取的及胶回收试剂盒均购自天根生物有限公司；蛋白凝胶提取试剂盒购自Invent公司；EDTA-胰酶、PBS购买自哈尔滨兽医研究所诊断和服务中心；考马斯亮蓝及氯化钾粉末均购自天津市致远化学试剂有限公司。2.1.3主要仪器PCR仪、Centrifuge5424购自Eppendorf公司；细胞超净工作台、37℃CO2培养箱、超纯水仪购自ThermoSCIENTIFIC公司；振荡器（MS3basic）购自IKA公司；荧光倒置显微镜购自NiKon公司；AllegraX-30RCentrifuge和AllegraX-15RCentrifuge购自BECKMAN公司；DK-8D型电热恒温水浴槽购自上海一恒科技有限公司；DYY-6C及DYY-TD型电泳仪购自北京市六一仪器厂；ChampGel5000Plus紫外凝胶成像仪购自Sagecreation公司；细菌超净工作台购自HealForce公司；BGZ-3037℃恒温培养箱购自上海沪粤明科学仪器有限公司；IS-RDS3C恒温振荡器购自CRYSTAL公司；蛋白电泳仪和MiniTrans-BlotCell购自BIO-RAD。2.1.4主要溶液的配制LCM缓冲液：30mmol/LTris·HCl（pH7.5），5mmol/LMgCl2，3.6mmol/LCaCl2，0.5mmol/LEDTA，6mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5%NP-40，125mmol/LKCl；TEN：100mmol/LNaCl，10mmol/LTris·HCl，1mmol/LEDTA（pH8.0）；10%SDS：称量10g的SDS粉末，37℃水浴1h溶解在80mL蒸馏水中，定容至100mL；250nmol/LKCl：3.73gKCl粉末加入180mL蒸馏水中溶解，定容至200mL即可；9 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达mTNE：配制终浓度为20mmol/LTris-HCl（pH值为8.0），250mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA的溶液；考马斯亮蓝染色液：将0.25g考马斯亮蓝R-250在45mL蒸馏水中溶解，加入45mL甲醇，10mL冰乙酸，混合均匀，用中性滤纸过滤，室温保存；IPTG诱导剂：称量1.2gIPTG置于50mL离心管中，加入40mL灭菌水，充分溶解后定容至50mL。用0.22μm滤器过滤后分装在1.5mLEP管中，放于-20℃保存备用；0.075MKCl：将0.55875g氯化钾粉末加入80mL蒸馏水中，使其溶解，并定容至100mL，用0.22μm滤器过滤即可使用。2.2实验方法2.2.1引物设计及合成根据本实验室已测通的PRV毒株编码VP22、pUL37、VP16蛋白的UL49、UL48、UL37基因及pCAGGS、pET-28a载体序列设计引物。真核表达系统pCAGGS载体的上游加入EcoRI酶切位点，下游加入SphI酶切位点（粗体部分），并在酶切位点前加入3个保护性碱基（斜体部分）。原核表达系统pET-28a的上游加入EcoRI酶切位点，下游加入HindIII酶切位点（粗体部分），并在酶切位点前加入3个保护性碱基（斜体部分）。引物合成后由博仕生物科技有限公司合成，并根据引物合成报告单将其稀释至10pmoL/µL使用。引物序列如表2.1。表2.1扩增基因所需引物Table2.1DesignedprimersforPCRamplicationofUL49,UL48,andUL37genesFragmentPrimersPrimersequences（5’-3’）length(bp)pCAGGS-UL49-EcoRI-FATAGAATTCGCCACCATGTCCAGCTCGAGAAAGAC744pCAGGS-UL49-SphI-RCGGGCATGCTTATTTATACACTTTTCCCTpCAGGS-UL48-EcoRI-FATAGAATTCGCCACCATGCGCGACGAGGAGTGCGT1242pCAGGS-UL48-SphI-RGCCGCATGCTCACATCTCAAACATGCGGTpCAGGS-UL37-EcoRI-FATAGAATTCGCCACCATGGAGGCGCTCGTGCGCGC2760pCAGGS-UL37-SphI-RATAGCATGCTTATTTGGACACGGCGTCGApET-28a-UL49-EcoRI-FCCGGAATTCATGTCCAGCTCGAGAAAGAC744pET-28a-UL49-HindIII-RCCGAAGCTTTTATTTATACACTTTTCCCTpET-28a-UL48-EcoRI-FTATGAATTCATGCGCGACGAGGAGTGCGT1242pET-28a-UL48-HindIII-RGCCAAGCTTTCACATCTCAAACATGCGGTpET-28a-UL37-EcoRI-FATTGAATTCATGGAGGCGCTCGTGCGCGC2760pET-28a-UL37-HindIII-RCGGAAGCTTTTATTTGGACACGGCGTCGA10 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达2.2.2PRV全基因的提取将PRVHLJ-2013株病毒接种在PK15细胞中，18h后刮下病变细胞收取病毒，经7000×g4℃离心10min，弃上清；在离心管中加入10mL细胞裂解液LCM重悬细胞并剧烈震荡使细胞充分裂解，冰浴15min；加入1mL氟利昂，剧烈震荡5min（此时有气体产生，轻轻地将压紧的盖子拧开放出气体，防止液体喷出），660×g4℃离心10min，取上清，并重复该操作一次；在超速离心管中先加入混合液A（45%甘油和55%LCM）16mL，再加入混合液B（5%甘油和95%LCM）12mL，最后贴壁加入病毒上清液，90000×g4℃离心3h；弃上清，加入10mLTEN缓冲液，在振荡器充分吹散沉淀，加入500µL10%SDS，室温作用5min，加入等体积的Tris平衡酚，轻摇5min，4℃11000×g离心15min；用1mL枪头（剪断一小截）吸取上层水相，转移到新的50mL离心管中，加入等体积酚：氯仿异：丙醇（25:24:1）抽提3次取上清，4℃11000×g离心15min；取上清并加入4.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，-20℃过夜；4℃11000×g离心20min，在超净台中弃掉上清，风干；加入500µLDDH2O溶解离心管底的沉淀，并转移到1.5mLEP管中，测定基因组浓度并做好标记，保存于-20℃备用。2.2.3UL49、UL48和UL37基因的PCR扩增以提取的PRV基因组为模板，利用合成的上、下游引物扩增UL49、UL48和UL37基因，扩增体系如表2.2。表2.2PCR扩增体系Table2.2PCRamplificationsystem组分体积（L）2×PrimerSTARGCBuffer25ddH2O13dNTP5上游引物2下游引物2模板DNA2PrimerSTARHSDNA1Polymerase1总体系5011 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达UL49基因PCR扩增程序为：94℃7min95℃45s60℃1min78℃20s5cycles35cycles86℃3s90℃3s4cycles78℃20s72℃10minUL48基因PCR扩增程序为：预变性95℃5min变形95℃30s退火64℃1min35cycles延伸72℃90s再延伸72℃10minUL37基因PCR扩增程序为：预变性95℃5min变形98℃30s退火62℃1min35cycles延伸72℃3min再延伸72℃10min将PCR产物进行琼脂糖核酸凝胶电泳，观察并分析目的条带的扩增情况，并在紫外灯照射下将目的条带切下，利用胶回收试剂盒回收目的产物。2.2.4UL49、UL48和UL37基因真核表达载体的构建2.2.4.1UL49、UL48和UL37基因及pCAGGS载体的酶切、回收及连接将胶回收的PCR目的基因片段与pCAGGS载体同时双酶切，酶切体系如表2.3。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达表2.3双酶切体系Table2.3Therestrictionenzymedigestionsystemoftargetgenes组分体积（L）EcoRI2SphI210×HBuffer5ddH2O31目的基因片段/pCAGGS10总体系50将反应体系震荡混匀后，瞬离几秒钟，放于37℃水浴反应3.5h，利用1%琼脂糖核酸凝胶检测并切胶。利用胶回收试剂盒回收双酶切的产物，并通过T4QuickDNALigase分别将UL49、UL48和UL37基因与酶切后的pCAGGS载体进行连接。连接体系如表2.4。表2.4连接体系Table2.4Thesystemofligation组分体积（L）2×QuickLigaseBuffer10双酶切目的基因片段6双酶切pCAGGS载体3T4QuickDNALigase1将反应体系混合均匀，于室温条件下连接2h。2.2.4.2连接产物的转化将DH5α从-80℃取出后立即放在冰水混合物中至融化，将连接产物逐滴加到DH5α中，轻轻吹吸几下使其混匀。然后将样品冰浴30min，置于42℃水浴锅中热激90s，立即放于冰上冷却5min。转移到超净台中向DH5α和产物混合液中加入1mL无抗性的LB培养基，放入37℃恒温摇床培养50min，4500×g室温离心5min，留取100μL上清重悬沉淀，用滚珠涂布于Kana抗性的LB平皿上，于37℃温箱培养16h。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达2.2.4.3UL49、UL48和UL37真核重组质粒的鉴定在试管中放入5mLKana抗性的LB培养液，用10μL枪头从平皿中随机挑取几个菌落分别放于不同的试管中，在37℃恒温摇床进行菌液培养16h。