伪狂犬病病毒gD基因核酸疫苗及VP22免疫增强效应的研究

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西南大学硕士学位论文摘要伪狂犬病(Pseudorabies)是当今危害养猪业的最重要传染病之一，虽然～些国家实施了根除计划，但在绝大多数国家尤其是发展中国家，该病仍然频繁发生，造成的经济损失巨大，严重制约着这些国家和地区养殖业的发展。免疫接种仍是目前控制和预防该病的主要手段。传统的猪伪狂犬病疫苗对控制疾病的发生和流行发挥了巨大作用，但无论是灭活疫苗还是弱毒疫苗均不同程度的存在免疫效果不佳或毒力返强等缺陷。研制更安全、高效、廉价的新型疫苗一直是伪狂犬病研究的重要方向。本研究在克隆、表达猪伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)鄂A株的主要免疫原性基因2D的基础上，构建了这一基因的真核表达质粒并作为核酸疫苗，通过肌肉注射的方式免疫试验动物，检测了动物产生的免疫应答水平以及对病毒攻击的保护能力，结果证实这些核酸疫苗可以有效激活试验动物产生全面的免疫应答反应。同时还研究证明伪狂犬病毒VP22对猪伪狂犬病核酸疫苗具有免疫增效作用。主要研究内容如下：1．PrVEa株gD基因、VP22基因的克隆分别以重组质粒pcDD和pMD．VP22为模板，设计引物，通过PCR扩增，在gD基因的上、下游引入HindllI和风fI位点，在VP22基因的上、下游引入Xbal和l}cnRl位点，将扩增的gD基因和VP22基因基因片段克隆到载体pUCll9，构建质粒pUC-gD、puc-w22和pUC-gD-VP221并将pUGgD、pUC-VP22送上海博亚生物工程公司测序。酶切电泳鉴定，gD基因片段长度约为1200bp，VP22基因片段长约760bp，gO—VP22基因片段长约2000bp：测序结果表明，扩增的gD基因片段为1266bp，VP22基因片段756bp，go-wz2基因片段为2028bp。经对比发现扩增的gD基因、V'P22基因与GeneBank中公布的Prv的gD基因(AF086702)和VP22基因(AYl90527)标准序列一致，在PCR扩增过程中没有发生碱基突变。2．表达质粒的构建使用核酸内切酶HindllI和EcoRI，酶切携带目基因片段的pUC-gD、pUC-go-VP22及原核表达载体pET28a(+)和真核表达载体p3XFIAO．CMVTM．10，连接、构建原核表达质粒pET-gD、pET-gD-VP22以及真核表达质粒p3XFLAG-gD、p3XFLAG-gD—VP22。原核表达质粒、真核表达质粒分别酶切电泳后，分别在1300bp处和2000bp附近均出现了明亮的条带．结合序列鉴定结果，可以表明目的基因已经插入到表达载体的多克隆位点处。3．gD基因在大肠杆菌中的高效表达原核表达质粒pET-go和pEr-go—VP22分别转化BL21∞E3)细胞，IPTG诱导，SDS—PAGE结果显示：pET-gD能够在大肠杆菌中表达出约47kD的蛋白，pET-gD-VP22能够在大肠杆菌中表达出约72kD的融合蛋白，Westernblot结果表明以上两种原核表达蛋白具有良好的反应原性。4．Pry．gD基因DNA疫苗的免疫保护．及VP22蛋白免疫增强作用将以p3XFLAG为载体，构建的妒基因真核表达质粒p3XFLAG·gD和03XFLAG-gD．VP22，以loogg／p,免疫BALB／c小鼠，间隔15天增强免疫一次。二免4周后采用5x105pfu的PrVEa株强毒攻击，p3XFLAG-gD-VP22免疫组和p3XFLAG，gD免疫组DNA疫苗对小鼠的保护率分别为825％和75％。 两南大学硕士学位论史摘要将表返gD．VP22融合蛋白的质粒p3XFLAG-gD．VP22免疫小鼠，与非融合表达质粒p3XFLAG．gD进行比较，间接ELISA检测发现与VP22融合表达能显著增强特异性IgG水平。通过对小鼠外周tin中CD4+,}HCDS+T淋巴细胞百分含量分析发现，p3XFLAG．gD-VP22和p3XH,AG。gD免疫纽CD4+_手rlCDS+T淋巴细胞百分含量均极显著高于空载体组和空白对照组，且p3XFLAG．gD．VP22免疫组小鼠外周血中CD4+T细胞的数量显著高于p3XFLAG-gO免疫组(P<0．05)，可见融合基冈p3XFLAG-gD—VP22质粒能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答。关键谰：伪狂犬病毒gD基因克隆表达DNA疫苗VP22蛋白转导免疫增强II 西南大学硕士学位论文AbstmtAbstractPseudorabies，alsodesignatedasAujeszky’Sdisease(AD)，isaseriousillnessofswineandcausessignificantfinanciallossesinthepigindustry．TocontrolADandloreduceeconomiclossesirlthepigindustry,activeimmunizationwithmodifiedliveorinactivatedvaccineshasbeenperformedwidely．Althoughthesevaccinescanproqi-aeprotectionagainstclinicalsignsofADinswinetosomedegrees,theyhavecertaindefects，especiallylimitedprotectiveeffica斜andthedangerofreversiontoamorevirulentstrain．Therefore，itisurgenttodevelopsaferandnloreeffectivevaccinestocontrolthisdisease．Asanewimmunologytheoryandmethod，Geneticimmunizationandnucleicacidvaccineorgeneticvaccinedevelopedbasingonresearchofge鑫therapy，havegotextensiveattentionandgreatprogressinrecentyears．Asitsadvanmgesofsafety，effectiveness，easilyconstruction，etc．geneticvaccinehasbecomethepreferentialpotentialmethodduringresearchtheprophylacticmethodagainstseriousdiseases。Basedonclone，expressionofFseudorabiesVirus(PrV)(Eastrain)majorimmunogenicitygDgene，weconstractedtheeukaryoticexpressionplasmidaofitasDNAvaccine，detectedtheimmuneresponselevelandprotectiveefficacyofvaccineinjectedbymuscle。TheresultsdemonstratedthatDNAvaccinecanstimulatethehumoralandcellarimlnuneresponseeffectively，alsoindicatedthatimmunopotentiationofVP22toPseudorabiesDNAvaccine，themajorresearchwasthefollow：l。CloningofgDgeneofPrV(Eastrain)andVP22geneUsingrecombinantplasmidpcDDandpMD-VP22astemplate，designedprimerwhichcontainf矗nmIlandPstIsitesintheupstreamanddownstreamofgDgenerespectively．andlead·in蜀‰landEcoRlsitesofVP22genebypolymemsechainreaction(PCR)amplification。ClonedtheamplifiedgDandVP22geneonthevectorpUCll9toconstructrecombinantplasmidpUC-gD、pUC-VP22andpUC-gD-VP22,TheseriesofpUC-goandpUC-VP22weresequencedbyBoyaBiotechnologyCompany．Thefragmentofgo，VP22andgD—VP22genewe摊1200bp，760bpand1200bpbydigestelectrophoresis．SequencingresultshowedthattheamplifiedfragmentofgD，VP22and庐-VP22genewcIe1266bp，756bpand2028．AndfoundthattwoamplifiedgenrefragmentconsistentwithgDgene(AF086702)andVP22gene(AYl90527)ofpublicatedinPrV，withoutbasemutation．2。ConstructionofexpressionplasmidDigestpUC-gD、pUC-gD-VP22andprokaryoticexpressionvectorpET28a(+)andeukaryoticexpressionvectorp3XFLAG-CMVTM-lObyrestrictionenzyme肺H棚landEcoRl，linkandconstructprokaryoticexpressionplasmidpET-gD、pET-gD—VP22andeukaryoticexpressionplasmidp3XFLAG-gD、p3XFLAGwgD—VP22。Analysisprokaryoticexpressionplasmidandeukaryoticexpressionplasmidthrougheleetmphoresisappearedtwoobviousstrapson1300bpand2000bp，indicatedthepuIposegeneWereinsertedintomultipleclonesiteofexpressionvector．a3．ExpressionofgDinE．coli。TheprokaryoticexpressionvectorpET-gDandpET-gD-VP2transformedBL21(DE3)，induc．edbyIPTG,andtheresultofSDS·PAGEshowedthattherewasaobviousspecfficstrapat47kDainIll 西南大学硕士学位论义AbstractpET-gDandat72kDainpET-gD-VP22．AnalysistheexpressionproductwithWesternblotshowedthatithadagoodreactionogenicily4．ProtectiveefficacyofDNAvaccineencodingPry·gD，andimmunologicalenhancementofVP22proteinThep3XFLAG—gDandp3XFLAG-gD-VP22wereconstructedusingtheeukaryoticexpressionvectorp3XFLAGimmunizedBALB／cmice，thedosewaslOOgg，andboosted15dayslateLAtthefourthweekafterboostedvaccination．micewerechallengedwith5x10’pfudoseofPrVEastrain．