留取500μL放于4℃暂时保存备用，其余菌液用于质粒的提取，质粒提取的过程按照天根小提质粒试剂盒的说明书进行。以提取的质粒为模板PCR扩增目的基因片段，通过琼脂糖核酸凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，分析出现的条带，若条带为相应的目的片段大小，可初步判定为阳性。将鉴定结果呈阳性的质粒进行EcoRI和SphI双酶切鉴定，体系如表2.5。表2.5双酶切体系Table2.5Therestrictionenzymedigestionsystemoftargetgenes组分体积（L）EcoRI0.5SphI0.510×HBuffer1ddH2O3重组质粒5将反应体系震荡混匀并瞬离几秒钟，放于37℃水浴反应3.5h，利用1%琼脂糖核酸凝胶对酶切产物进行检测。条带正确的质粒送吉林库美生物科技有限公司进行测序，测序验证完全正确的质粒命名为pCAGGS-UL49，pCAGGS-UL48，pCAGGS-UL37。2.2.4.4IFA鉴定重组质粒在细胞中的表达将293细胞传代至六孔板中（转染前一天晚上），每孔2mL10%FBS不加抗生素的培养基；次日，待细胞密度为80-90%进行转染，转染前30min换成无血清的DMEM培养基1.5ml；在2个灭菌的2mlEP管分别加入250µL无血清的DMEM，一只管中加入5µg重组质粒，另一只加入5μLHP转染试剂，轻轻地将DMEM与质粒混匀，静置5min；用枪头将质粒与DMEM的混合液逐滴加到盛有转染试剂的管中，并轻轻地混匀5~10下；盖上盖子，在超净台内静置20min；将其均匀逐滴加到6孔板中，轻微平晃2下，5h更换为10%FBS不加抗生素培养液，放于37℃CO2培养箱中培养2天左右。弃掉6孔板中的培养液，用0.3%TritonX-100对细胞进行透膜，PBS轻轻洗2次，每孔加入-40℃预冷的无水乙醇500μL，于-20℃孵育20min。弃掉无水乙醇，风干后，用PBS洗一遍并拍干，每孔加入500μL用PBS稀释的鼠源PRV阳性血清，37℃孵育2h。用PBST洗3次，每次5min，并轻轻拍干。每孔加入500μL1:100倍（4℃预冷的PBS）稀释的羊抗鼠荧光二抗，37℃避光孵育1h。用PBST洗3次，每次5min，轻轻拍干。每孔加入300μLPBS于倒置荧光显微镜14 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达下观察。2.2.5UL48和UL37原核表达载体的构建2.2.5.1UL48和UL37基因及pET-28a载体的酶切、回收及连接根据设计的原核引物扩增出UL48和UL37基因，分别进行回收，并将回收得到的基因与pET-28a载体同时进行双酶切，酶切体系如表2.6。表2.6双酶切体系Table2.6Therestrictionenzymedigestionsystemoftargetgenes组分体积（L）EcoRI2HindIII210×MBuffer5ddH2O31回收产物/pET-28a10将反应体系震荡混匀后，瞬离几秒钟，放于37℃水浴反应3.5h，利用1%琼脂糖核酸凝胶检测并切下双酶切后的目的基因片段。利用胶回收试剂盒回收双酶切的产物，并通过T4QuickDNALigase分别将UL48和UL37原核基因与酶切后的pET-28a载体进行连接。连接体系如表2.7。表2.7连接体系Table2.7Thesystemofligation组分体积（L）2×QuickLigaseBuffer10双酶切目的基因片段6双酶切pET-28a载体3T4QuickDNALigase1将反应体系混合均匀，于室温条件下连接2h。2.2.5.2连接产物的转化将BL21从-80℃取出后立即放在冰水混合物中至融化，将连接产物逐滴加到BL21中，轻轻吹吸几下使其混匀。然后将样品冰浴30min，置于42℃水浴锅中热激90s，立即放于冰上冷却515 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达min。转移到超净台中向BL21和产物混合液中加入1mL无抗性的LB培养基，放入37℃恒温摇床培养50min，4500×g室温离心5min，留取100μL上清重悬沉淀，用滚珠涂布于氨苄霉素抗性的LB平皿上，于37℃温箱培养过夜。2.2.5.3UL48和UL37原核重组质粒的鉴定在试管中放入5mLAmp抗性的LB培养液，用10μL枪头从平皿中随机挑取几个菌落分别放于不同的试管中，在37℃恒温摇床进行菌液培养16h。留取500μL放于4℃暂时保存备用，其余菌液用于质粒的提取，质粒提取的过程按照天根小提质粒试剂盒的说明书进行。取5μL提取的质粒，加入LoadingBuffer并混匀，通过进行琼脂糖核酸凝胶电泳对提取的质粒进行鉴定，分析出现的条带，若条带大小为pET-28a载体和质粒片段大小之和，可初步判定为阳性。将鉴定结果呈阳性的质粒进行EcoRI和HindIII双酶切鉴定，体系如表2.8。表2.8双酶切体系Table2.8Therestrictionenzymedigestionsystemoftargetgenes组分体积（L）EcoRI0.5HindIII0.510×MBuffer1ddH2O3原核重组质粒5将反应体系震荡混匀并瞬离几秒钟，放于37℃水浴反应3.5h，利用1%琼脂糖核酸凝胶对酶切产物进行检测。条带正确的质粒送吉林库美生物科技有限公司进行测序，测序验证完全正确的质粒命名为pET-28a-UL48、pET-28a-UL37。2.2.6VP16和pUL37蛋白的诱导表达将保存备用的pET-28a-UL48、pET-28a-UL37和pET-28a空载体菌液分别以1:100接种于5mLAmp抗性的LB培养液中，放于37℃170转恒温摇床培养过夜。次日，将活化的菌液按1:100接种到4mL含Amp抗性的LB培养液中，继续于37℃恒温摇床震荡培养2.5h~3h至OD600达到0.6~0.8。分别取1mL菌液于1.5mLEP管中，12000×g离心5min，弃掉上清液，将沉淀保存于-20℃，作为诱导前对照。向实验组加入IPTG使其终浓度达到0.5mM，同时分别将恒温摇床设置为37℃180转，培养3h、5h、7h收取样品。各取1mL菌液，12000×g离心5min，用900μL含5mM咪唑、150mMNaCl、0.3%TritonX-100的20mMTris溶液（pH=8.0）重悬沉淀，并置于冰水混合物中，用超声破碎仪超声破碎菌体，使菌液变清亮。然后4℃12000×g，离心30min，16 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达收取上清和沉淀。用900μL含5mM咪唑、150mMNaCl、0.3%TritonX-100的20mMTris溶液（pH=8.0）将沉淀和诱导前对照重悬。分别取40μL上清液，沉淀悬液，诱导前对照，空载体对照样品，并加入10μL5×凝胶上样Buffer，充分混匀，放于沸水浴煮沸10min，通过SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达。SDS-PAGE蛋白胶厚度均为1.0mm，VP16和pUL37蛋白配制5%浓缩胶，8%的分离胶。所配制蛋白胶成分如表2.9和2.10。表2.9分离胶成分Table2.9Thecompositionofseparationgel组分8%含量（mL）12%含量（mL）蒸馏水2.31.630%丙烯酰胺1.321.5MTris-HCl（pH=8.8）1.31.310%SDS0.050.0510%过硫酸铵0.050.05TEMED0.0030.002表2.10浓缩胶成分（5%）Table2.10Thecompositionofconcentrationgel组分8%含量（mL）蒸馏水3.430%丙烯酰胺0.831.0MTris-HCl（pH=6.8）0.6310%SDS0.0510%过硫酸铵0.05TEMED0.005将蛋白胶放入考马斯亮蓝染色液中，室温染色2h，然后将蛋白胶放入蒸馏水中，在微波炉中煮沸6min，重复洗5次，至背景清晰，能够看到明显的条带。2.2.7VP16和pUL37蛋白的纯化采用切胶纯化的方法并借助蛋白提取试剂盒对VP16和pUL37蛋白进行纯化。配制蛋白胶时，将梳子制成一个marker孔和整个大孔，以有利于加入更多的样品，提高回收的蛋白浓度，然后进17 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达行常规的SDS-PAGE电泳，首先设置电压为80V，时间设定为20min，使样品跑出浓缩胶，再将电压调为170V，时间设定为1h。结束后，将蛋白胶放入250nmol/L的KCl溶液中负染色5min，蛋白条带呈现乳白色。用刀片将目的蛋白条带切下，PBS洗3次，每次3min，将蛋白带转移至自封袋中碾压至粉碎，转移至200μLEP管中，用微型杵平端加入适量的蛋白提取粉，并向管中加入约100μLPBS，轻轻混匀。涡旋震荡3min，放入PCR仪中，94℃孵育20min，涡旋震荡几下，并继续孵育20min，然后放4℃冰箱孵育过夜。次日，将管中样品放入接收管中，并放入套管，15000×g离心5min，收集管中洗脱下的蛋白溶液，-80℃保存，用于后续的动物免疫及Western-blot试验。2.3实验结果2.3.1UL49、UL48和UL37基因的扩增以大提得到的基因组DNA为模板，通过PCR扩增UL49、UL48和UL37基因，将PCR产物进行琼脂糖核酸凝胶电泳。结果如图2.1所示，目的基因片段UL49约为756bp，UL48约为1242bp，UL37约为2760bp，与预期结果一致。图2.1基因的PCR扩增（A）UL49基因扩增，M:DL5000DNAMarker；1:UL49真核基因；2:UL49原核基因；（B）UL48基因扩增，M:DL2000DNAMarker；1:UL48真核基因；2:UL48原核基因；（C）UL37基因扩增，1:UL37真核基因；2:UL37原核基因；M:DL5000DNAMarker。Fig.2.1PCRamplificationofgenes（A）TheamplificationofUL49gene,M:DL5000DNAMarker;1:EukaryoticgeneUL49;2:ProkaryoticgeneUL49;（B）TheamplificationofUL48gene,M:DL2000DNAMarker;1:EukaryoticgeneUL48;2:ProkaryoticgeneUL48;（C）TheamplificationofUL37gene,M:DL2000DNAMarker;1:EukaryoticgeneUL48;2:ProkaryoticgeneUL37.2.3.2真核重组质粒的双酶切鉴定将确定为阳性的重组质粒pCAGGS-UL49、pCAGGS-UL48和pCAGGS-UL37进行双酶切，酶切后用核酸凝胶电泳检测，双酶切后分别得到两条带，pCAGGS载体条带约为4790bp。结果18 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达如图2.2所示。图2.2真核重组质粒的双酶切鉴定（A）pCAGGS-UL49双酶切，M:DL5000DNAMarker；1:pCAGGS；2、3:pCAGGS-UL49酶切；（B）pCAGGS-UL48双酶切，M:DL5000DNAMarker；1:pCAGGS；2、3:pCAGGS-UL48酶切；（C）pCAGGS-UL37双酶切，M:DL5000DNAMarker；1:pCAGGS；2:UL37基因；3:pCAGGS-UL37酶切。Fig.2.2Theeukaryoticrecombinantplasmidswereidentifiedbyrestrictionenzymedigestion（A）ThepCAGGS-UL49wasidentifiedbyrestrictionenzymedigestion,M:DL5000DNAMarker;1:pCAGGS;2、3:ThedoubledigestionofpCAGGS-UL49;（B）ThepCAGGS-UL48wasidentifiedbyrestrictionenzymedigestion,M:DL5000DNAMarker;1:pCAGGS;2、3:ThedoubledigestionofpCAGGS-UL48;（C）ThepCAGGS-UL37wasidentifiedbyrestrictionenzymedigestion,M:DL5000DNAMarker;1:pCAGGS;2:UL37gene;3:ThedoubledigestionofpCAGGS-UL37.2.3.3IFA鉴定真核重组质粒在细胞内的表达将鉴定为阳性的真核重组质粒pCAGGS-UL49、pCAGGS-UL48和pCAGGS-UL37以及空载体pCAGGS分别转染进293细胞48h后，通过间接免疫荧光（Indirectimmunofluorescence,IFA）检测重组质粒在细胞内的蛋白表达情况。结果如图2.3所示。19 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达图2.3真核重组质粒的IFA鉴定将真核质粒转染293细胞，通过IFA鉴定目的蛋白的表达（A：pCAGGS-UL49；B：pCAGGS-UL48；C：pCAGGS-UL37；D：pCAGGS对照）。Fig.2.3TheeukaryoticrecombinantplasmidswereidentifiedbyindirectimmunofluorescenceassayTheeukaryoticplasmidweretransfectedinto293cells,andtheexpressionofproteinswereidentifiedbyIFA(A:pCAGGS-UL49;B:pCAGGS-UL48;C:pCAGGS-UL37;D:EmptyplasmidpCAGGScontrol).2.3.4原核重组质粒pET-28a-UL48/UL37的双酶切鉴定将确定为阳性的重组质粒pET-28a-UL48和pET-28a-UL37进行双酶切，酶切后用核酸凝胶电泳检测，双酶切后分别得到两条带，目的基因片段的条带和pET-28a载体条带，pET-28a约为5360bp，结果如图2.4所示。图2.4原核重组质粒的双酶切鉴定（A）pET-28a-UL48酶切，M:DL15000DNAMarker；1、2:pET-28a-UL48酶切样品；（B）pET-28a-UL37双酶切，M:DL5000DNAMarker；1、2:pET-28a-UL37酶切样品。Fig.2.4Theprokaryoticrecombinantplasmidswereidentifiedbyrestrictionenzymedigestion(A)ThepET-28a-UL48identifiedbyrestrictionenzymedigestion,M:DL5000DNAMarker;1,2:ThesamplesofpET-28a-UL48digested;(B)ThepET-28a-UL37identifiedbyrestrictionenzymedigestion,M:DL5000DNAMarker;1,2:ThesamplesofpET-28a-UL37digested.20 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达2.3.5原核蛋白Vp16和pUL37的诱导表达将鉴定正确的重组质粒pET-28a-UL48和pET-28a-UL37转化至BL21载体后，加入IPTG分别诱导表达3h、5h、7h，将诱导的菌体超声破碎后进行SDS-PAGE检测。结果表明，UL48和UL37的原核重组质粒均在在37℃180转时产生明显的包涵体表达，诱导7h蛋白的包涵体表达量最高。如图2.5所示，VP16蛋白约50Ku、pUL37蛋白约110Ku，与预期蛋白大小一致。图2.5原核蛋白Vp16和pUL37的诱导表达A：VP16蛋白的诱导。（a-d）VP16上清，a:未诱导；b:3h；c:5h；d:7h；（e-g）VP16沉淀，e:3h；f:5h；g:7h。B：pUL37蛋白的诱导。（h-j）pUL37上清，h:3h；i:5h；j:7h；（k-n）pUL37沉淀，k:未诱导；l:3h沉淀；m:5h沉淀；n:7h沉淀M:ProteinMarker。Fig.2.5TheinducedexpressionoftheVP16andpUL37A:TheinducedexpressionofVP16protein.(a-d)ThesupernatantsamplesofVP16.a:Uninduced;b:3h;c:5h；d:7h；(e-g)TheinclusionbodyexpressionofVP16.e:3h；f:5h；g:7h.B:TheinducedexpressionofpUL37protein.(h-j)ThesupernatantsamplesofpUL37.h:3h；i:5h；j:7h；(k-n)TheinclusionbodyexpressionofpUL37.k:Uninduced;l:3h；m:5h；n:7h;M:ProteinMarker.2.4讨论在本研究中，运用常规的大提基因组方法从伪狂犬病毒中获取基因，保证了扩增体系模板的浓度。由于PRVHLJ-2013的GC含量高达75%，在PCR扩增的过程中，模板DNA形成二级结构，使模板不容易变性，增加了扩增基因的难度(邢玉华等，2013)。通过多次试验尝试不同的扩增程序，并更换rTaqDNA聚合酶，LATaqDNA聚合酶，虽有目的条带但测序比对发现都发生了不同位点的突变，尝试高保真性的PhantaDNAPolymerase进行PCR，却没有发现目的条带的出现。最终筛选出用PrimerSTARHSDNAPolymerase酶并添加2×PrimerSTARGCBuffer能够扩增出特异性强的目的条带，并且不易发生扩增突变。在原核重组质粒诱导的过程中，分别在37℃180转，诱导3h、5h、7h和16℃180转诱导20h、22h、24h、26h筛选蛋白可溶性表达的诱导时间，通过SDS-PAGE检测发现，无论是在37℃还是在16℃，原核重组质粒表达的VP16和pUL37蛋白都是大量存在于超声破碎后的沉淀中，都是不可溶性表达。相对其他条件的蛋白诱导，37℃7h蛋白的表达量较高。所以，最终选21 中国农业科学院硕士学位论文第二章UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达择了37℃7h为最佳的的诱导条件。在诱导VP22的原核表达蛋白的过程中，SDS-PAGE检测表明，无论是37℃还是16℃诱导蛋白的表达量都很低，不利于切胶纯化蛋白的进行。蛋白纯化方法主要有亲和层析法和切胶纯化法，常用的切胶纯化蛋白是用氯化钾进行染色。与亲和层析法相比，切胶纯化蛋白具有低成本，蛋白浓度、纯度都不存在降低的问题(C.SmithSmith,1998)。Western-blot和ELISA试验表明，KCl染色切胶纯化的蛋白，生物活性不发生改变，仍保持天然的抗原性，是一种“性价比”较高的实用方法(高慎阳等，2010)。本实验用KCl染色，切下目的蛋白条带后，用蛋白提取粉，经过94℃高温和4℃孵育，最后将蛋白洗脱到收集管中，进一步保证了蛋白的回收效率。22 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定3.1实验材料3.1.1实验动物6周龄雌性Balb/c（SPF）小鼠，购自维通利华生物有限公司。3.1.2主要试剂和仪器HAT、HT、融合用PEG均购自Sigma公司；QuickAntibody-Mouse3W免疫佐剂购自北京博奥龙免疫技术有限公司；鼠标单抗亚类分型试剂盒购自北京义翘神州生物技术有限公司；酶标仪购自Coster公司；油镜购自Zeiss；甘油购自AMRESCOLIFESCIENCE公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TMB底物显色液购自天根生物有限公司。