Theprotectiveefficacyofp3XFI．AG-gD-VP22groupandp3XFLAG-gDgroupwas87．5％and75％．respectively．ItdemonstratedthattheDNAvaccinecouldprotectmicefromchallengeandPrV-gDhasasatisfactoryreactiongenicity．Comparedwithp3XFLAG-gD，p3XFLAG-gD-VP22expressingfuseproteingo—VP22cansignificantlyenhancethegD—specificELISA．AnalysisthepercentageofCD4+TandCDS+TinperipheralbloodrevealedthatthepercentageOfCD4+TandCD8+Tofp3XFLAG-gD-VP22andp3XFLAG—gDgroupswashighersignificantlythanthatofp3XFLAGandcontrolgroups，furthermore，thenumberofCD4+ofp3XFLAG—gD-VP22wasalsohighersignificantlythanp3XFLAG—gDO<0．05)，theresultsuggestedthatp3XFLAG·gD-VP22expressingfusionproteingO—VP22caninducestrongerimmuneresponse．Keywords：Pseudorabiesvirus；gDgene；Clone；ExpressionDNAvaccine；TegumentproteinVP22；Proteintransduction：Immunoenhancement 独创性声明学位论文题目：丛蕉走痘痘盔g旦基因擅酸疫萱丞!里22免疫擅本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导卜．进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者：伤采壹I咎签字日期：2006年6月1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：你自孽导师签名：了a_家．签字日期：o伽占年占月1日签字日期：￡叻6年占月J日学位论文作者毕业后去向：工作单位：重瘥壹金墨药墨监壑筐堡旦验匹匡佥局电话通讯地址：重鏖立坠江匡堑坐盘道耍墨——邮编()409000 西南大学碗士学位论文帮一章文献综述第一章文献综述1、伪猛犬病毒妒基因研究进展伪强灾病(PseudorabieS，PR)楚由疱疹病毒辩、猪疱疹病毒I攀豹伪狂犬瘸病毒(Pseudorabiesvirus，PrY)引起的多种家畜和野生动物的一种高度接触性、急性传染病。以发热、奄痒(猿豫赡)及脑脊鼹炎为主要癌状。最晕发现于美灏，最来出匈矛剥科学家Aujeszky(1902)首先分离出病毒。猪是该瘸原的传播者和自然宿主”’。20懒纪中期，PR在束欧及巴尔干半岛的国家流行较广，猪被感染后其症状比较温和；但20世纪60～70年代以来，由于PrV强毒株的出理，猪场爆发豫驰数量显著增细，嚣盛嚣种墨龄的猿均可感絷，其症状明显加剧。我国自1947年首次报道以来已有20多个省、市流行过本痛，近几年PR在我国许多省(市)种猪场墨爆发流行趋势”’“。李学伍等(2000)、苏双等(2000)、顾小根(2002)等分别先矮对涎鸯省，砉捧省秘渣江卷的数孬个援搂佬棼猪场静发瘸仔猪进露Prv盎溥学捡测，梭出PrY阳性瓶清率最高可选100％，最低也达到34．5％，表稍随着我国弊猪业集约化规模化的发展，猪伪狂犬病的爆发流行有逐新扩大和蔓延的趋势“”1。由于囊撰耱蛋白巍侥扛大瘸痪毒懿感染_过程孛起终十芬重要驹手#蠲，参与疯毒较射／穿入过程、瘸毒诱导的细胞融合过程及病毒从核膜出芽、释放过程等，是病毒艨染致病的关键所在，因此日I起国内外研究者的极大关注。以下着熏对其囊膜蛋白gD的结构、特性，基因的绩梅特点敬爱鞠关疫麓豹痰用遴错综遮。1．1PrV基因组结构pr'i蒸嚣缀力线状双黢DNA，大奎魏150kb，DNA基因缀中G+C戆禽鬃赢逸73％。胃编码100种骚白质，分予萤为90×105Da，基因组由独特的长节段(UL)、独特的短节段(Us)、内部倒转重复序列(IRs)、末端倒转熏复序列(TRs)所组成“‘。目前已宽成了伪狂犬病病毒50多个基因的定位和测穿，这些基因覆盖了伪狂穴瘸病毒基闵组的90％。研究静最为深入的怒42kb的S节段(包括IR和uS区段)，IR区段RSPIO，EPO和IEl80基因和US区段的gG、gI(gp63)、曲、gE、PK、nK和28K等基嚣B被鉴定秘测序。此外，在UL区段中船、gc、gD、g娃，脾营激酶(T晒。136KD和DNA结合缀自《DBP)，DNA多聚鹣(孙1)和主要表轰蛋囱(卿)等慧黼，以及编码单纯疱疹病毒I型(HSV—I)同源物ICP—18．5的基因也已被艇定和测序⋯。{。2PrV囊骥璇蛋白的主要秘类及功缝：：PrY烛通过病毒粒子表面的糖蛋白才能进入宿主细胞。感染过程包括吸附宿主细胞，与宿主细胞胞浆膜融会，核表壳壹接进入跑浆等重要步骤，囊膜糖碳白(Glycoprotein)壤参与病毒献薅染细麓扩散到未感染细胞过程。囊膜蛋白蛹、龄、gD、gE、gH镑各种糖蛩自在PrY感染细胞及免疫过程中起着重要作用。PrY耱蛋白邸怒痪毒囊膜戆主要或份之一，Sl够剡激机体产生褥体依赖性霉珏{}体嚣铱簸性的中和抗体。gB蘩因在疱疹瘸毒成员中属最保守的糖蛋白基因，在不同的瘾疹瘫毒之间，邸蛋白的功能可以相旺取代。PrY糖蛋白gC基因，媳病毒增殖过程中的非必需基因”1，在套导病毒吸辫静过程牵具寿重要佟弼。{壁西蛋自与纲鼹膜结含受到蘸酸乙靛jl手素蛋白多糖 西南大学硕十学位论文第一章文献综述(Heparansu]fateproteoglycan)的竞争抑制。PrV糖蛋白gE与gI是以非共价键形式结合成gE／gI复合物的，这种复合物是病毒的功能成分，并与乩之间相互作用介导病毒的释放”1。gH糖蛋白分f量为95kD，含N一甘露糖，为病毒复制所必需的结构蛋向，对于病毒侵入靶细胞或感染细胞与邻近细胞的融合．以及在小鼠神经系统中的增殖均是必需的。PrV糖蛋向gD是病毒感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，参与病毒的穿透过程，是一种重要的中和抗原。1．3gD糖蛋白的结构和功能1．3．1gD糖蛋白结构PrY糖蛋向gD(GlycoproteinD)基因位于基因组Us区的BamHI第7片段。大小约1．2kb，编码402个氨基酸。范伟兴等(2003)比较了PrVLA株、Ea株、Hubei株、Rice株、NIA一3株、和Kaplan株的gD基因序列，研究发现，不同PRV毒株间gD基因在核苷酸水平和氨基酸水平的同源性均较高，表明gD基因在不同的毒株中是高度保守的。在这些a疱疹病毒的gD基|天l中，PRV的gD基因的G+C含量为75％，在其ORF中96％的三密码子中含有G或C。这使得组成PRVgD的氨基酸中Pro占15％，Ala占12％，Arg占10％，Gly占7％”“。Petrovskis(1986)等认为这种情况是病毒在进化过程中受某种选择压的影响所造成的““。成熟的gD蛋白位于病毒囊膜或细胞膜的表面，分为胞外区和跨膜区。将gD蛋白的胞外及跨膜区DNA编码序列分别与编码gB、gE、gM基因的胞内区序列融合，表达融合蛋白，用共聚焦扫描显微镜研究显示，gD与gB、gM的c一末端融合表达的多肽gDB、gDM位于细胞内，而全长的gD蛋白和去掉c一末端的gD蛋白多肽则主要位于细胞膜的表面。gDE和缺失gB内吞信号的gDB△29多肽主要位于质膜(PlasmaMembrane)上。尽管这些表达的蛋白多肽在细胞内的分布部位不同，但所有重组蛋白均能补偿PrVgD一突变株的感染能力，只有表达在细胞膜或质膜上的gD蛋白对PrV感染细胞具有抑制作用““。1．3．2gD糖蛋白功能PrY糖蛋白gD是成熟的病毒粒子囊膜表砸的主要糖蛋白之一，也是PrY最主要的免疫原性成分之一，在PrV的感染和增殖过程中具有重要作用“⋯。PrV与宿主细胞膜的结合分为两个阶段，第一阶段为不稳定结合．主要参与的PrY囊膜蚩白是gC蛋向。如前所述，gC蛋白在这～过程中的作用受到硫酸乙酰肝素的竞争抑制。而且，gc蛋白本身也不是这一过程所必需的。在这一阶段，病毒粒子与细胞膜的结合不稳定。第二阶段为稳定结合阶段，通常认为需要gD蛋白的参与，并不受肝素的竞争抑制。在细胞表面介导疱疹病毒入侵的细胞受体包括有HveA、HveB和HveC等，HveA和Hvec直接与HSV的gD蛋白结合，介导火部分的HSV一1和HSV～2型病毒的入侵，HveB介导HSV一2和少数HSV—l型病毒的入侵““。HveB和HveC也是Prv的受体，但BHV一1仅与HveC结合。纯化的HveC以及在杆状病毒中表达的部分多肽区段均可与gD蛋白结合。结合位点在HveC的第一个免疫球蛋白相似区即v区。用ELISA的方法证实，Prv的gD蛋白与HveC结合的亲和力较HSV一1的gD蛋白与HveC的亲和力高10倍““。另外，PrY和HSV—l的gD蛋白都会因与HveC的结合2 西南大学硕士学位论立第一章文献综进而竞争抑制其他疱疹病毒的入侵。即使怒表达BHV—l的曲蛋白的瓣胞，也会翻其表面的受体被结含而对PrY的感染冀育抵抗力。HveC的第三个免疫球鬣自榍戗区楚形成HveC寡聚物的功能嚣，其作用对gD蟹矗与HveC的结合宥影响“⋯。曲耱蛋自在病毒粒子感染宿主缩胞的过科中也并不悬必不可少的。曲缺失的瘸毒(PrYgD"Pass)或gc与gD均缺失的瘸簿突变株(PrVgcD-)在椎互补细胞舔上连续传代醣后，可敬重勰获褥感染力。其中，PrvgD'Pass豹感染演廑可达到107p。f．u／ml，与亲本毒抹相比，其感染力下降了50倍，与PrYgC一突变橡相似。丽同时缺必Prv感染指芙的蛋囱gc和gD基因以胼，PrYgCD"突变株的感染能力下降了近10000倍，位仍舆有感染性。与PrVgD"Pass相毙，篱鞋缺失静、gG、gl秘媾后对瘸毒的感染能力影响不丈。这些缨繁谖鹱，黪蛋自在PrY入瞧密主甥魏过稷中的功熊西被瘸毒粒子中的其它成份与绷胞膜胡甄俸用两代耱。另终，在同属疱疹病毒的VZV(Varicella-ZosterVirus)的基冈组中没有gD基因的同源序列，进～步说明了薛鬣囱豹终羽在瘸毒增骧避稔中著嚣妊瓣““。1．4妒耱蛋白基因在疫萤研制方面的应用{。4．{基因缺失簦决定伪狂犬瘸病毒力有多个基因，其中秫基强是主瑟的辫力蘩戮，健囊麟蛋囱曲基因旋PrY的感染和增殖过程中具有重要作用，是Prv侵入宿主细胞过程中的必需成分。因此可以利用酶切手段，将PrV基因组中的毒力基函以及生长非必需基因删除若干个碱基，腻两僮该蒸因彻底失活，制成罄阁缺失疫萤。Moormann豁(1990)首先榆建了PrYTK一／gE-双基因软失蔽蓬株，Mettenteiter等(1994)构建了禽gC-、g旷、gr、g!—缺失的4基因缺失疫茁檬。嗣内华中农娥大学陈焕春等在PRVEaTK一拣藻础上构建了PrV姚TK-／gG～、TK_／gE-疫苗株，四川农业大学郭万柱等构建了PrV闽ATK一／gC一、TK-／gE’、Tr／gG”株等。这其中痰用较多豹翥{K一／菇一、强一／g旷、TK～／gE～、聪～／薛～等残缺失疫萤株彝骶一／gE一／gG-三缺失疫营撼。这些双缺失或三缺失疫越株缀临痰验证袭明，具有良好的安全性和保护力。胡涛(2004)等通过PCR扩增了PRVgD、gm麓因．并连接于髓粒putl8上，缺失了位于PRY纂围缎串够、媾基因之闽的gl蒸麓垒痔列。嚣缀BstEII酶甥映失了鳐基因的启动子枣列和gEORF5’溃363bp鞭蘩。同黠在缺失位点插入来自震粒粥B凇3．1的he埘崩动予、多克隆位点(眦s)和Neo抗性基因构建了通用转移载体，为构建以gl一／gE～伪狂犬病毒为载体的重缀基因工程痰萤撬供了霄力鹩工兵”⋯。