3.1.3主要溶液的配制2MH2SO4终止液：用量筒量取108.7ml浓硫酸，缓慢倒入盛有600mL蒸馏水的烧杯，用玻璃棒轻轻搅拌，待溶液冷却至室温，转移至1L容量瓶中，用少量蒸馏水冲洗烧杯壁两次，倒入容量瓶，加水至刻度即可。包被液（pH=9.6）：称取1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO₃加水至800mL，溶解完全后，加0.2gNa3N（0.02%），调节pH值至9.6，并定容至1L，用0.22μm滤器过滤，于4℃保存备用。10%吉姆萨染液：称取1g吉姆萨素染料粉末，加入66mL甘油，并混匀，放于60℃水浴锅保温溶解2h，再加入66mL甲醇，混匀，即配成吉姆萨原液。将此原液用PBS（pH6.8）稀释至10倍即可使用。0.4μg/mL的秋水仙素：先配制1.5mL0.4mg/mL的保存液，然后稀释至0.4μg/mL。3.2实验方法3.2.1病毒培养与纯化待PK15细胞铺满单层，接种PRVHLJ-2013（MOI=0.1），细胞完全病变时，收取病毒液并反复冻融3次后，3790×g离心15min，取上清液，经90000×g离心90min，用mTNE重悬沉淀，再用35%的蔗糖垫75000×g离心30min，将沉淀用mTNE重悬，用1mL枪头将其轻轻吹打混匀，然后40000×g离心60min进行脱糖1次，用1mL的mTNE重悬沉淀，沉淀较多时，将重悬样品于4℃800×g离心20min，留取上清液。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定病毒总蛋白含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行。将最终获得的样品放于-80℃保存，用于ELISA试验。23 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定3.2.2间接ELISA方法的建立采用十字交叉法确定包被抗原的最佳稀释浓度和阴阳性血清的最佳稀释浓度，进而建立起ELISA检测方法。用0.05mol/L碳酸盐缓冲液倍比稀释纯化的病毒蛋白，病毒蛋白浓度为4178ng/μL，稀释比例为：1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600每孔100μL，于4℃包被过夜；PBST洗3次，每次5min；用3%BSA（PBST配制）于37℃封闭1h；PBST洗3次，每次5min；用PRVHLJ-2013的鼠源阳性血清按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200（PBS）进行倍比稀释，加到ELISA板中，每孔100μL，于37℃孵育1h；PBST洗3次，每次5min；羊抗鼠IgG-HRP1:5000（PBS稀释）作为二抗，每孔100μL，于37℃作用1h；PBST洗3次，每次5min；每孔加100μLTMB，于室温显色20min，每孔加60μL2mol/L的H2SO4，终止反应，酶标仪测其在OD450nm的吸光值。3.2.3小鼠免疫事先测定pCAGGS-UL49浓度980ng/μL，pCAGGS-UL48浓度1490ng/μL，pCAGGS-UL37浓度1856ng/μl。将30只6周龄Balb/c雌性小鼠，每笼5只，随机分成6笼，标记为A1、A2、B1、B2、C1、C2；每2笼一组，共分为3组：A1、A2为UL49基因组，B1、B2为UL48基因组，C1、C2为UL37基因组。A1、B1、C1进行相应抗原的免疫，A2、B2、C2笼的小鼠均为为阴性对照。免疫重组质粒:将质粒按100μg/只免疫小鼠，首先用酒精棉球擦拭小鼠腿部，分别于小鼠左右后腿内侧肌肉分两点进行注射，并用干棉球轻轻按压几下。间隔15d进行第2次重组质粒的免疫，免疫方法与第一次免疫相同。第21天继续用真核重组质粒pCAGGS-UL49加强免疫A1笼小鼠，免疫方法与第一次免疫相同。免疫蛋白：第21天用pET-28a-UL48和pET-28a-UL37蛋白分别对B1和C1笼小鼠进行加强免疫，免疫前首先测定蛋白浓度。每只小鼠按100μg进行免疫，将QuickAntibody-Mouse3W免疫佐剂与重组蛋白等体积混合，通过小鼠后腿肌肉注射的方法进行免疫。免疫2天后，断尾采血分离血清测定抗体效价，检测结果达到要求后，取免疫小鼠脾细胞进行细胞融合。3.2.4SP2/0细胞的复苏细胞融合的前2周复苏SP2/0细胞，并调整细胞状态。将冻存的SP2/0细胞从液氮中取出，装在PE手套中于37℃水浴进行融化，在超净工作台将其转移至1.5mL的EP管中，200×g离心25min，弃掉上清，加入1mL含20%胎牛血清的DMEM重悬，平铺到25cm细胞培养瓶中，补加5mL培养基，37℃5%CO2培养箱培养4h，更换新的培养液。3.2.5饲养层细胞及脾细胞的制备饲养层细胞的制备：细胞融合的前一天，分别从阴性组笼子各取一只小鼠，摘眼球采血并分24 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定离血清作为阴性对照，然后脱颈致死，并在75%酒精中浸泡10s左右，于超净台中将小鼠背部朝下固定在紫外照射杀菌的解剖板上，用镊子夹起小鼠腹部皮肤并轻轻剪开一个孔，用消毒剪和镊子从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用注射器吸取10mLDMEM培养液注入腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟使培养液浸润腹腔的每一个角落，随后吸出注入的培养液收集腹腔细胞，将液体转移至培养皿中并铺到96孔板中，每孔100μL，置于37℃培养箱培养24-36h，观察饲养层细胞的生长状态良好，即可进行细胞融合。脾细胞的制备：实验组的小鼠摘眼球取血作为阳性血清，将其脱颈致死后在75%酒精中浸泡消毒10s左右，于生物安全柜中将小鼠背部朝下固定在紫外照射杀菌的解剖板上，用镊子夹起小鼠腹部皮肤并轻轻剪开一个孔，用镊子钝性剥离皮肤露出腹腔。用酒精棉球擦拭腹膜并剪开，取出脾脏，用新的剪刀和镊子去掉周围的脂肪组织并用DMEM清洗后转移到盛有15mLDMEM的平皿中，用一次性无菌注射器吸取平皿中的DMEM培养液，将脾脏内的细胞吹出，反复多次，直至脾脏组织无血色，将含有脾细胞的DMEM转移至50mL离心管中，300×g离心10min，弃掉上清，加入新的DMEM将细胞悬起，重复离心一次。细胞融合：弃掉SP2/0细胞的培养上清液，加入10mLDMEM无血清培养基直接将细胞悬起，转移至15mL离心管中，300×g离心10min，弃掉上清，加入新的DMEM将细胞重悬。将SP2/0细胞悬液加入到10mL含有脾细胞的DMEM培养基的50mL离心管中并混匀，300×g离心10min。弃掉上清，用镊子轻轻敲击离心管底部，使细胞团块松散，至两种细胞混合均匀，置于37℃水浴中，将37℃预热的1mLPEG在1min内缓慢滴加到离心管中，静置90s，1min缓慢加入1mLDMEM培养基，1min滴入2mLDMEM培养基，1min滴加3mLDMEM培养基，最后补加DMEM至30mL，300×g离心10min。弃掉上清，用含有20%胎牛血清的HAT培养液重悬细胞并均匀加入到已铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，每孔150μL，置于37℃5%CO2培养箱中培养(毕彩鸿,2017)。融合后观察细胞生长状态，前2天可见细胞大量死亡，培养至第6天可见融合成功的细胞团出现，此时用HAT培养液进行半换液，第8天依然用HAT换液，第11天用HT培养基进行换液，待细胞生长稳定使用普通的含有20%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞长至细胞孔面积的70%时，可取培养上清液进行阳性细胞筛选鉴定。3.2.6阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆用间接ELISA方法进行筛选，包被浓度和方法参考上文中建立的ELISA方法。筛选阳性集落时，每个孔检测2次，舍弃两次检测结果同时为阴性的孔，两次结果有一次为阳性的孔则保留作进一步的验证，以筛选孔OD值/阴性孔OD值大于2.1判断为阳性孔，并选取比值较高孔的阳性孔进行亚克隆。克隆前一天制备饲养层细胞，铺入96孔板中备用。采用有限稀释法进行阳性细胞孔的扩大培养。用含有HT的培养液将阳性细胞孔中的细胞轻轻从孔底吹起，取部分细胞液加入DMEM培养基中，用细胞计数板进行计数，当每毫升悬液有300个细胞时，将此细胞液以每孔100μL的量加入到3个已铺有饲养层细胞的96孔板中，于37℃5%CO2培养箱中培养10天时，培养液颜色开始变黄，此时进行第2次阳性杂交瘤细胞的筛选。第2次亚克隆时，从阳性孔选出150-20025 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定个细胞按照上述方法进行扩大培养，第3次亚克隆选出80-150个细胞按照上述方法进行扩大培养。三次克隆结束后，最后选出OD值高的细胞株，即为最终筛选到的杂交瘤细胞株。用含20%胎牛血清的DMEM培养液将细胞悬起并转移到24孔板进行扩大培养，次日，更换培养液，待其密度长至细胞板底的80%以上时，转入6孔板进行培养，最后转入细胞瓶培养。3.2.7阳性杂交瘤细胞的冻存弃掉待冻存细胞的培养上清液，用DMEM将杂交瘤细胞吹下来，300×g离心5min收集细胞。配制90%胎牛血清和10%DMSO的细胞冻存液，用冻存液重悬细胞沉淀并分装于冻存管中，每管1mL，在冻存管上做好标记，放在冻存盒中，于-80℃过夜。次日，将冻存管转移至液氮中保存。而且，每次阳性细胞孔亚克隆后的细胞也要及时冻存备用，以防克隆污染。3.2.8单克隆抗体腹水的制备每株单抗准备5只45日龄Balb/c雌性小鼠，腹腔注射高压灭菌的石蜡油，每只小鼠0.25mL。第7天将生长状态良好的杂交瘤细胞吹起，转入50mL离心管中，300×g离心10min，弃掉上清，5用DMEM重悬细胞沉淀，细胞计数后并进行适当稀释达到8×10个/只，腹腔注入预先免疫过石蜡油的Balb/c小鼠。注射杂交瘤细胞后第10d，观察到小鼠腹部明显变大并发黑，将注射器针头扎进腹腔，让腹水慢慢流出来，每次使用前都要将针头吹打干净，防止堵塞，并且不能随意使用针头，避免交叉污染。第一次采集腹水后要每天观察小鼠状态，将收集到的腹水，900×g离心10min，吸取中间层，分装后保存于-80℃备用。3.2.9间接ELISA检测杂交瘤细胞的稳定性以第三次克隆后挑出的杂交瘤细胞进行扩大培养设定为第一代，将杂交瘤细胞传至第5、10、20代时收取细胞培养上清液，保存于-80℃备用。将纯化得到的抗原按照最佳包被浓度14ng/μL，用0.1mol/L碳酸盐缓冲液包被Elisa板，每孔100μL，4℃包被过夜，细胞上清液按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600进行稀释，以稀释后的细胞上清液作为一抗，进行ELISA试验，检测杂交瘤细胞传代时表达抗体的稳定性，并重复试验一次。ELISA检测步骤与前文所述的间接ELISA方法一致。3.2.10间接ELISA检测抗体效价将纯化得到的PRVHLJ-2013病毒总蛋白按照最佳包被浓度14ng/μL，用0.1molL-1碳酸盐缓冲液包被ELISA板，每孔100μL，4℃包被过夜，单抗腹水按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000的比例和1:1500、1:3000、1:6000、1:12000、1:24000、1:148000的比例分别进行稀释，进行ELISA试验，并重复试验一次，ELISA试验操作与前文所述一致。26 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定3.2.11VP22、VP16和pUL37单抗的Western-blot鉴定用切胶纯化得到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后采用湿转法进行转膜。首先剪取适当大小的PVDF膜，用甲醇浸润以激活，放入转膜液中，按照从负极到正极的排放顺序：石棉网-滤纸-胶块-PVDF膜-滤纸-石棉网，用滚轮滚动以赶走气泡，将转膜装置放入冰水混合物中以降低转膜过程中产生的热。转膜程序设置：VP22和VP16设为100V1h；pUL37蛋白设置为100V1h40min。转印完毕后，用5%的脱脂乳（PBST配制）封闭PVDF膜，室温封闭2h，将膜放入用PBST1:3000稀释的腹水中，37℃孵育1h，PBST洗膜4次，每次5min，将膜放入用PBST1:5000稀释的HRP标记的Goat-Anti-MouseIgG二抗中，37℃孵育1h，PBST洗膜4次，每次5min。配制DAB显色液，即1mL的DAB试剂2加入50μL的DAB试剂1，并避光混匀，均匀的铺于膜上，避光作用5min。3.2.12单克隆抗体亚类的鉴定使用MouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit抗亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体的Ig亚类进行鉴定，具体步骤如下：首先，用包被液将IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、Igλ、Igκ进行稀释（1:1000），放于4℃包被过夜；PBST洗3次，每次5min；加入含有抗体的杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1h。接下来的实验操作步骤与前文所述间接ELISA法一致。3.2.13VP22、VP16和pUL37单抗的IFA鉴定将PK15细胞传至96孔板中，待细胞长至90%时进行接毒。吸出细胞板中的培养液，每孔加入100μL的无血清培养液，轻轻晃动，清洗细胞表面残留的血清，并重复清洗一次。用含5%7.67FBS的细胞培养基将病毒滴度为10TCID50/mL的PRVHLJ-2013病毒液按照1:500进行稀释，每孔100μL，在37℃CO2培养箱培养20h后进行间接免疫荧光（IFA）试验。将上述96孔板中的培养液弃掉，用4℃预冷的PBS洗3遍，轻轻拍干。每孔加入-40℃预冷的无水乙醇100μL，于-20℃孵育20min。弃掉无水乙醇，风干后，用PBS洗一遍并拍干，每孔加入100μL用PBS1:3000倍稀释的单克隆抗体，并用PBS将小鼠阴性血清1:800倍稀释，每孔100μL，作为阴性对照，37℃孵育2h。用PBST洗3次，每次5min，并轻轻拍干。每孔加入50μL1:100倍（4℃预冷的PBS）稀释的羊抗鼠荧光二抗，37℃避光孵育1h。用PBST洗3次，每次5min，轻轻拍干。每孔加入50μLPBS于倒置荧光显微镜下观察。3.2.14染色体计数试验将生长状态良好的杂交瘤细胞弃掉培养液，加入含有0.4μg/mL秋水仙素的培养基，37℃培养4h。将细胞轻轻吹下，转移至2mlEP管中，100g离心5min，弃掉上清，加入1mL37℃预热的0.075MKCl将细胞重悬，置于37℃孵育30min，逐滴加入1mL固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），并混匀，100×g离心10min。沿管壁加入1mL固定液将细胞重悬，放入37℃CO2培养箱27 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定孵育30min，100×g离心5min，弃掉上清液，重复该步骤一次。用50μL固定液将细胞重悬，取40μL细胞悬液滴加到4℃预冷的载玻片上，将液滴均匀铺开，室温晾干。用10%吉姆萨染液作用10min，用水轻轻冲洗，室温晾干，油镜观察染色体数。3.3实验结果3.3.1间接ELISA方法的建立将纯化的PRV病毒蛋白和阴、阳性血清按照一定的比例进行稀释，通过ELISA进行检测，结果表明：将纯化的病毒蛋白1:200稀释，约14ng/μL，阴阳性血清的最佳稀释浓度为1:800。3.3.2细胞融合观察将脾细胞与SP2/0细胞进行融合，观察融合后第3天和第7天的细胞状态，并观察每次克隆化后第3天和第7天的细胞状态。图3.1融合及克隆化后杂交瘤细胞的状态观察Fig.3.1Thegrowthstatusoffusedandclonedhybridomas28 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定3.3.3阳性杂交瘤细胞株的筛选在细胞融合后及3次克隆化后的第9天，用建立的ELISA方法检测细胞培养上清的效价，将阳性孔进行有限稀释法克隆，得到检测阳性率为100%的克隆化细胞孔，即获得了1株稳定分泌VP22蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6；4株稳定分泌VP16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G6、1D4、9G3、4B6；5株稳定分泌pUL37蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2、2G2、10G7、11C3、4A11。3.3.4间接ELISA检测杂交瘤细胞的稳定性通过ELISA方法对筛选出的这10株杂交瘤细胞的培养上清液进行效价稳定性检测，结果如表3.1所示，可见杂交瘤细胞分泌的抗体效价可保持相对稳定。表3.1稳定传代检测Table3.1Detectionofstablepassageofhybridomacells3D63G61D4稀释倍数5代10代20代5代10代20代5代10代20代1:11.6591.8631.9571.8351.8251.5862.0502.1051.9741:501.4771.7651.7951.7691.6981.5471.9811.8091.8921:1001.1401.4661.4051.5501.2891.1991.8391.7921.7701:2000.8070.9230.9751.1160.8920.8851.5311.4461.5831:4000.4970.7000.6590.7900.6340.6641.1030.9960.9541:8000.5920.5090.6040.7050.6010.6440.7510.7560.807续表3.1稳定传代检测Table3.1(continued)Detectionofstablepassageofhybridomacells9G34B61E2稀释倍数5代10代20代5代10代20代5代10代20代1:11.6111.9321.9992.112.0501.9852.0212.0792.0521:501.6061.9861.8531.8901.9521.8101.6881.9431.7931:1001.5701.4861.6431.6241.7741.6771.1281.5121.3981:2001.2701.1480.9441.4021.3901.3600.7140.9940.9081:4000.8140.8300.7490.8490.8850.8650.6130.6780.6231:8000.6070.5830.5920.7530.7480.6680.5480.6770.63429 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定续表3.1稳定传代检测Table3.1(continued)Detectionofstablepassageofhybridomacells2G210G711C3稀释倍数5代10代20代5代10代20代5代10代20代1:11.7492.171.7052.0962.0952.0581.6322.1132.0701:501.2601.8011.6551.7221.7981.4951.3701.9321.8851:1001.1461.2551.3861.7701.3351.2210.9541.6531.5971:2000.7100.8071.0061.3860.9080.8710.6881.1971.2251:4000.5890.5890.6730.9690.7620.7260.5870.8670.9081:8000.5800.5740.5750.8210.6490.6220.5620.6870.651续表3.1稳定传代检测Table3.1(continued)Detectionofstablepassageofhybridomacells4A11稀释倍数5代10代20代1:12.0171.9112.0541:500.8701.0561.9131:1000.6520.7051.1471:2000.5700.5910.8281:4000.5550.5420.6731:8000.5210.5350.7183.3.5单克隆抗体亚类的鉴定用抗体亚类鉴定试剂盒对VP22，VP16和pUL37蛋白抗体的亚类进行鉴定，ELISA反应结果如图3.2所示，鉴定结果如表3.2所示，3D6的重链为IgM，轻链为κ链，VP16的4株单抗重链也为IgM，轻链为κ链，pUL37的5株单抗重链均为IgM，轻链均为κ链。