t．4．2亚荤僚疫蘸溉单位痰茁是乖』臻PrY鳔护慷抗覆基毽，雀聚棱或囊棱系统中袭达蘑获褥的产物裁成瓣瘦整，在侥程穴瘸瘸毒瓣蓠范发现豹11秘糖蛋鑫书，邸、gc、扫均貔诱导壤体产生孛和挠体。猜和小鼠注射抗gB、gc、gD的单克隆抗体后均能抵抗PrY强毒的攻击，且糖蛋白gD能诱导较好的保护葳疲，并懿谈刘蠲聪表藤脊髓灰葳炎瘸毒受体家族豹受体，介导病毒岛赣绥髓的稳定结合，参与瘸毒感染静暇辫帮穿入过程”“，嚣诧，静蒸嚣是锈狂失瘸毒致擎敲疫萑斡主爨候选基因。Marchioli等内膜将PRV保护性抗躁基因gD克隆到PSYZdhfr栽体的人巨细胞3 西南太学硕士学位论文第一章文献综述病毒(hCMV)立都早期窟动予的下游，然荔转灭e}l潮仓鼓羚鬟缀耱(CHO)串，经氨壤岭筛选壅1株表达糖蛋白gD)的CHOgD-17细胞株，经大量培养后_l{j表达产物配以佐荆，鼻内接种免疫猪，能诱辱猪产生中和抗体并保护猪抵抗PRV强毒的攻击。HiroshiIshii等将亲和屡析纯化的曲糖援自免疫小隈，可豫护小藏免受致死室的PrY的攻击，lOOug缝他的PrY糖簸自曲凳疫的猪产生了中和抗体，能抵抗108Pfup#V的攻击。Katayama等(1998)应用肝素亲和层析方法提墩病毒糖蛋向，制成糖爝自混合疫茁，免疫妊娠母猪2次后，能诱导母猪产生较高承平的中和抗俸，减少捧毒量，两且有效防期了PrVgl起的流产秘死胎。Marchioli簿将PrV保护性抗原基因gD克隆到pSV2dhfr载体的人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子的下游，然后转人中国仓鼠弹巢细缒(CHO)中，经氮喋岭蒴选出I株表达耪凝自gD的CHOgD-17缎臆株，经大量臻葬后用表达产物配阻後剂，彝内接种免疫猪，能诱导猪产生中和抗体并保护猪抵抗PrV强毒的攻击“”1。1．4。3核赣疫蕊M．Mota构建了由腺病毒乙型晚期启动子的含PrYgD基因的真核表达质粒pMLPLO—gD用于免疫翁生仔猪，结莱显示对予来宦采曾免疫过的猪场豹仔猿秘经过抽强免疫1次的仔猪，能够产生中等水平的抗体。HO．TY(1998)等探讨了含gD蘩闲的重臻聪粒在体内免疫时闻和免疫效力。发现用该质粒肌注小鼠后在一年内能检测到IgM殿IgG，并免受PrV致死的攻击。Haagmans等1999年利蠲表运PR￥1D蒸鞭靛矮粒免疫小鼠与猪，结果辘诱导血清巾嚣l抗体与淋巴细胞的增殖反应““。VanRooij等用含PRV-gD基因的DNA疫苗免瘦猪．能诱导产生比禽gB和gc更强的中和抗体应昝”“。洪文洲等(2001)构建了2个表达PRYEa株糖礅白gD基因的舞孩表这痿粒搏为该黧疫蓥，经魏海注舞免疫实验动物13alb／c小甄，闯接ELISA检测小鼠庙L清中抗PRV的抗体，结果表明两种疫苗注射后，其滴度均在1：256以上，照加强免疫可以提高抗体水平”3】。Ai_Lj等(2001)利用减毒后的大肠杆黼作为PrYgD基因的制成的DNA疫茁，在小鬣体肉畿诱导产生保护蛙凫疫痤答，腻莉抵街臻鳃弃l量的PrY的攻击”“。DanielDory(2005)等进行了比较编码PrYgB，gC和gD糖蛋白的Sindbis痫毒源性载体质粒多种荆景单一注射对猪致死性伪狂犬病病毒感染后的缳护作』{j的研究，结屎表明，即使是单一注_鸯|13ug编秘PrV稽蛋蠡的Sindbis瘸毒源往载体矮粒也能瓣致死往傍狂犬瘸瘸毒瓣感染产生保护作崩”“。同年，E．Easell(2005)等进行了牛疱疹病舔1型gB—gD联合DNA疫苗在小鼠上诱母免疫反斑|{勺研究，结果与野毒株gB／gD结合质粒和单一质粒免疫组相比，采用包含BHV-1分泌型糖蛋白的联合疫萤在小靛体内靛镑诱发更离水平熬抗BHV一1中帮抗体““。E．￥．A．vanRooij(2006)等进行了伪狂犬痫繇gB—gD联含DNA疫苗在新生仔猪上的诱导免疫反应的疆究，结果表明与常短疫蘸捆逝，采用含有gB、曲基因的DNA疫茁免疫新生仔猪，能蟛诱导机体产生更高水平的体液免疫和细胞巍疫““。综上所述，PrY囊膜糖gD是PrY的结构蛋囱之一，具有重要的抗原表位，参与病毒穿簇过稽，奔导了瘸毒的纲躲闷扩散，在瘸毒感染鞍宿主免疫遭程中超着重要箨蠲，也是强藏瘦曲研究的热点。其分子和功能特性的研究对PrY作用机制，预防的研究有着重骤意义。4 莲蔫太学壤上学位论文第一章文献综述2、VP22蛋白转导作用的研究近年来，在对一些痫毒蛋白转染特性的研究中发现了几个小的黻段，能介导蛋白跨过细胞膜，将其命名为蛋白转导域(proteintransductiondomain，PID)，其所介导的蛋白跨膜运动称为转导”“。诚然，将蛋白；{入缁飚静方法有禳多，主瑟包耩物理方法(徽注射、电击等)，化学方法或生物打孔，粒子吸收或融含(脂质体法、细胞融台法)，但要使这些方法能够广泛巍翔，必须注意一些闷题，阮翅太鬣缓缒藐否在槎当＆匏一裁辩闳走接受试裁瓣处理，是否需霹外界的作用(如运用电场)，进入细胞的蛋白量有多少，各个细胞吸收的剂量魁否相同，细胞在处理中是否受到伤害或是发生改变等。以上所提烈的将蛋彝；l妇缨腿的方法也许在某一特定的情况下非常通用，但是它们的局限性非常大，瓶通过PTD进行的蛋白转释却几乎考虑到了上述所有闷题．现已证实此类转导不依赖于受体、通道、能量及臌吞作用t可以直接伟瑚丁．脂藏取分子艟完成跨麒运动。蜜验磷究迸发现，从病毒蛋内分离出的PTD簸携带异源蟹向、多肽、DNA等化合物转辱所有细胞。因此，它在赫因治疗的理论研究和实际运用中具彳f||=常广泛静{强景。1988年，Green和Frankel首次报道了蛋白转母现象，他们分别独立证实从HIV“1病毒势褰出来戆Tat蛋自8§够穿过缨瓣膜进入缨照，劳燕兵蠢生物活性秘菠确静缨飕定位”“⋯。E¨iott丰¨0Hare(1997)研究HSV—iVP22(HVP22)的亚细胞定位时，用显微注射单个细胞，闻接免疫荧光检测周嗣细胞发现在原始表达细胞周围，约200个细胞均可检测到VP22的存在，证实VP22具有蛋白转导功能”“。被证实具有较强蛋白转导功能的还有来源于果蝇的Antennpedia(Antp)蛋自。”1，及人单纯疱疹病毒l型(HSV一1)的VP22””““。随后，许多具有转导潜力的转导蛋白被发现，但是除Tat、ANTP和VP22外，其他蛋白转导能力均较弱。VP22是疱疹病毒间层的主要蛋白，是成熟蛋白衣壳与包膜间的皮层的主要成分。位丁病毒农壳与内膜之间，由病毒基因UL49编码，是一个辅助性的分泌蛋白，同时也是一个碱性磷酸化蛋向。VP22蛋白的开放阅读框由301个氨基酸组成，富含脯氨酸残基。AhaMartin等构建了一系列N一和C一端截短的VP22与GFP的融合载体，用以检测VP22开放阅读框中各个不同的功能特异区域”⋯。VP22能介导与其N一或C一端融合的蛋白一起在细胞间转运，即能将与其融合的有功能的蛋白携带到更多的靶细胞中“’，从而克服了基因治疗中存在的问题。与其他两种蛋白相似，VP22与转录调节有关，PTD是其与核酸相互作tl{J的区域。对三个蛋白的PTD结』{勾进行分析发现．它们都富含精氨酸和赖氨酸，这两种氨基酸与脂质相互作用对蛋白穿膜作Hj非常重要。试验证明这三种蛋白介导的穿膜方式不依赖于受体、通道、能量和胞吞作用。在4℃时，尽管胞吞作用已经失活，但PTD和PTD融合蛋白仍能够快速有效地进入细胞)Elliott等(1997)发现VP22PTD融合蛋白的载体与TatPTD融合蛋白的载体一样，在被转入细胞后所表达的蛋白均可在细胞间传递，但前者要比后者高得多。当在转染的细胞中合成后，VP22能够穿梭到周围的细胞并聚集在细胞的细胞核中。在培养基中加入VP22，它能够进入到培养的细胞中。而且当与效应基因如绿色荧光蛋白GFP融合时，VP22仍保持了它的转运特性。VP22可以参与P53蛋白的传送，外源VP22一P53的融合蛋白能够诱导P53阴性的人骨肉瘤细胞的程序性死亡从而导致更广的细胞毒性效果”“。LarsZender等构建了VP22一P53融台蛋白的表达载体并转染肝癌细胞。体外通过报告基田转录激活实验观察到了明显的VP225 鞭南人学顽{：学位论文第一章文献端述在细胞闻的穿梭，提高了肝细胞癌的基因讯疗效果。⋯。VP22能够在培养的细胞中扩散，不仅能够山现在袭达该蛋向的细胞质中，也可以出现在不表达该爱彝鲍l瞄迓缁腿弱您棱中。VP22没蠢经典鼹可敬翻静核定缱售号(NI。S)，宅在粕照问期被靶向的排除到表达细胞的胞质中，而在有丝分裂早期，从细胞质进入剽胞核，在那里立即’甥日胞染色质结含，经过整个有丝分裂期、染色质浓缩到F一个细胞分裂周期的G1期。蹑魏在表达VP22静缀熬孛，该蛩囱戆耍细藏定位是蔹缎纛分裂弼期掰调控静。矩在细稳分裂过程中，由最初位于细胞质中，到成为核蛋白的一部分。因此导致了VP22表达细胞数量随着时间的延长而增加。Zavaglia(2003)发现在露，}霜聚合了VP22静D27VP22囊粒秘坟含鸯VP22靛震粒转染细胞，两者在细胞中扩散效率相问，p27VP22具有抑制细胞周期蛋白／CDK2复食物的活性。而用含肿瘤抑制基因p27和融合了VP22的p27VP22质粒免疫裸鼠厢发现，后者较前者具有更强静撬瓣癌佟瘸。VP22焱纲艟中静转导和扩散髓力与融合了萁袍基因岛否关系不大，并蠢窀能螂携带分予量较大的蛋白进行转导而可能实用于药物的跨膜转运、靶向设计。Derer等发现转染细胞表达的YP22融合蛋白能氆细胞闾传递，并可在岗度分化的舰肉细胞中转导⋯⋯“，这一搴宴为提离孩酸疫苗的免疫效果撬供了薪的释路；VP22的细胞转絷谱较广。Lai(2000)将融合了绿色荧光蛋白(EGFP)基因和人疱疹病毒1型VP22慕因的HIV-1型慢病毒载体在体外分别转染COS-7纲胞、人齄脉络丛血管缨腿、人内皮细胞、H9细胞和IIela缨胞，能够在这些缎艟细胞和箍近细胞的筢竣和胞质检测到VP22一EGFP。丽直接用该质粒注射，j、鼠脑部，能飙注射部位小鼠脑部细胞和临_i珏细胞的胞核和胞质检测到VP22一EGFP”“。不仅HSv—l的VP22具有转导馋瘸，同羼予瘛疹病毒瓣的BSV一1躲BVP22、躺v—IVP22鲶也被证明簸有转导功辘；Harms(2000)利用EGFP作示踪，通过瞬畦表达证实BvP22也具有蛋白转导能力，并且Blff-1VP22的骚白转导能力比HSV—lVP22更强，但BVP22在细胞定位等方面与HVP22存在差异。Qiu(2004)跑较了BVP22摹鞋HVP22增强胸营激酶／更营涛书囊杀基因疗法在成聿牵经细胞癌串懿效累，发现较HVP22。BVP22更能够增加Etk／GCV的细胞薄性，但这种增强作用仅觅于被转染韵细臆中，而推测BVP22和HVP22在肿瘤系统的Etk／GCV自杀基因疗法中的作用并不是因为VP22将Etk转导至周潲细庭夏可缝是出予增强了在Etk缎藏肉匏效聚”1。Hung(2002)将融合了萼嶷亮氏病病毒MDV一1的VP22与入的乳头瘤病毒一16的E7基因的质粒和禽有E7基潮的质粒分别免痰小鼠发现，与E7的DNA疫苗相比MVP22一E7极大刺激TY一干扰索的分泌和E7特异性CD8+T细巍蓊髂豹生成，焉对小陵提供了强有力静瓣癌免疫⋯。撬示了其疑蠢罐臻D凇疫蓥佟臻鹣潜力。说明VP22在癔疹病毒中的功能是相对保守的。也提示了可能其他疱疹病毒的VP22具商蛋白转导功能，如PRV的VP22。VP22不仅其有转嚣蛋白静能力，还胃戳转导棱酸。基因转移效率是基因治疗疆域，特剐是核酸疫髓研究领域的一个关键阀题。而VP22的细胞间转移作用，可改善基翻治疗转移累统，挺离其转移效率⋯1，使其充分接触帆体的免疫系统，谢助予提高核酸疫苗的篼疫效果。VP22廷|fSV—i豹主要壳膜蛋白质之一，是魄49基因编蕊的蛋白质⋯，对染色矮滚和力强，VP22鼹示有细胞间扩散作用的特性“⋯。研究发现VP22可携带自杀基因HsV—TK在肿瘤细胞问扩散从两促进对脞瘦细胞的杀谯作用””。Normand(2001)将体外表选缝栊的ltVP22与荧光标记的短寡核苷酸(F-ODN)偶联，成功地将F-ODN母入体矫培养的细胞。