30 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定表3.2杂交瘤细胞株抗体亚类Table3.2Theantibodysubtypesofhybridomacells123456789103D61D49G33G64B62G21E24A1110G711C3IgG10.2350.2130.2280.230.1770.2310.1440.1610.1580.182IgG2a0.3410.290.2140.2050.1450.2340.1680.1710.1790.214IgG2b0.440.390.3220.3370.2940.3330.2760.2590.2530.295IgG30.5870.6320.5040.4870.4640.4710.4220.4040.4140.411IgA0.4120.3310.30.2960.280.3230.2590.2640.2560.277IgM3.6353.613.5353.5123.5143.0663.343.2433.5033.458Igκ3.4323.4083.1383.2163.1873.0842.8082.7173.0582.963Igλ0.2560.2520.2130.180.170.2010.1390.1350.1570.171图3.2单抗亚类鉴定的ELISA反应结果1（VP22）：1（3D6）；2-5（VP16）：2（1D4），3（9G3），4（3G6），5（4B6）；6-10（pUL37）：6（2G2），7（1E2），8（4A11）9（10G7），10（11C3）。Fig.3.2TheresultsofELISAreactionforsubtypeidentification1(VP22):1(3D6);2-5(VP16):2(1D4),3(9G3),4(3G6),5(4B6);6-10(pUL37);6(2G2),7(1E2),8(4A11)9(10G7);10(11C3).3.3.6ELISA检测抗体效价通过ELISA方法对VP22(3D6)，VP16(3G6、1D4、9G3、4B6)和pUL37(1E2、2G2、10G7、11C3、4A11)的单抗进行效价检测，结果如表3.3所示。31 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定表3.3抗体效价Table3.3Thetitersofantibodies单抗命名3D63G61D49G34B61E22G210G711C34A11单抗效价1:30001:40001:80001:40001:40001:320001:320001:40001:60001:40003.3.7Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性用纯化的VP22，VP16和pUL37蛋白为抗原，通过SDS-PAGE，并通过湿转法转印至PVDF膜。将VP22蛋白的1株单抗3D6；VP16蛋白4株的单抗3G6、1D4、9G3、4B6；pUL37蛋白的5株单抗1E2、2G2、10G7、11C3、4A11用PBST进行1:3000稀释。Western-blot结果如图3.3（A,B,C）所示，3种单克隆抗体均能特异性识别相应的蛋白，而9G3和4A11单抗与抗原的识别条带相对较弱。图3.3Western-blot鉴定A：Western-blot鉴定VP22单抗的特异性，1:诱导pET-28a作为对照；B：Western-blot鉴定VP16单抗的特异性；C：Western-blot鉴定pUL37单抗的特异性。Fig3.3IdentifacationbyWestern-blotA:Thespecificityofthemonoclonalantibody3D6ofVP22proteinwasidentifiedbyWestern-blot,1:TheblankvectorPET-28awasinducedasacontrol；B:Thespecificitiesofthemonoclonalantibodies3G6,1D4,9G3,4B6ofVP16proteinwereidentifiedbyWestern-blot；C:Thespecificitiesofthemonoclonalantibodies1E2,2G2,10G7,11C3,4A11ofpUL37proteinwereidentifiedbyWestern-blot.32 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定3.3.8IFA鉴定单克隆抗体的特异性将细胞接毒后，进行IFA试验，结果如图3.4所示，VP22的单抗3D6；VP16的单抗1D4、3G6、4B6、9G3；pUL37的单抗1E2、2G2、10G7、11C3、4A11均能够与病毒在细胞中表达的蛋白相结合，结果显示VP16的单抗9G3和pUL37的单抗4A11荧光特异性较差。图3.4IFA鉴定Fig.3.4IdentificationbyIFA3.3.9杂交瘤细胞染色体数的检测SP2/0细胞染色体数为70条，小鼠脾细胞染色体数为40条。通过对VP22蛋白的3D6株，VP16蛋白的1D4、4B6、3G6株和pUL37蛋白的2G2、1E2、11C3、10G7株进行染色体数目检测试验，结果如图3.5所示，8株杂交瘤细胞中6株杂交瘤细胞3D6、1D4、4B6、1E2、2G2、11C3的染色体形态一致，分散相对较好，染色体数目为90~104条，均大于正常脾细胞的2倍，3G6、10G7株染色体数差异较明显。33 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定图3.5杂交瘤细胞的染色体鉴定Fig.3.5Identificationofhybridomacell’schromosomes3.4讨论单克隆抗体指来自一个淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的、针对同一抗原决定簇的抗体，具有特异性、纯度高、能够无限增殖的特点(葛红霞,2007)。目前，单克隆技术已成为很多实验室的常规实验技术，主要包括动物免疫、细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、单克隆抗体特异性鉴定等一系列实验(Miffy,2011)。虽然总体上单抗制备的技术路线一致，由于整个过程周期较长，涉及实验环节多，而且受多种因素的影响，因此，制备单克隆抗体时应根据实验室具体情况，设计出合理的实验方案(吴桐,2017)。高纯度的抗原在筛选阳性克隆，制备特异性的单克隆抗体中起着关键的作用。本试验采用将病毒液反复冻融，并运用差速离心和35%蔗糖垫超速离心相结合的方式，尽可能使抗原纯度达到最大，进而降低了因为抗原不纯对检测效果造成的影响。接下来，采用十字交叉法确定抗原的最佳包被浓度为14ng/μL（蛋白），阴阳性血清的最佳稀释倍数均为1:800倍，进而建立起准确、快速、简便地检测杂交瘤细胞上清液效价的间接ELISA方法，避免了由于错失检测时机而造成的阳性克隆丢失(杨萍萍等,2006)。由于原核表达的VP22蛋白含量特别低，切胶纯化未能成功得到适用于小鼠免疫的蛋白浓度，因此，在小鼠免疫的时候，A1笼完全采用免疫真核重组质粒pCAGGS-UL49。UL48基因组的B1笼和UL37基因组的C1笼，首次免疫和二次免疫选择后腿肌肉注射真核重组质粒，并加强免疫原核表达的蛋白。由于真核质粒在小鼠体内能够很好地表达天然的蛋白构象，并且其表达产物在机体内存留的时间长，但是质粒免疫诱导机体产生的抗体水平相对较低，而且因为肌肉注射免疫对脾脏中B淋巴细胞的刺激相对缓和。蛋白质在体内滞留的时间短，产生免疫应答较快(Weldingh&Andersen,1999)，因此，用原核表达的蛋白进行加强免疫，可以促进免疫小鼠的淋巴细胞较快地产生相应的抗体效价，有可能提高融合成功的概率。用真核34 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定质粒加强免疫，虽然避免了蛋白免疫过程中杂蛋白较多造成的干扰，要达到适于细胞融合的抗体效价，需要延长免疫周期。在蛋白免疫时使用QuickAntibody-Mouse3W免疫佐剂，与传统的弗氏佐剂相比，这种佐剂可以直接采用肌肉免疫途径，促进抗体产生较快，不破坏抗原的天然构象。在进行脾细胞与SP2/0细胞的融合过程中，由于SP2/0细胞生长状态不好，直接造成细胞融合失败，通过增加SP2/0细胞培养基的体积，细胞状态恢复良好，融合成功，一周后观察到96孔板中存在生长良好细胞团。在制备杂交瘤的过程中，制备饲养层细胞很关键，因为饲养细胞产生的淋巴因子能够增强杂交瘤细胞的生长，促进抗体产生(吴晓波等,1989)。试验发现，将饲养层细胞的浓度减少一半，仍能取得良好的融合效果。但如果将饲养细胞的浓度稍微增大，饲养细胞在融合后的培养过程中可将尚幼小的杂交瘤细胞吞噬掉，从而导致融合的失败。采用有限稀释法进行阳性克隆时，从96孔中挑选只有一个细胞团的孔进行下次的克隆化，这样可以保证该细胞团是由一个杂交瘤细胞分裂形成的。由于在筛选过程中会出现假阳性问题，因此在筛选时将3次克隆筛出的细胞株又进行了第4次的ELISA检测和IFA鉴定，筛选出了VP22组1株：3D6，VP16组4株：3G6、1D4、9G3、4B6，pUL37组5株：1E2、2G2、10G7、11C3、4A11用于后续的腹水制备。在制备腹水时提前7天免疫高压灭菌的石蜡油，可以降低小鼠的免疫力，产生免疫抑制，从而降低小鼠对接种的杂交瘤细胞产生的排斥反应，而且石蜡可以强烈刺激小鼠产生白细胞介素（IF-6），为接种的杂交瘤细胞提供良好的生存环境并促进腹水的产生。通过捕获ELISA对筛选的10株杂交瘤细胞培养上清中的抗体，进行亚类鉴定，表明10种抗体的亚类重链均是IgM，轻链为κ链。在对腹水进行亚类鉴定试验的时候，酶标仪检测到的IgG和IgM的OD450值都较高，因为在制备单克隆抗体时，IgG和IgM是最常产生的抗体亚类(ChowCasadevall,2012;Hadwigeretal.,2010)。IgM抗体是由初级反应（第一次免疫）产生的，第二次免疫后，主要抗体为IgG，根据免疫时间的长短，产生的主要亚类含量不同(Tsunodaetal.,2011)。因此，将腹水进行纯化后在进行单克隆抗体亚类的鉴定，可能就会得到比较单一的亚类鉴定结果。用建立的ELISA方法检测3种被膜蛋白单抗的效价，操作快捷且比较直观，更为其他实验提供了抗体稀释倍数的参考。通过ELISA结果可以看出VP22蛋白3D6株效价比VP16与pUL37的效价偏低，可能是由于真核质粒和蛋白联合免疫诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的应答水平达到了单一的核酸或者蛋白免疫应答水平，进而有效地诱导特异性抗体的产生(陈卓,2015)。在用ELISA检测融合细胞培养上清液的效价时候，发现用质粒加强免疫的OD450值也低于用蛋白加强免疫的OD450值。为了确定杂交瘤细胞在传代时是否可以稳定产生单抗，将10株杂交瘤细胞的第5代次，10代次，20代次的培养上清作ELISA检测，并进行数值比较，结果表明，杂交瘤细胞可相对稳定地产生单克隆抗体。在ELISA和Western-blot试验中，用的是辣根过氧化物酶标记的IgG作为二抗，结果表明是可行的(Yangetal.,2014)。在Western-blot中被膜蛋白VP22的单抗3D6；VP16单抗3G6、1D4、9G3、4B6；pUL37单抗1E2、2G2、10G7、11C3、4A11均与相应的蛋白产生特异性的条带反应，而9G3和4A11单抗与抗原的识别条带相对较弱。而且由于加样量的不同，VP16组每孔加10uL样品，pUL37组每孔加20uL样品，由图3.3，可以看出pUL37的蛋白条带明显的比VP16组的蛋白条带宽。IFA鉴定结果显示，这3种蛋白的单抗与相应的抗原都能发生特异性的识别反应，但是9G3和4A11荧光反应很弱。将单克隆抗体的ELISA效价检测试验与Western-blot和IFA试验的鉴定结果综合分析，从中筛选出反应特异性和灵敏性较好的35 中国农业科学院硕士学位论文第三章VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定单抗株3D6、3G6、1D4、4B6、1E2、2G2、10G7、11C3作进一步的鉴定。杂交瘤细胞染色体的形态、数目可以作为判断单克隆抗体是否稳定地分泌抗体的依据(杜春红等，2012)。在本试验中，由于染色时间的差异，产生了背景颜色和染色体着色深浅不同，如图3.5可知。通过对再次筛选出的VP22，VP16和pUL37蛋白的8株杂交瘤细胞同时进行染色体数的检测，表明其中6株杂交瘤细胞3D6、1D4、4B6、1E2、2G2、11C3的染色体形态一致，分散相对较好，染色体数目为90~104条，均大于正常脾细胞的2倍，表明这6杂交瘤细胞均是由脾细胞与SP2/0细胞融合而成，具备稳定分泌抗体的能力。而3G6和10G7株染色体数差异较明显，可导致分泌单抗的能力下降甚至消失，不适于作为实验室长期保存的生物材料。36 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立第四章免疫电镜方法的建立4.1实验材料智能恒温聚合炉购自北京中镜科仪技术有限公司；300µL八道移液器购自eppendorf公司；Tris平衡酚和酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）购自Solarbio公司；异丙醇、无水乙醇、DMF（N，N-二甲基甲酰胺）购自天津富宇精细化工有限公司；LRWhite购自北京中镜科仪有限公司；抗鼠10nm金标二抗购Sigma公司；300目纯碳膜购自北京中镜科仪有限公司，透射电子显微镜（型号H7650），电镜样品固定液F1、F2的配制见表4.1。表4.1电镜样品固定液F1、F2的配制Table4.1Fixativiesforelectronmicroscope成分F1F2多聚甲醛2g2g多聚甲醛需要加入4mol/LNaOH进行溶CaCl20.01385g0.01385g解；F1、F2配制完成后分别调节pH值MgCl20.0127g0.0127g=7.4、pH值=8.5，再定容，0.22μm滤器葡萄糖1.45g1.05g过滤，4℃保存HEPES1.1915g1.1915g纯化水定容至50mL定容至50mLF1、F2配制完成后分别调节pH值=7.4、pH值=8.5，再定容，用0.22μm滤器过滤，4℃保存。4.2实验方法4.2.1PRVHLJ-2013病毒毒价的测定将待传的PK15细胞消化并用培养液将细胞稀释成合适的密度，铺于96孔细胞培养板中，每-1-9孔100µL，待细胞密度为80-90%进行毒价测定。将病毒原液稀释成10至10（100µL+900µLDMEM）。按每孔100µL将稀释好的病毒液加到96孔板中，每个稀释度做8个重复，放于37℃细胞培养箱中孵育2h,更换成2%FBS维持液，于37℃5%CO2培养箱中孵育2d。以鼠源PRVHLJ-2013阳性血清为一抗，羊抗鼠-FITC为二抗，IFA检测细胞病变情况，统计阴阳性孔的数目。按照Reed-Muench公式计算PRVHLJ-2013毒株的病毒滴度。4.2.2免疫条件的优化将PK细胞铺于6孔板中，待其长至孔底的80-90%时，接种0.1MOI的PRVHLJ-2013，每隔2h在倒置显微镜下观察细胞病变。细胞完全病变但未脱落的接毒时间作为免疫抗原的收取时37 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立间。将再次筛出的VP22蛋白的单抗3D6；VP16蛋白的单抗1D4、4B6；pUL37蛋白的单抗1E2、2G2、11C3分别用0.1MHEPES进行1:100倍稀释后作为一抗，商品化鼠源10nm金标二抗用0.1MHEPES作1:100倍稀释，对PRVVP22、VP16、pUL37蛋白进行标记。透射电镜观察不同抗原与抗体结合的效果，根据特异性标记的金标颗粒，选出结合特异性较好的单克隆抗体，进行单克隆抗体稀释比例的优化。然后，将首次通过免疫电镜筛选出的VP22和VP16蛋白的单克隆抗体株用0.1MHEPES进行1:50、1:100、1:200倍稀释作为一抗，pUL37的单克隆抗体株按照1:100、1:200、1:400的比例稀释作为一抗，10nm抗鼠IgG金标二抗1:100倍稀释，透射电镜观察不同比例稀释的抗体与相应抗原结合的效果，最终确定特异强的单克隆抗体最佳的稀释倍数。4.2.3免疫样品的制备留取1mL培养液，用细胞刮将6孔板中的样品刮下，转移到1.5mLEP管中。具体步骤如下：（1）样本制备①固定：将细胞刮下，室温850×g，离心15min，弃掉上清。加入1mLF1，在摇床上室温固定2h，更换成1mLF2，4℃过夜；②DMF梯度脱水：依次用50%，70%，90%的DMF4℃分别脱水1次，每次15min，100%DMF脱水2次，每次10min；③包埋：分别用DMF:LR树脂=2:1及DMF:LR树脂=1:2的包埋剂4℃作用30min，之后将样品转移至纯的LR树脂中，4℃过夜；④聚合：更换新的LR树脂，于-20℃紫外照射聚合10d。（2）免疫部分①切片：将聚合好的树脂块切片，载于200目的镍网上；②封闭：用3%BSA（PBS配）室温作用30min；③一抗：将单抗分别50，100，200倍稀释（1%BSA稀释）后作为一抗。用滤纸吸干镍网封闭液并覆于一抗滴上室温孵育40min，滤纸吸干镍网上残余的一抗，蒸馏水漂洗2次，每次3min；④二抗：用滤纸吸干洗液后覆于100倍稀释（1%BSA稀释）的金标二抗上室温孵育40min并用滤纸吸干，蒸馏水漂洗2次，每次3min；⑤染色：用醋酸双氧铀染色10min，蒸馏水洗净，透射电镜观察。4.3实验结果4.3.1PRVHLJ-2013株病毒滴度的测定通过IFA试验测定PRVHLJ-2013病毒的毒价，结果见表4.2。38 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立表4.2PRVHLJ-2013株的毒价测定结果Table4.2TheresultsofvirusinfectivitytitreofPRVHLJ-2013阳性孔百分比稀释度阳性孔数阴性孔数阳性孔累计数阴性孔累计数（%）-11080580100-21080500100-31080420100-41080340100-51080260100-61080180100-71080100100-810262625-910080140按照Reed-Muench公式计算病毒毒价，公式如下：距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）（大于/50%的阳性百分比-小于50%的阳性百分比）=0.67TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例×稀释系数的对数-7.67=7+0.67×1=7.67，因此，log10=-7.67，PRVHLJ-2013株病毒的TCID50为10。