迸一步研究靛现，将ha／P226 西南大学硕上学位论立第一章文献综述与人c—raf激酶基因5’端非翻译区的反义寡核苷酸偶联导入体外培养，能有效抑制A549细胞的增殖，表明通过HVP22转移的反义寡核萤酸具有功能”⋯。瞿索(2004)等VP22插入乙肝病毒的DNA疫苗中，构建重组DNA疫苗pcDNA3卜VP22一S，免疫小鼠。结果表明，VP22能够增强小鼠的体液免疫应答，同时经鼻腔免疫能够诱导机体的黏膜免疫应答”⋯。此外，还证实VP22可以有效转运核酶、RNA／DNA杂合体，进一步拓宽了VP22的应用范围。SergioC．0等分别用表达YFP抗原和YFP-BVP22融合蛋白的载体肌肉注射小鼠．结果发现应答YFP—BVP22免疫后产尘的YFP抗体比YFP明显增加。YFP—BVP22重组体诱导更强的Thl应答，而且YFP—BVP22基因免疫产生更大的T淋巴细胞毒性应答⋯1。Cheng(2002)利用Sindbis病毒做载体构建了表达HVP22与HPV-16E7融合蛋白的重组病毒颗粒，免疫小鼠后证实融合表达能显著增强抗肿瘤效麻。与VP22融合的肿瘤核酸疫苗，可通过较强的细胞毒性T细胞的作用，达到增强抗肿瘤疫苗的免疫效果。Kim(2004)用人乳头瘤病毒一16的E7基因DNA疫苗和含有VP22一E7融合基因的DNA疫苗免疫小鼠后，发现后者较前者在免疫小鼠的淋巴管中诱导生成了更多量的表达E7抗原的Dc细胞。另外VP22和E7基因的连接增加了被转染的Dc细胞的E7基因MHCI型抗原呈递。而增强了E_特异性CD8+T体细胞反应，并且E7一VP22增加了E7特异性CD8+记忆型T细胞的数量。因此提高了小鼠对E7表达性肿瘤长期的抵抗能力。马道修等(2005)构建人巨细胞病毒(HCMV)主要被膜磷蛋白pp655(XCMVp065)基因高表达载体以及VP22．pp65联合表达载体，免疫试验小鼠后发现，小鼠脾细胞上清中IL一2和IL一4含量以pVP22．pp65组(411．11Pg／m1、76．10pg／m1)最高，IL一2生物学活性也以pVP22．p065组(A值为0．22)最高。结果表明：VP22可大大增强p065核酸疫苗的体内免疫“”。VP22作为核酸疫苗免疫反应的佐剂，其VP22结合抗原刺激的免疫应答要优于标准的DNA疫苗的研究结果，为进一步提高核酸疫苗的免疫效果，尤其是为克服其在大动物中免疫剂量大、免疫次数多并且效果不好的缺陷提供了新的思路。7 西南人学硕士学位论文第一二章研究目的意义第二章研究目的意义核酸免疫和核酸疫苗足在基因}f}疗研究基础上发展起来的’种新的免疫学理论和方法，从一提出即引起人们广泛的兴趣，并在短短的时间内取得了巨人的发展。核酸疫苗因其安全、有效、研制简单、生产成本低等优点，已经成为人们研究重大疾病免疫预防的主要方向之一。伪狂犬病毒成熟的病毒粒子约有50种蛋白质，包括各种糖蛋白。其中，已有11种糖蛋白被鉴定，并分别命名为gB、gc、gD、gE、gH、gl、gK、gL，gM和gN。他们在病毒与细胞的相互作用，病毒感染的病理过程和免疫原性中各具特殊作用。囊膜糖蛋白gD，是病毒最主要的免疫原性成分之一，在病毒的感染和增殖过程中具有重要作用。研究其基因组和蛋白结构对伪狂犬病的防治具有极为重要的意义。蛋白转导(Proteintransduction)是近年来生命科学领域发现的一种独特的现象．其高效的跨膜转运功能和在细胞问自主传递的特点，不仅彻底打破了传统的基因转移模式，而且为人类基因治疗和新型疫苗研究提供了新的思路。VP22是疱疹病毒家族保守的蛋白分子具有蛋白转导的结构域。VP22及与其他基因与之融合的蛋白能够在细胞问传递。这种蛋白转导功能不依赖于受体、通道、能量和胞吞作用。VP22转导细胞的细胞谱广。来源于人单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、牛疱疹病毒I型(BHV-1)和马立克氏病毒I型(MDV-1)的问质蛋白VP22先后被证实具有蛋白转导特性。但与HSV-1、BHV-I和MDV-1同属a．疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒(PrY)VP22是否也具有相似的蛋白转导特性以及VP22的蛋白转导是否也能增强DNA疫苗的免疫效力目前尚不清楚。对这些问题的研究不仅可丰富蛋白转导的理论体系，拓宽蛋白转导的应用范围，而且如果能够进一步的进行试验还有望阐明a．疱疹病毒VP22蛋白转导的作用机理．为人类基因治疗和新型高效疫苗研究提供更有效的工具。本试验以编码中国猪伪狂犬病病毒标准毒株一鄂A(Ea)株gD蛋白的基因片段为材料，以p3XFLAG．CMV-IO作为质粒载体，构建PrV-gD基因核酸疫苗，检测其诱导的体液免疫和细胞免疫水平，以及对试验小鼠的保护，同PrVgD基因核酸疫苗pCDDI纠进行比较，同时，将伪狂犬病病毒gD蛋白基因与VP22蛋白基因融合，研究VP22蛋白对PrVgD基因核酸疫苗的免疫增强作用，为开展猪伪狂犬病基因工程重组疫苗、弧单位疫苗等新型疫苗的研究，以及为开展动物的其他传染病的核酸疫苗研究提供试验依据。8 两南大学硕士学位论文第三章材抖卑方法拦曼曼詈鼍皇兰嬲鼍鼍曼曼鼍邕■蜮s苎!II————————皇I嘲——_皇第三章材料与方法3．1试验材料3．{，{毒拣、细艟与麓种猪伪征犬病毒(PrV)鄂A(Ea)株，为高致病力毒株，由华中农业大学功物病毒室惠赠。猪鹜传{℃细麓PK-15，由华中农韭大学动甥癌毒室嫒送。大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)均由本实验室保存。3．1．2载体与质粒3．1．2．1克隆载体pUCll9由西南入学动物科技学院举继祥副教授惠赠。pUCll9是磅麓魄较完善的糕蔼粒载体，对，}漳DNA冀段豹大小不那么敏懑。势麓绦罄了pUC质粒在克隆操作方面的优点在pUCl8／19中增加了带有M13噬荫体DNA合成的起始与终止以及包裟进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列(1G)，当禽这些质粒的细胞被邋当的M13丝状噬藤薛感染时，可舍袋矮粒DNA静其中一条链，并毽装在予代蠛藏体颗粒串。通过纯化噬荫体颗粒，可制备单链DNA，用于DNA序列测定、定点诱变或制备探针。3，l。2．2真核表达质救载体p3XFLAG_c骶—M．10由吉林大学裔昌博士惠赠。该质粒载体是pBR322质粒裁体的改良．其复制其始点来自pBR322，含商一个氨苄抗性蒸因和一个鞭霉素抗性基因，以及一个SV40强启动予。除此以外，还其有～个MCS羚段。其中包括HindllI，Notl，EcoRi，置g≠珏，EcoRV，琢mI，XbaI和BamHI位点。其有方便实片J，易于检测重组子等优点。3．{．2．3pcDD秘pMD-VP22含有PrvEa椿gD基因和VP22基因DNA序列的熏组质粒pcDD和pMD-VP22出华中农业大学动物病毒室惠赠。3。1．2，4蔽棱表达载体pET28a(+)由本实验室保存。pUCll8&pUCll9cloningsite9黟舅群等奄 “⋯“。”““”量童奠￡蕊鞘曩激黝H■—盘-■^Ⅲq”MultJpf0￡f删In日SI瓣1k2￥f蚺0f¨v4‘{q#j“t嘏￡qv10’———■—■瞄勰翻盏嚣鬻慧黧■———㈧-‘·¨-}⋯⋯●}-⋯●}}⋯●，’r{⋯T’l’’⋯f，l。．^^J‘■．E●⋯‘。。．～．⋯⋯，’⋯j⋯’t’⋯—■瞄麓麓篡篇曩要墨■■^¨，t，’i⋯‘；‘●}‘_F|’ft}。a⋯H。+，⋯，{·≈⋯●4’*，o+”‘’一⋯，⋯··{‘：‘·s’}。+⋯一⋯一。。+’⋯、、”10一嘛时¨=≯～暮 西南大学硕上学位论文第三章材料与方法3．1．3主要试剂T4DNA连接酶、dNTP、DNAmarkerDL2000及DLl5000，以及各种限制性内切酶为人连宝生物公司产品；氨卞青霉素(Amp)、卡拉霉素(Kar)为Invitrogen公司产品；DNA回收试剂盒为上海生T生物工程有限公司产品。TMB显色试剂为Promage公司产品；溶血素为叻公司；犊牛血清为杭州四季青生物公司PRVEa株全病毒包被ELISA检测试剂盒购白武汉科前生物技术公司：其他药I铺平¨试剂为分析纯。3．14试验动物6-8周龄的雌性Balb／c小鼠购自重庆医科大学小动物实验中心。3．1．5抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠lgG、FITC标记的兔抗鼠CD8Ⅱ、鼠CD4、F1TC标记兔IgG2a阴性对照为SEROTEC公司产品。3．{．6主要仪器流式细胞仪蛋白质电泳仪电转仪BiOmetra梯度PCR仪ePehdOrfCentrifuge5415R高速冷冻离心机ePendOrfCentrifUge58l0R高速冷冻离心机uvitec凝胶成像仪TOMYSs一325高压灭菌锅HjtachiUVVIS紫外分光光度计2F一90刑暗箱式紫外透射仪DYY一6C型LI土泳仪SW—CJ～2FD型双人单面净化工作台TS一1型脱色摇床79—2磁力加热搅拌器GNP一9160隔水式恒温培养箱Mi1liDOre纯水仪SANY0sIM—F一124制冰机802型电热恒温水箱DHG一9146hl也热恒温鼓风干燥箱THZ—C恒温振荡器】1FITC标记的兔抗美国北京美国德国美国日本上海北京苏卅I江苏上海美国日本北京上海江苏 3．{+7鬻用溶液豹§a割3．1．7．1液体LB培养基：胰蛋臼臆10．0g，酵母没出物5．0g，NaCI10．0g，溶予ddHzO中，完全溶解后用5moULNaOH调硼俊至7．0-7．2，定察至1000．0ml，谯15磅高罐“F蒸气灭藏20rain，窒温僳存。3．t。7．2固体LB培舞基：在LB液体塔舞基中加入琼脂粉至终浓度为l，5％，在15磅离压下蒸气灭菌20min。待培养蒸潍度降至50"C友右，加入相应的抗生素后，诵制平扳。待绪养基凝固艏，于4℃僳存备用。3，1．7。3氨苄毒撵蠢：羽缝永配制50mg／ml德存渡，过滤昧莹，．20。C僳蠢备用，上馋浓度为509edmlo3．1．7．4IPTG：将29IPTG溶予8ml纯水中，待其完全溶解蔚用纯水定容鬣10m!．用0．2yam滤嚣避滤豫落，分鼗垂-20*(2保存器羽。3．1．7。5Sl翻：根攒备引物分予鳖，用纯水配制，储存浓度为109mol,q，分装囊-20℃保存备用。31．7．650xTAE电泳缓冲液：242．09Tris碱，57．1ml冰乙酸，100．0m10．5mol／LEDTA，pH8．0，热ddH20定寨至1000砖。3．1．7。7髓}缓渖波(p}|8。O)：10，0mmoL／LTris-HCl，1．0mmol／LEDTA。3．1．7．8溴化乙锭溶液(EB)：在100mlddHaO加入19溴化艺锭，磁力搅拌使其完全溶解，棕色髓室漩避3．1．7．913％PEG8000：PEGS000139，NaCl9．359，加ddHaO至100ml是容。3．1．7．100，8％璩船糖凝胶：辫取0．89璩m＆糖放入100ml1×TAE缓冲波中，混匀，微波炉巾热热健琼脂耱完全溶勰，冷却到50℃，倒入模扳中，插入梳予。冷却撵目完垒凝圈，拔出梳子。3．1．7．11质粒提取I、Il、III液：溶液|：50mmol／L蕊糖糖，10mmol[LEDTA，25mmol／LTris-C1(pH8+∞，裹压灭麓舞羹4"C摄存蚤耀。溶液Il：0．2mol／LNaOH，1％SDS，现配现闲。溶液lll；3molJL乙黢锋，球酪黢谰pH傻至4,8。3。1．7．12SDS．聚褥燎酰酸凝黢宅泳(SDS。PAGE)缓冲渡5×Tris-甘氮酸电泳缓冲液：Tris碱7．559，付氨酸(电泳级，pH8．3)47g，25ml10％SDS(电溶缀)．加adH：O溶解定容至511)I)ml。30％聚瓣烯虢跛母渡：将299瓣矮虢胺稆lgN，N’-程鳟l双霹爝醚胺溶于60mlddH20巾，加热受37"(2溶解，定容麓100ml，4。C避光保存备用。12％SDS聚丙烯酰胶(分离腔，lOml)：承3．3rrd，30％雨烯酰胰潞渡4ml，1．5mol／L骑is(pH8．8)2，5ml，10％SDS0．1嘲，10％遘硫酸铰氇l描l，TEMED0。