4.3.2细胞病变时间的筛选将PRVHLJ-2013按照0.1MOI接种于PK15细胞，8h细胞开始出现病变，12h细胞大部分发生病变，16h细胞完全病变但未脱落，20h细胞有部分脱落，如图4.1所示。因此，选择接种0.1MOI的接毒剂量，接毒后16h收取样品。39 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立图4.1细胞病变结果A：接种PRV8h；B：接种PRV12h；C：接种PRV16h；D：接种PRV20h。Fig.4.1TheresultsofthecelllesionsA:AfterinoculationwithPRV8h;B:AfterinoculationwithPRV12h;C:AfterinoculationwithPRV16h;D:AfterinoculationwithPRV20h.4.3.3一抗的筛选将VP22、VP16、pUL37蛋白的6株单抗3D6、1D4、4B6、1E2、2G2、11C3进行1:100倍稀释后作为一抗。在透射电镜下观察发现，如图4.2.1和4.2.2所示，在亚细胞水平这几株单抗都能与蛋白发生特异性结合，不同单抗亲和性大小有所差异。pUL37组1E2为一抗标记的金标颗粒数量明显多于以2G2、11C3作一抗的金标颗粒数；VP16组中以1D4为一抗标记的金标颗粒数量相对于4B6明显较多。为了进一步确定所得到的单抗在免疫电镜试验使用的最佳稀释比例，选出亲和性相对较好的单抗3D6、1D4、1E2作进一步稀释倍数的的优化。40 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立图4.2.1单抗免疫结果Fig.4.2.1Theresultsoftheimmunogoldlabeling注：白色箭头指示金标颗粒，黑色箭头指示病毒颗粒41 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立图4.2.2单抗免疫结果Fig.4.2.2Theresultsoftheimmunogoldlabeling注：白色箭头指示金标颗粒，黑色箭头指示病毒颗粒42 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立4.3.4一抗稀释倍数的优化将筛选出的3D6和1D4单抗按照1:50、1:100、1:200的比例进行稀释，单抗1E2按照1:100、1:200、1:400的比例进行稀释，分别作为一抗，进行免疫电镜标记，在透射电镜下进行观察，结果图4.3和4.4所示，3D6和1D4按照1:100倍稀释的标记效果比1:50稀释的标记效果相对较好，1:200倍比稀释时，金标颗粒的数量明显减少，1E2在1:200倍稀释时免疫效果相对较好。因此，最终确定1:100是3D6和1D4在保证免疫电镜标记效果情况下的最佳的稀释倍数，1E2在1:200倍稀释时可以达到相对较好的标记效果。图4.3VP22单抗3D6稀释倍数的优化Fig.4.3Theresultofthedilutionoptimizationof3D6注：白色箭头指示金标颗粒，黑色箭头指示病毒颗粒43 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立图4.4VP16单抗1D4稀释倍数的优化Fig.4.4Theresultofthedilutionoptimizationof1D4注：白色箭头指示金标颗粒，黑色箭头指示病毒颗粒44 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立图4.5pUL37单抗1E2稀释倍数的优化Fig.4.5Theresultofthedilutionoptimizationof1E2注：白色箭头指示金标颗粒，黑色箭头指示病毒颗粒4.4讨论通过优化在亚细胞水平抗体与抗原结合的最佳条件的试验中，发现最终筛选出的单抗株的荧光反应特异性更强，Western-blot反应抗原抗体的结合更为灵敏。因此，获得高滴度的单克隆抗体，是研究伪狂犬病毒结构和功能，建立免疫电镜标记方法的必要工作。在免疫样品制备的过程中，控制接毒剂量为0.1MOI，收取细胞完全病变但未脱落的样品（接毒后16h），这样一方面最大限度的保证细胞结构的完整，另一方面细胞不脱落，病毒较长时间维持较高的滴度水平，为免疫金标记提供了条件(石岗等，2002)。本研究，通过免疫电镜对单抗进行初步筛选时，根据单抗的特异性，金标颗粒数量的相对数量，以及相应蛋白在感染细胞所处的大致区域进行判定，进而选出在亚细胞水平免疫效果较好的单抗。研究中VP22蛋白的单抗3D6效价为1:3000，依然可以在感染细胞内进行特异性标记，进而为蛋白的定位研究提供依据。因此，单抗的效价可以为免疫45 中国农业科学院硕士学位论文第四章免疫电镜方法的建立标记稀释倍数提供参考，但是并不是绝对的。在探究的过程中发现，3D6、1D4（1:100）和pUL37（1：200）稀释比例较小时，高浓度的一抗分子之间容易产生胶连，进而造成单克隆抗体与金标二抗结合后，可能会有一部分产生非特异性反应，由于金标二抗分子较重不但给清洗增加了困难，而且会产生金标颗粒的致密分布。而稀释比例过大时，会严重影响标记效果，因此，本研究保证标记效果为前提，最终确定（1E2）pUL37、（1D4）VP16、（3D6）VP22的最佳稀释比例。稀释一抗和二抗的缓冲液常用的有PBS，0.1MHEPES和Kaco，PBS对抗体结构的破坏性较大，而由于购买条件的限制很难买到Kaco，综合考虑各种因素，本研究选用HEPES缓冲液。被膜蛋白在细胞质，感染细胞的细胞核以及成熟的病毒粒子周围均有分布，主要在细胞质中，细胞核中只有少量的存在(Fuchs,Granzowetal.,2002)，正如图（4.2-4.5）所示，在PRV颗粒的周围以及细胞质中均能观察到明显的金标颗粒，且细胞质中的金标颗粒居多。本试验探究结果与间接免疫荧光试验的结果相互印证，表明本研究所制备单克隆抗体的特异性和实用性，而且被膜蛋白网络非常复杂，很多蛋白的定位功能尚不清楚，因此，利用本研究建立的免疫电镜标记方法对抗原进行示踪，将为蛋白功能的研究提供有力的技术支撑。46 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1、成功构建表达pUL37、VP16、VP22蛋白的真核重组质粒pCAGGS-UL37/UL48/UL49，并诱导pUL37和VP16蛋白的原核表达。2、制备并鉴定出分别针对PRV三种被膜蛋白的单克隆抗体1E2、2G2、11C3（pUL37）；1D4、4B6（VP16）；3D6（VP22）。3、利用研究中获得的单克隆抗体作为一抗建立了PRV感染细胞中pUL37、VP16和VP22的免疫金标记方法。47 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时间流逝的好快，转眼间，三年的硕士研究生生活即将画上一个句号。敲下“致谢”二字，内心有几许激动、几许欣慰、却也有几分留恋。犹记得，刚来到研究所时生活和学习上存在各种的不适应，心里压力很大。是我最尊敬的导师王靖飞研究员耐心的开导我，鼓励我，告诫我无论什么事都要坚持。王老师用他严谨、创新、求实、注重细节的工作态度，以及高尚的师德、淡泊从容的生活态度、和蔼亲切的人格魅力影响着我。在这期间，无论是学习还是做人做事，王老师都在无形中教会了我很多。牢记王老师的谆谆教诲，我坚持走过了硕士阶段，在今后的人生道路上也将坚持奋勇向前。在研究生即将毕业之际，谨此向我最敬爱的导师致以由衷的感谢和崇高的敬意！感谢实验室的刘春国老师、仇铮老师、魏丽丽老师、沈楠老师、司微老师在实验和生活上的指导和帮助；感谢王世达师兄、孙振钊师兄、刘在斯师姐、郭莹莹师姐、王铭师姐对我实验的指导以及对我生活上的照顾。感谢史智斌师弟、薛碧云博士、侯高鹏博士、朱冰师妹在生活和学习上给予的关心和帮助，感谢你们与我一起成长。感谢蔡雪辉研究员，田志军研究院，安同庆研究员，何希君研究员对我实验上的指导和帮助！感谢中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的各位领导和老师在学习和生活上提供的帮助！同时感谢哈尔滨兽医研究所提供的浓厚科研氛围和先进的实验平台！感谢我的家人和朋友，感谢他们默默地支持与理解，多年求学在外，未能常伴左右，心中甚感愧疚。没有他们的关心与帮助，就没有我的今天。感谢我的父母和杜明亮硕士，谢谢你们一直以来给予我的无限包容，谢谢你们一直以来对我的无限鼓励，谢谢你们一直用爱伴我前行，尤其感谢杜明亮硕士在实验上给予的无限帮助和指导！感谢2015级的全体同学在实验和生活上给予的无私帮助和关心，是你们三年的陪伴让我的成长之路不再孤单，是你们的陪伴让我的蜕变之路也变得这样的幸福。感谢梁甜甜硕士，向广韬硕士，刘春晓硕士，是你们在我最需要的时候挤出宝贵时间给予及时的帮助。55 中国农业科学院硕士学位论文作者简介作者简介刘慧敏，女，1991年4月出生于河南周口，汉族人，2011年考入河南科技学院动物科学学院动物医学专业，2015年7月，顺利毕业并获得农学学士学位；2015年9月考入中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，学习兽医专业，导师为动物病原结构与生物信息创新团队负责人王靖飞研究员。已发表文章：刘慧敏，陈利红，史智宾，王靖飞.伪狂犬病毒被膜蛋白VP22单克隆抗体的制备及免疫电镜方法的建立。56
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