004撙l。5％SDS聚闲烯酰胺(积层胶，3m1)：水2．1ml，30％诩烯酰胺溶液0．5ml，1．0mol／LTris(pH6．8)0．38mt，10％SDS0．03Tnl，10％过硫酸竣0．03Illl，TEMED0．003瞄。2xSDS凝胶加样缓冲液：100mmol，LTfistHCI(pH6．8)，200mmoUL二二硫苏耩簿0)Tr)，4％SDS(电辕级、，0．2％溴酚监，20％甘油。考马鲰亮蓝染色液：90Hn甲酵：水(1：1)，10ml溶己酸，0。259考马斯亮篮R250。12 西南大学顸Ij学位论文第三章材料与方法脱色液：90ml甲醇：水(1：1)，10ml冰乙酸。3．1．7．13Westernblot缓冲液电转缓冲液：39mmol／L甘氨酸，48mmol／LIris碱，0．037％SDS(电泳级)，20％甲醇。配制1000ml转移缓冲液，需称取2．99甘氨酸，5．89Tris碱，0．379SDS，加200ml甲醇，加水至总量为1000ml。TBS(pHS．0、：10mmol／LTris·HCI，150mmol／LNaCIaTBST：含0．05％Tween．20的TBS。Westem-b|ot底物液：针对HRP标记二抗的TMB显色液为Promega公司产品。针对HRP标记二抗的化学发光底物液为Pierce公司产品。丽弁红S(10x)贮存液：29丽春红S，309三氯乙酸，309磺基水杨酸，加水至100ml。3．2试验方法3．2．1gD糖蛋白基因片段的扩增及VP22蛋白基因片段的PCR扩增3．2．1．1引物设计及合成根据编码两种蛋白基因的序列资料，利用Primer软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成。分析了gD基因及克隆载体pUCll9多克隆位点上相关的酶切位点后，设计引物P-gd-1和P-gd-2，以便通过PCR扩增，在gD基因上下游引入HindIII*UPstI位点：分析了VP22蛋白基因及pUCll9载体多克隆位点上相关的酶切位点后，设计引物p-VP22．1和P-VP22．2．通过PCR扩增，在VP22基因上下游引入劢aI和EcoRI位点．如表1。表1扩增曲基因和VP22基因的引物序列TablelCloneprimersequenceofgDseneandVP229ene名称引物序列酶切位点P-gd-15’-TCTAAGCTTAATTCCGCGCCCCAGGTI"CCC-37P-gd-25’-'ITrCTGCAGCGGACCGGGCTGCGCTITTAG·3’P-VP22．15，一CTCTCTAGAATGTCCAGCTCGAGAAAGAC·3’H汛dIIIPstIXbalP-VP22．25，．GCCGAATTCTTATITATACACmTCCCrrCC'G-3’EcoRI注：1为卜游引物，2为下游引物3．2．1．2PCR扩增目的基因取一灭菌PCR管，依次加入灭菌纯水12．259l、DMSOt．2sgl、10xPCRreactionbuffer2．5#1MgCl21．却l、dNTP耻l、P1P2各0．5#1、TaqONA聚厶M0．5#1，templet驯·反应体系总体积为25F,1。 西南人学硕士学位论义第三辩村料oI方法反应条件：扩增gO揍囡：95℃5rain，94℃lmin。64℃50s，72℃Imin德环34次，72℃9rain，4"C终|卜。扩蹭VP22蒸闲：95℃5min，94。C50s，60℃50s，72℃lmin循环34次，72℃9rain，4X3终斑。3，2．2PCR产物壤羰糖壤泳3．2．2．j根据所需浓度，称载0．89璩目☆糖被入三角簸中，加入100mlIxTAE电泳缓冲液；3,2。2。2微波炉加热，使璩8B糖完全溶解；3．2．2．3在模其⋯端插入梳子，待冷却液体至50。C最，饲入模其中，凝胶謦皮为O，4ram左右；3．2．2．4待琼确糖胶块凝麟墨乳白色辩，敷出，将胶浃小心艘入电泳穗中，健样黼砘一端位于奄泳糖受极端：3．2．2．5向屯泳槽中加入j×舱-E屯泳缓冲液，液疆高于胶面lcm左右，以便使电泳时凝胶两端电压几乎与外加电压相等；3．2．2．6数出PCR产物，鞘离心基，墩底帮液钵与土撑Buffer混匀磊。分剐翱入样撼孔中，在样赫旁边一孔加入2000DNAMarker；3．2．2．7检查斑负极插孔詹接通电源，将电压调至95V：3．2．2．8观察电濠穗况，校据搂其上靛标识条带，褥撵晶基本迂移至倒数爨三接辩，鳐建电泳：3,2．2，9取氆黢块，放入EB中染色』I蠢，予紫辩灯下溉察电浓结浆，切取楣废条带。3．2．3电泳产物鲤收产貔回牧饺捌上海生：j：：UNIQ，10{熏式逶瘸DNA缝钝试剡鑫3．2．3．1使用干净的手术刀割下含所嚣网收DNA的琼脂块，放入1．5ml离心管中；3．2．3。2按每100rag腔翱入400／dBindingBuffer11，混匀箍鹫予50—60"C承浴审10rain，使黢块戆赢融纯，娴热融骏器寸簿2rain滋匀一次；3．2．3．3将融化的胶溶液垒部转移到UNIQ。i0柱，加入2mlCollei：tionTube，室滠放鬣2rain，80∞f确in室游离心Imin；3．2．3．4取出UNIQ．10控，弃去离心鬻中靛褒液，将往孑敖圈弼一离心营中，热入500,alWashSolmion，10000r／min室温离心30s；3．2。3．5重复第4步～次；3．2．3．6鞭下UNlQ*lO较，究去营中全都菠液，将柱子放弼弱～离心蛰中，10000r／min室瀑蕊。心30s，以除去残魉WashSolution；3．2．3．7将柱予放入新的干净的1．5ml戏2ml离一心管中．在柱予中央加入100畔1默ution，室激放溪2rain(握商洗脱液的温度至55—808C有利予提商DNA的洗脱效率)；3．2．3．810000r／rain室漫离心lmin，收集管中的液体翱为鄹收靛DNA持段，可立即使用或．20℃傈孬。l《 西南大学颂l‘学位论_盘：第三章材料与方法324目的DNA与载体的连接PCR产物与载体的连接，其方法参照《分子克隆》第三版㈦。取一灭菌PCR管，依次加入载体Ⅵl、1"4DNA连接酶耻l、'I"4Buffer跏l、DNA片段靴l，迎接体系总体积10“l：16"C过夜反应。3．2．5大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)3．2．5．1从人肠杆菌DH5a或BL21(DE3)平板中挑取一个单菌落，接种于2ml液体LB培养基中，37"C300转，分剧烈振荡培养5．6h，4"C保存备用；3．2．5．2取250ml灭菌高压瓶一个，无菌转入50ml液体LB培养基和500#1上述保存之菌液，220r／min，2h(菌液早云雾状即可)，取山，迅速冰浴30mira3．2．5．3无菌条件下将菌液转移到～个无菌的州冰预冷的50“聚丙烯离心管中，于4"C4000r／min离心10min，弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽；3．2．5．4加入10m1预先冰浴的0．1mol／LCaCl2重悬沉淀，吸管吹匀，冰浴30rain；3．25．54"C4000r／min离心10min。弃上清，沉淀中加入2Inl用冰预冷的0．1mol／LCaCl2重悬。悬浮的感受态细胞可马上用于转化；如需要保存，则应加入无菌甘油至终浓度为15％．然后按0．1ml／管分装，保存于一80℃冰箱内备用。3．2．6连接产物的转化取感受态细胞于0*C复苏，30min；加入2“l质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；42"C热冲击，90s后迅速冰浴2—3min，每管加入液体LB培养基印叽l，210r／min．增菌45min；稍离心，无菌条什F弃去上清液，余O．1ml，用加样枪吹匀；均匀的涂布于预先制各好的氨苄青霉素同体LB平板上，将平扳置恒温水浴培养箱中，37"(2培养至山现单个菌落。3．2．7质粒的小量制备3．2．7．1挑取平板上的单菌落，接种到3ml氨苄青霉素液体LB培养液中，37"(2300r／min振摇培养过夜；3．2’7．2将菌液转入1．5ml离心管，5000r／min离心集菌3min，倒立离心管，除去残留菌液：3．2．7．3每管加入冷藏I液10叽l，吹散，涡悬后冰浴5rain；3．2．7．4每管加入鲜配II液200#1，反复颠倒，充分混匀后冰浴5rain；3．2．7．5每管加入冷藏III液150“l，颠倒混匀后冰浴5rain；3．2．7．6经5℃。12000r／min离心5min后，移上清液至新离心管；3．2．7．7加入等体积1：1酚仿混合液，振荡混匀，冰浴5rain，12000r／rain离心5min，移上清液至新离心管；3．2．7．8用2．5倍上清液体积的无水乙醇，1／10体积的3MNaAe室温沉淀核酸，振荡混匀后置于．20℃，冷冻1h：3．2．7．9经12000r／min离心10min后，小心吸去上清液，倒置离心管以除去管中残留液体：3．2．7．10用75％乙醇洗涤DNA沉淀后，37"(2烘干；3．2．7．11每管JJnA,20plRnase(20#g／m1)，放置于56℃恒温水浴锅中，30rain后取出·-20℃保15 西南大学硕士学位论空第三章材料与方法存备用。3．2．8质粒的酶切鉴定取一灭菌1．5ml离心管，依次加入灭凿纯水1毗l、质粒DNA私l、10xBuffer和l、相应的两种限制性内切酶各弘，反应总体积20／uh将离心管置于恒温培养箱中37"C反应过夜，取舢l进行琼脂糖凝胶电泳分析。3．2．9PCR产物与克隆载体的连接取pUCll9质粒2q“l，采用核酸内切酶HindIII和AfI酶切厉，试剂盒同收片段，将gD基因PCR扩增产物与pUCll9载体按3：1的比例放入连接体系，加入l／tlT4DNA连接酶，“l10xBuffer，使反应总体积为1叽l，16"(2水浴过夜，构建质粒pUCll9-gD，如图1。取pUCll9质粒2叽l，用核酸内切酶XbaI和＆嘏I酶切后，回收基因片段，连接VP22基冈PCR扩增产物，构建质粒pUc—VP22，如图2，连接体系同上。采用核酸内切酶XbaI和EcoRI酶切pUCll9一gD。回收片段，与VP22基因PCR扩增产物连接，构建质粒pOc—gO-VP22，如图3，连接体系同上。以上三种连接产物pOCll9-gO、pUC-VP22和pUC-gD—VP22转化感受态细菌E．coliDH5a，通过增菌，质粒小提后，双酶切鉴定。图1pUC-gD构建图Fig1contractionprogramofpUC-gD16图2pUC—VP22构建田Fig2COIIIflICIJONpmgramofpUCoVP22 西南人学硕j‘学位论文第三章材料与方法II圈3pUC—gO—VP22拘建围F}g3ConstructionprogramofpLcC-gD-VP223．2．10PCR扩增产物序列测J芋褒以主掩建靛痿靛pUCll9-gD、pUC-VP22程pUC-gD-VP22，经PCR、鼹酶韬鉴定嚣，送上海博距生物工程公司测序。3．2．11原核表遮矮粒a≈构建取原核表达裁体pET28a(+)209l，用核酸内切酶HindIII和EeoRI酶切，试裁盘阐收片段{用相同的核酸内切酶酶切质粒pUC-gD、pUC．gD-VP22，试剂盒回收目的片段gD和gD-VP22t将嚣个基因舞段分剐与pET28a(+)载体接3：t的托辚放入连接体系，加入韬lT4DNA连接酶，1“l10xBuffer，使反应总体积为lOal，16"C水浴过夜，构建原棱嶷达质粒pET-gD、pET-gD·VP22，如图4、图5。瞄4原核表述瑷粒pET-gD的构建Fig4ConstructionoftheplasmidpET-gD17 西南大学硕t学位论文第二三章利料与方法图5原核表达质粒pET-gO·VP22的构建FigSConstructionoftheplasmidpET-gD-VP223．2．12真核表达质粒的构建取p3XFLAG质粒20,u1，用核酸内切酶HindIII利EcoRI酶切，试剂盒回收片段：将gD基因片段和gD—VP22基因片段分别从中间载体pUC-gO利pUC．gD-VP22上切下，回收片段：将两个基p习片段gD利gD—VP22分别与真核表达质粒连接(方法同上)．构建真核表达质粒p3XFLAG-gD、p3XFLAG-gD·VP22。3．2．13质粒的大量制备3．2．13．1挑取单个菌落，接种于75mlLB培养液，37。C300r／min培养过夜，8000r／rain5rain，收集细胞沉淀：3．2．13．2加入冷藏I液4ml，吹散，涡旋，冰浴5min；3．2．13．3加入鲜配II液8m1，颠倒混匀，冰浴5min；3．2．13．4加入冷藏加I玎液7．5ml，振荡，冰浴10min。4"C10000r／min15min；3．2．13．5移上清液至新离心观，加0．6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置30min后，室温10000r／min离心10min；3．2．13．6弃上清，沉淀用75％乙醇漂洗1次，真空抽干或自然干燥，加1．5mlTE巫悬。3．2，13．7加1倍体积即1．5IIll冰预冷的5mol／LNH4Ac，混匀．4"C10000r／rain离心10rain：3．2．13．8移上清液至7IIll的离心管，加1倍体积即3ml的异丙醇混匀，室温静置30rain后，12000r／rain离心15min：3．2．13．9弃上清，』=fJ75％乙醇漂洗1次，真空抽干或自然干燥，加500uiTE重悬．并转移至】8≯瑟 西南火学硕士学位【仑立第三章材料与方法1．5ml熬离心鹜{3．2．13．10加入通黼的RNase，56℃30rain除RNA：3。2．13．11加1倍体积的13％的PEG8000(含1．6mol／LNaCI)，混匀，室温静置30min，12000r／min藏心10rain，弃土清，翔400tdTE重悬；3．2．13．12加等体积苯酚：氧仿：异戊醇抽提2次，氯仿：器戊醇抽提1次：3．2．13．13加10Q“l10mol／LNH,Ac，充分混匀后，加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，混匀后室瀑静麓3emin。4℃12000r／rain离心5～∞min；3．2．13．14弃上清，沉淀用75％乙醇漂溉1次，真空柚干或自然千燥，加5触lTE或H20溶解，置。20℃器刚。3．2．14靡核表选(IPTO诱导)3．2．14．1将重组表达质粒葶Jl空白载体分别转化BL21(DE3)感受态细胞；3。2。14，2在转纯的平噩串魏敬革个蓬落缓耱手含楣波抗生素豹3mlLB液体墙葬萋巾，37℃摄荡培养约10～12h，至0D㈣达到0．6—1．0时，放入4℃冰箱过夜；3．2．14．3取出培莽物，5000r／rain离心5rain，然席崩新鲜LB洗涤1次，沉淀用3mlLB悬浮；3．2．14，4取10Qul接种子lO越各辐寝抗生素的薪祥LB滚傣培养基孛，3TC振荡墙券鳕强。至OD600达到0．6—1．0时，加IPTG至终浓度为0．8mm01／L。继续培养3hi3．2．14．5其问每黼lh(在第0、1、2、3h)取1ml菌液至EP管中；3．2．14。6将收集予EP管中的缁甾5000r／rain离心5rain，弃上清，趣lOqui无藿去离子永唆敖混匀；3．2。14．7热珀鼢l2xSDS凝黢抽样缓冲液，溜匀艨沸承港5rain；3‘2．14．83-12％的SDS．PAGE电泳检测重组蛋自的表达。3，2．15聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)3．2．15．1吸取已经处理的榉晶l和l，加入蛋白电泳凝胶的葫样张中，再小心堍向电泳槽中加入l×营氨酸电泳缓冲液；3。2．15．2接通电源，调节电毯至80V，30min；3．2，15，3调=霄电驻至150V凝电泳完毕；3．2．15．4取山凝胶，置于SDS。PAGE凝胶染色液中．37"C缓慢摇动35mln，进行染色；3．2。15。5取毒凝骏，翔蒸壤永掉簿多余的染液，饕予SDS—PAGE凝菠黢鬯滚中，反复脱色，塞至底色基本褪去。蛋白条带清晰可见。3．2．16Westernb}ot3．2．16．1转膜：当SDS-PAGE电泳结碾后，采用半千转移法转印硝酸纤维素膜，转膜时间～般为2h。转膜绌康后，丽窬红染色至膜上出现蛋白质条带，_}{=|软铅笔标出作为分子燮标准的参照瓒自的位置，然曩蠲麦燕子永漂淡硝酸纾维素瓣骥，其润换采数次；3．2．16．2封闭：把硝酸纤维索滤膜放入可加热封搂的杂交袋中，以滤膜黼积O．1--0．15ml／em2的量加入封闭液f禽1％BSA的TBST)，尽可能排除气泡后密闭袋口，平放于播床上室温温宵19 两南大学硕上学位论文赫兰帝村料t，方法110。5-lh：3+2．16．3每一抗结会：将硝酸纤维紊膜转移捌凝的杂交袋中，按0．1～0．15ml／cm-’的鼙热入翊TBST稀释的一抗(多抗1：100：单抗1：500)，州昧点=c泡历密封。半放丁摇膝上室渝滞育lh。TBST洗3遍，每次5～10rain；3．2。16．4勺二抗结合：将滤膜转移至6耨的杂交袋中，按O，1～0．15ml／cm2的避加入用TBST班1：2500(TMB为底物)稀释的辣根过氧化物酶标记的-抗，塑漱温育0．5一lh。TBST洗3遍，每次5～10rain。再塌TBS洗2遍，每次5—10rain；3．2．16．5醺色：如粟以TMB为底物，则将硝酸纤维素滤朕放入10ml底物液中，显色l一15min．一口出现鬣白带，立即用去离一f水终Ir，照像。32．{7簇辕DNA缝壤萃瑟浓度的溺定3．2．17．1在4mlddH20中，加入样品质粒DNA4pl，枞匀。3．2．17．2程紫羚分光光度计260／280nm筵，翊ddH20分期调零慧，对稀释的撵撼光密艘毽进行测定。3．2，17．3OD260=0．66的溶液般链DNA的含量为33ag／ml。即质粒DNA的含量一质粒OD260／0+66×3耘g／waX凄粒DNA静体积。疆逶过OD260：OD280的魄蕊求簿量质疑DNA中蛋白成的污染情况【52】。质粒DNA的纯度达到OD260：OD280>：，1．8，即可用来免疫动物。3，2。18试验动物分缎．将84只Batb／c小鼠随机分为pcDO、p3XFLAG—gD、p3XFLAG、pCDNA3．1、p3XFLAG～gD-VP22羽l空向对照六个组，每组14只。3．2．19疫萤免疫小鼠根据分光光度计测定免疫质粒的浓皮，J：{jPBS稀释为1∥g，弛l，厉腿肌肉注射进行免疫。拜l5鼯l缀爱翔桴针缀敬质粒漆渡，注射小弑黢四头莲氇，l∞薛l，R。每lS天免疫一次，共免疫两次。予首次免疫后簿2周、第4周，第6周断尾采赢，分离血清。3．2．20问接ELtSA检测小鼠愈清IgG于荫免厉第2周、第4周，第6周断尾采血。分离吼清。将特检血清稀释后加入酶标板，】o融l，孑0予37"C遴鑫反应lh，200#孵L洗涤5次后翔入1：5000兔抗鬣IgO-HRl'踊榉赫稀释液稀释)m0Ul，孑L，374C湿盒反廊1h，经洗涤后加入TMB底物10q“l，反应15min．最后加入5铷l2moFLH2S04终{E反应终it反应，用酶标仪在630rim波长下测定OD值。3．2．21细胞流式援术检测T淋巴细胞亚群3．2．21．1斑样的采集备免疫纽分掰予蕾次免疫麓第二、圈、武厨备隧极选取蘸R，l、虢瓣眼球采矗，努鞠墩200u1／只加入有EDTA抗凝剂的抗凝管中，使用美国BD公司流式宴|I|胞仪测定T淋巴细胞艟群的 两南人学顺J一学位论文第三章材料与方法变化情况。3．2．21．2流式细胞仪测定T淋巴弧群3．2．21．2．1l双PBS(pH7．4)液稀秆的抗凝tfnlml，沿管壁缓慢加入剖已装有m1的淋巴分离液离心试管中，2500r／min离心25min；3．2．21．2．2吸取淋巴细胞分离层于另一管中，再加入PBS(pH7．4)，振荡，3000r／min离心5rain，弃上清液(沉淀反复用PBS洗两次)。沉淀的淋巴细胞用PBS重悬为细胞悬液待用，细胞含量为1．6x106个：3．2．21．2．3取三支干净试管，分别加入20ulFITc标记的单克隆抗体兔抗鼠CD4、CD8a和FITC标记的兔]gG2a阴性对照，，加入细胞悬液259l，放入4。C冰箱，30min后取出；3．2．21．2．4各管加入5蛳lPBS液．振荡混匀．3000r／min离心5min，弃上清液(沉淀反复心PBS洗两次)，沉淀中加入5吼lPBS液，振荡混匀，j1{流式细胞仪检测104个细胞中CD4+}IICD8+T淋巴细胞百分含量。3．2．22攻毒保护性试验3．2．22．1病毒TCID50值的测定在PK-15细胞上增殖病毒。取无菌收获的待测病毒液，用细胞生长液作10倍系列稀释，依次加入到96孔细胞培养板第1．10列，每个稀释度加8孔。100ul，孔，第11．12列加等龄的细胞生K液作对照．然后加入细胞悬液100u1／：／L(细胞量约为3×105个／m1)，置37"C含5％C02的培养箱中培养3-5d，逐日观察井记录结果，采阁Reed．Muench法计算病毒的滴度⋯。Reed—Muench法计算方式：先计算出各稀释度的病毒液引起的病变和非病变的累积细胞jL数．按下述公式计算山距离比。高于50％病变率的百分数．50％距离比例2磊千j鬲磊再西五万占芬五jiF磊磊磊；；j晶百分数TCID50=高于5％病变率的稀释度的对数+距离比例X稀释因数的对数3．2．22．2动物免疫试验所有试验动物均于第二次免疫后第4周经脚掌皮下接种进行病毒攻击试验，剂量为100u1／只，攻毒后逐日观察动物的临床症状、死亡情况。3．2，23统计学分析采用SPSSll．5软件进行数据分析。21 第四章试验结果4．1伪狂犬病毒Ea株gD基因，VP22蛋白基因的克隆与鉴定4．1．1质粒pUC—gD、pUC—gD—VP22和pUC—VP22的酶切鉴定取试验构建的重组质粒pUC-gD舢l在2诹l酶切体系中．用核酸内切酶HindIII和PstI进行酶切，3TC反应过夜。取劬l进行琼脂糖凝胶电泳分析，出现两条明亮带，一条约为1300bp左右，而另一则大丁I2000bp，如图6：图6pUC-go的酶切鉴定Fi96IdentilicalionofpUC—gDbyrestrictionanalysisM：DNAmarkerDL20001、2、3：pUC-gD／HindlIl+PstIf1300bp)对用融合基因gD—VP22构建的重组质粒pUC-gD-VP22似l，用核酸内切酶HindIII和肪棵I进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析发现，在2000bp左右和约3000bp左右分别出现明亮条带，如图7。图7pUC-gD-VP22的酶切鉴定Fi97IdentificationofpUC-gD-VP22byrestrictionanalysisM：DNAmarkerDL20001、2：pUC-gD—VP22／HindllI+EcoR1(2000bp) 西南大学硕士学位论文第四章试验结果对构建的另一质粒pUC-VP22进行酶切，在20#1酶切体系中，用Xbal和EcoRl酶切、37℃反应过夜，取舢l进行琼脂糖凝胶电泳，可见有两条明亮带，一条约750bp左右，而另一条大于2000bp，如图8。4．1．2测序结果图8pUC-VP22的酶切鉴定Fi98IdentificationofpUC-VP22byrestriction¨alysjsM：DNAmatkerDl,20001：pUC—VP22／Xba1+EeoⅣ750bp)为证实构建的质粒中是否插入目的基因片段，将gO基因、VP22基因PCR产物与克隆载体pUCll9的连接产物，及携带融合基因gD—VP22的质粒pUCogD-VP22送上海博甄生物．I：程公司测序，测序结果如图9、图10和图11。肌ndⅢaagcttaattccgcgccccaggttcccatacactcacctgccagcgccatgctgctcgcagcgctattggcggcgctggtcgcccggacgacgctcggcgcggacgtggacgccgtgcccgcgccgacc_I：tccceccgcccgcgtacccgtacaccgagtcgtggcagctgacgctgacgacggtcCCCtcgcccttcgtcggccccgcggacgtctaccflcacgcgcccgctggaggacccgtgcggggtggtggcgctgatctccgacccgcaggtggaccggctgctgaacgaggcggtggcccaccggcggcccacgtaccgcgcccacgtggcctggtaccgcatcgcggacgggtgcgcgcacctgctgtactttatcgagtacgccgactgcgaccccaggcagatctttgggcgctgccggcgccgcaccacgccgatgtggtggaccccgtccgcggactacatgttccccacggaggacgagctggggctgctcatggtggccccggggcggttcaacgagggccagtaccggcgcctggtgttcgtcgacggcgtgaacatcctcaccgacttcatggtggcgctccccgaggggcaagagtgcccgttcgcccgcgtggaccagcaccgcacgtacaagttcggcgcgtgctggagcgacgacagcttcaagcggggcgtggacgtgatgcgattcctgacgccgttctaccagcagcccccgcaccgggaggtggtgaactactggtaccgcaagaacggccggacgctcccgcgggcctacgccgccgccacgccgtacgccatcgaccccgcgcggccctcggcgggcLcgccgaggcccaggcccaggcccaggcccaggcccagcccccggccgaagcccgagcccgceccggcgacgcccgcgccccccggccgcctgcccgagccggcgacgcgggaccacgccgccgggggccgccccacgccgcgacccccgaggcccgagacgccgcaccgccc 西南大学硕十学位论文第叫章试验结果cttcgccccgccggccgtcgtgcccagcgggtggccgcagcolgtggagccgttcccgccccggaccaccgccgcgccgggcgtctcgcgccaccgctcggtgatcgtcggcacgggcaccgcgatgggcgcgctcctggtgggcgtgtgcgtctacatcttcttccgcctgaggggggcgaaggggtatcgcctcctgggcggtcccgcggacgccgacgagctagaagcgcagcccggtccgctgcag脚I图9gD雉因扩增产物序列Fig．9PCRproductDNAscqucnceofgDgene脚aITCTAGAATGTCCAGCTCGAGAAAGACCCGGGTCGCCGACGAGACCGCCTCGGGGGCGCGCCGAGCCGGCAGCGCCTCTCGCGCCCGGGCCCCGGCCGTCCCGACCGCCGCGACCCCCAGACGCCCCTCGGCCTACGACGGCTTCTCCTACCGGTCTGCCCCGTCCTACGACGATGACTACGGCTACGATGGCCACGGCTCCCACGCCCCCCGCGCCAAGGTGACGCCCGCGGCCTCGCGGGCCTcGACCGGGGCCAAGAGCGCCTCGGCCGCC从GAcCCCCGIGGCCAAGACCGCCCGCTCGGCCTCGGCCCCGGCCACCGCCGCGGAACCGGCCCGGCGCGCCTcGAcGCGGGCCCcCGGGGAGAACcTCGACGTGGGCCGCCGGCTCGCCTTCAGCGACAGGCCGTGCGAGGCCAACGTGCCCTGGCGCGGCGCGACGCACGCCTTCAACAAGCGCATCTTCTGCGCGGCCGTGGGGCGCGTGGCCGAGGCCCACGCCCGCGCCGAGTCCCTCTGGGACA1EAACCCCCCGACGGACGCGCTCGACCGCTTCCTGCAGGCCGCGGTGCGCATCACCGTGTGCGAGGGGCTGGACCTGATCGAGGCGGCCAACGCCGTCCTGGACGAGAGCACCCCGGGGCGGAAGGGAAAAGTGTATAAATAAGAAT1℃EcoRI|芏|10VP22基因扩增产物序列Fig．10PCRproductDNAsequenceofVP229eneHindmaagcttaattccgcgCCCcaggttCCCataCRCtcacctgccagegccatgctgctcgcagcgctattggcgctggtcgcccggacgctcggcgcggacgtggacgccgtgcccgcgccgaccttCCCCccgCCCgcgtacccgtacaccgagtcgtggcagctgacgctgacggtcCCCtcgCCCttcgtcggcCCCgcggacgtctaccacacgcgcccgctggaggacccgtgcggggtggcgctgatctccgacccgcaggiggaccggctgctg&aCgaggcggtggccC8CcggCCCacgtaccgcgcccacgtggcctggtaccgcatcgcggacgggtgcgcgcacctgtactttatcgagtacgccgactgcgacCCCaggcagatctttgggcgctgccggcgcaccacgccgatgtggaceccgtccgcggactacatgttcCCCacggaggacgagctggggctgctcatggtggccccggggcggttcaacgagggccagtaccggcgcCtggtgttcgtcgacggcgtgaacatcctcaCCgacttcatggtggcgctcCCCgaggggcaagagtgcccgttcgcccgcgtggaccagcaccgcacgtac 两南人学碛’}：学位论文第四章试驶结果IIaagttcggcgcgtgctggagcgacg8cagctteaagcggggcgtggacgtgatgcgatteetgacgccgttct8CCagcCCCcgcaccgggaggtggtgaactggtaCCgcaagaacggeeggacgctcccgcgggcctacgccgccacgccgtacgceatcgacCccgcgcggccctcgggctcgccgaggcccaggc608ggcccaggcCcaggcccagcccccggccgaagcccgagcccgCCCcggcgacgcccgcgeCCCccggccgcctgcccgagccggcgacgcgggaccaegocgccgggggccgCeCcacgccgcggCCCCCgaggcccgagacgccgcaccgCCCcttcgcCCCgccggccgtgcccagcgggtggccgcagcctgtggagccgttccCgccccggaccaccgcgccgggcgtCtegcgee8ccgctcggtgatcgtcggeacgggcaccgcgatgggcgcgctcctggtgggcgtgtgcgtctacatctZcttccgcotgaggggggcgaaggggtatcgcctoctgggcggtcccgcggacgccgagctagaagegcagcccggtccgctgcaggtcgactctagaatgtccagctcgagaaagacccgggtcgccgacaccgcctcgggggcgcgccgCCCagccggcagcgcctctcgcgccogggcegocgcCCCggccgteccgaccgcgacececagacgCCCctcggcctacgacggcttctcetaccggtctgcCCCgtcctacgacgaegatgactacggctacgatggcCaCggctcccacgccccccgcgccaaggtgacgCCCgcggcctcgcgggcctcgaceggggccaagagcgcctcggccaagaCCCCCgcggccaagaccgcccgctcggcctcggcggcccoggccgeegccaCC8CCaccgccgaaccggcccggcgcgcctcgacgcgggccCCCggggacaacctcgacgtcggccgccttgccttcagegacaggccgtgcgaggccaacgtgCCCtggcgcggcgcgacgcacgccttcaacaagcgcatcttctgcgcggccgtggggcgcgtggccgaggcccacgcccgCgccgcCgccgagtccctctgggacatgaaeCCCccgacggacgcgc￡egaccgcttcctgcaggccgcggtgcgcarcaccgtgtgcgaggggctggacctgatcgaggcggccaacgccgtcctggacgagagcaceccggggeggaaggga88．agtgtataaataagaattc餐llgD·VP22融台綦瓣牟列Fig,llThesequenceofp,D-VP22fusiongene4．2潦核表达瘊粒的构建及表达4。2．1僳核表达质粒豹构建将构建的原接表达质粒pET-gD承IpET-gD-VP22分别采瑁核酸内甥酶ItindIII莽1EcoRl酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示；在pETogD山现硒个条带，一条位约1300bp左矗，舅一条夫予5000bp，如酗12：在愿接袭达臻粒pET-gD—VP22则可见有5000bp左鑫羲l2000bp友矗明 嚣藏大学鞭士学位论文籀媸章试验钻果亮条带，虫珏幽13。闰10pET-罄D的酶切鉴建闰Fi912IdentificationofpET-幽byrestrictionanalysisM：DNAmarkelrDL20001、2：pET-gD／XbaI+EcoR(t300bpl4．2．2SDS-PAGE照泳圈13pET-gO*VP22的■切鉴定Figt3IdentificationofpET．gD-VP22醣restrictionanalysisMl：DNAmarkerDLl5000M2：DNAmarkerDL2000t；pET-gO·VP22／Hindlll+EcoR(2000bp)将pET-gD、pET-gD—VP22分稍转能BL21(OE3)，IPTG诱零，SDS-PAGE翁莱显暴，pET-gD的细菌裘达产物在约47kD处出王见一条明显的特努性蛋白带，而pET-gD-VP22在约72kD处出现一条啊最的特辩性蟹向带，空载体pET28a(+)没祷此条带，如图14、15。围14pET-gD程大瞄杆菌中的寝达Fig．14ExpressionofpET-gDiaBL21fDE3)1：proteinmarker：11．4～116．0KO2：pET288(+)3：p料gD(47KD> 西南大学硕士学位论文第四章试验结果囤1．5pET-gD-VP22在大肠杆菌中的表达Fig．15ExpressionofpET-gD—VP22inBL21(DE3)1：proteinmarker：14．4～97．4KD2：pET-gD·VP22r72KI))3：pET28a(+)4．2．3Westernblot检测原核表达原核表达质粒pET—gD和空载质粒pET28a(+)转化BL21(I)E3)席，经IPTG诱导，3h的表达产物进行SDS．PAGE，转膜后，以PrY感染鼠阳性血清为一抗，HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗进行Westernblot，经TMB底物显色后，在约47kD处出现阳性条带，对照pET'28a(+)为阴性，如图16。图16免疫印迹法鉴定gD蛋白的表达Fig16WBanalysisoftheexpressionofgDM：Standardproteinmolecularweightmarkcr14．4～97．4kD1：pET．gD(47KD)2：pET28a 蘸海丈学颧圭擎位论克第耀章试验结果原辕表达质靛pET—gD—VP22和空载矮粒pET2Sa(+)转GBL21(I)E3)后，经IPIE诱导，3h的裘这产物进行westernb10t，以搦阎方、法处理届，经TMB底物凝色所，在约72kD处出现阡{性祭带，对照pET28a(+)为阴性，如图17。豳17免疫印迹法鉴定鐾D-VP22虽白的袭选F逗17WBanaly《softheoxpressionofgDtVP2M：Standardproteinmolecularweightmarker14．4～97，4kDl：pET-tO*VP22稽2KD)2：pET28a4．3真核表达质粒的构建对章句建的真核袭i；＆质粒p3XFLAG，gD鲻援酸内切酶HindIilRIEcoRI酶秘、电泳，结果照示在琼脂糖凝胶中出现有一条大于6000bp霸l一条约为1300bp赢右两个祭带，如翻18·强18p3XFLAG-gD纳酶切鉴定Figl8Identifieatlonofp3XFLAG-gDbyrestrictionanalysisM：DNAmarkerDLl50001、2，p3XFLAG-gD／Hiadlll÷EcoRI(t300bp)为对真核表达质率矗p3XFLAG．gD-VP22进行鉴定，辟j核酸内切酶积n掰ll举}EcoRl酶切， 西南大学硕士学位论文第四章试验结果琼脂糖凝胶电泳中也可见有两条带，其中一条约为2000bp左右，如图19。围19p3XFLAG—gD-VP22的酶切鉴定Figl9Identificationofp3XFLAG-gD-VP22byrestdctionanalysisM：DNArealkcrDL20001、2、3：p3XFLAG-gD-VP22／llindlll+EcoRl(2000bp)4．4gO基因DNA疫苗的免疫保护及VP22蛋白免疫增强作用的研究4．4．1攻毒保护性试验在二免后4周，用5x105匝I的PrVEa株进行攻击，100u1／只，在攻毒后的第3天，两组空闩载体免疫组及空白对照组小鼠就开始死亡，其余部分小鼠山现发病症状，表现为兴奋性增高，注射部位搔痒，被毛和皮肤破损。第5天为死亡高峰．pcDNA3．1组及空白对照组小鼠全部死亡，p3XFI．．AG组仅存的1只于第8天死亡。p3XFLAG-gD与p3XFLAG-gD—VP22疫曲免疫组均有较强的抵抗力，在攻毒后的第5天以后，pcDD和p3XFLAG-gD-VP22疫苗免疫纽在整个观察期(21天)一直未出现死亡，pcDD疫苗、p3XFLAG-gD疫苗与p3XFLAG-gD-VP22疫苗的保护率分别为87．5％、75％和87．5％，如表2、图20。表2攻毒后小鼠的存活情况Tablc2SorvivaloftheimmunizedmiceafterPrVchallenge、驴N羲囊篓蓑簇囊薹羹保护率p3XFLAG-gD87675％pCDNA3．1540D3XFLAG-gD-VP228787．5％兰皇型墨墨i!!——旦_一29 西南大学硕士学位论史第pq章试验结果创20攻毒后小鼠的存活情况Fi920survivaloftheimmunizedmiceafterPrVchallenge42间接ELIsA法检测免疫小鼠血清抗体效价设pcDD、p3XFLAG-gD，p3XFLAG—gD·VP22以及两个空白载体IpcDNA3．“、p3XFLAG．DNA)免疫组和空白对照组共六个组，免疫4-6周龄BALB／c小鼠，每组14只，loo掣g／只，于后腿肌肉注射，共免疫2次，每次间隔2周。以PRVEa株高致病力毒株作为抗原分别测定首免后2、4、6周血清的ELISA抗体水平，结果发现：首免后2周，peDD免疫组和p3XFLAG．gD免疫组均产生了可检测的ELISA抗体，但p3XFLAG-gD免疫组的ELISA抗体水平相对较低；加强免疫后2周，二者的抗体水平均有一定}g度的上升，但p3XFLAG-gD免疫组抗体水平仍然低于pcDD免疫组，直到首免斤6周(二二免后4周)，p3XFLAG—gD免疫组的抗体水平仍然低丁pcDD免疫组(P<0．05)。而FLAG．gD．VP22免疫组其抗体水平与pcDD免疫组差异不显著。如图21。图21pcDD、p3XFLAG-gD、p3XFLAG、pcDNA3．1和p3XFLAG·gD-VP22免疫小鼠诱导gD特异性ELISA抗体Fig．21gD—specificlgOresponsesofmiceimmunizedwithpcDD、p3XFLAG-GD、p3XFLAG、pcDNA3．1、p3XFLAG-GD·VP22andPBS 西南大学硕1：学位论义第四章试验结果4．43流式细胞技术T淋巴细胞亚群分析通过流式细胞仪检测104个细胞的CD4+}IICD8+淋巴细胞数量比。试验结果表明，所有含有gD基因的质粒免疫纽，小鼠的CD4+{qlCD8+淋巴细胞数量，与载体对照组和空白对J{cc组相比都有极其显著的增：!JII(P<0．叭)。表达融基因的质粒p3XFLAG．gD-VP22免疫组，CD4+、CD8+淋巴细胞数量E『分比显著高丁pcDD，p3XFLAG．gD免疫组(P<0．05j，pCDD和p3XFLAG．gD相比，CD4+淋巴细胞数量百分比差异不显著。如闰22、图23。圈22FCM分析小鼠淋巴细胞CD4+删／Fi922TheexpressionofCD4+onTLympgocyteofmiceimmunizedwithpcDD、p3XFLAG-gD、p3XFLAG、pcDNA3．1、p3XFLAG-gD·VP22andPBS图23FCM分析小鼠淋巴细胞CD8+的表选Fi923TheexpressionofCDS+onTLympgocyteofmiceimmunizedwithpcDD、p3XFLAG-GD、p3XFLAG、pcDNA3．1andp3XFLAG-GD．VP22andpBS31 第五章分析与讨论5．1Prv-gD基因核酸疫苗的构建51PrV-gD基因片段和VP22基因片段的扩增PrV糖蛋白gD基冈位于基因组Us区的BarnH1第7片段，大小约1．3kb，编码402个氨基酸．是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也是PrV最主要的免疫原性成分之一，抗gD蛋白的抗体是主要的中和抗体。纯化的gD蛋白或表达gD蛋白的重组病毒以及编码gD基因的核酸疫苗均可以刺激动物体产生保护性免疫应答反应。试验中以重组质粒pCDD为模扳，设计引物，对PrV的gD基因片段进行PCR扩增，其目的在于将核酸内切酶Hindlll和nfl的酶切位点分别引入gD基因片段的上、下游。将扩增产物与克隆载体pUCll9连接，进行酶切鉴定，l{土泳结果显示，有一条约1300bp条带，基本与gD基因片段的人小相同；同时，经对扩增产物序列测定结果表明，PCR扩增的gD基冈与GeneBank上所公布的该基因序列一致，扩增后的基因片段1266bp，在其上、下游可见HindII!和AfI的位点序列，说明扩增的PrVgD基因完整，且扩增过程中基因无突变发生。以pMD．VP22为模扳，设计引物，通过PCR扩增将XbaI和EcoRl酶切位点引入VP22基因的上、下游，对扩增产物酶切，电泳结果显示出现一条约750bp的条带。经序列测定证实扩增基因产物的碱基序列与GeneBank上所公布的该基因序列一致，扩增后的基因片段序列全长756bp．上、下游已经具有XbaI和EcoRI酶切位点，扩增过程中基因没有发生突变。采用Xba1利EcoRl酶切pUC．gD，与扩增所得VP22基因连接。分析pUCll9多克隆位点序列，发现在体fI平¨XbaI位点之间间隔6个碱基，通过计算可以得出gD．VP22融合基因片段长2028bp。gD．VP22测序结果表明，融合基因片段氏度与计算值结果一致，且gD基因起始密码子atg到VP22基因的终IE密码子taa，这一片段跃度为1974bp，符合3x倍，表明融合基因gD．VP22处于同一开放阅读框内，且片段上、下游具有mldlII和EcoRl酶切位点，可以用于构建表达融合基因的原核表达和真核表达质粒发生融合表达5．1．2原核表达质粒的构建和表达以pET28a(+)作为原核表达载体，分析其多克隆位点后，用HindIll和EcoRI酶切载体pET28a(+)和携带融合基囚的质粒pUC—gD-VP22，用于构建表达融合基因gD-VP22的原核表达质粒pET—gD—VP22，对该质粒酶切鉴定，琼脂糖电泳结果显示：在约2000bp处羽l约5000bp山现了条带，根据融合基因gb—VP22碱基序列，可以推断融合基因gD-VP22已经插入了原核表达载体的多克隆位点处。将pET—gD-VP22转化BL21(DE3)细胞后，IPTG诱导表达发现，pET-gD．VP22表达了约72KD的蛋白质用HindIli和＆D尺I酶切载体pET28a(+)利质粒pUC-gD，构建原核表达质粒pET—gD。产物酶切鉴定，电泳结果显示：在约1300bp左右出现了明亮条带，根据其测序结果，可以推断gD已经插入了表达载体的多克隆位点。转化BL21(DE3)细胞，IPTG诱导原核表达，pET—gD表达了约47KD的蛋白质。根据PrY—gD基因和VP22基阕片段的大小，推测计算gD蛋白和gD—VP22融合蛋白的分子量约为47KD和70KD左右，与试验结果基本～致。32 西南大学坝士学位论文第五章分析与讨论Westernblot检测结果表明，扩增的gD基冈和gD．VP22基冈表达的蛋白质具有较好的反应原性。5．13真核表达质粒的构建与鉴定为了构建携带融合基因gD，VP22的真核表丛质粒H|与疫苗免疫，州HindIll和＆DRI酶切质粒融合基因pUC—gD—VP22和真核表达载体p3XFLAG，产物经酶切鉴定，琼脂糖电泳后，山现约2000bp年¨约6400bp条带；采用相同方法构建真核表达质粒p3XFLA6-gD，电泳结果显示有两条带，一条约6400bp，另一条约1300bp比对融合基因gD—VP22和gD基因碱基长度发现电泳结果与两个基因碱基长度基本一致。5．2疫苗免疫动物后的效果评价5．2．1疫苗免疫后诱导的体液免疫效果核酸疫苗诱导体液免疫的应答的产生，主要是依赖丁：其编码的抗原基因在体内火量表达．I』I源性合成的蛋白多肽从转染细胞内连续被排出，或者在细胞死亡后释放出来，在胞外被抗原提呈细胞摄取并摄终激活浆细胞生合成、分泌抗体产生，而体液免疫应答反应合成的抗体主要是IgG，因此特异性IgG水平可以作为判断体液免疫水平的依据，试验中通过间接ELISA方法检测了特异性IgG水平，pCDD、p3XFLAG—gO}Hp3XFLAG—gD—VP22质粒免疫小鼠后，gD特异性IgG水平都有不同程度的提高，表明三种质粒在机体内均能有效的表达，首次免疫后特异性IgG抗体水平不高，可能是由于疫苗免疫剂量不足造成。本课题采用p3XFLAG作为载体携带PrY的2p基[A7羽IgD．VP22融合基因免疫小鼠，均诱导了较高的gD特异性IgG水平，与载体质粒对照组和空白对照组相比，差异极显著(P(0．01)。质粒p3XFLAG．gD诱导的体液免疫水平略低于PrVgD基因疫苗pCDD，差异不显著(P>0．05)。这可能是由于在动物机体内，不同DNA疫苗载体诱导机体表达出的目的抗原量有差异；同时目的抗原经历MHCI和MHC11递呈方式，机体免疫细胞对目的抗原多肽进行了加工处理．机体最终获得的抗原表位数量可能有差异造成的。p3XFLAG-gD。VP22免疫组与p3XFLAG-gD组．相比较，其诱导机体产生的gD特异性IgG水平差异不显著(P<0．05)。VP22基因的融合表达对PrVjD基因核酸疫苗的免疫增强作川．在诱导机体产生体液免疫方面不是很突出。5．2．2疫苗免疫后诱导的细胞免疫效果所有含有gD基因的质粒免疫小鼠后，小鼠的CD4+和CD8+淋巴细胞数量百分比较载体质粒对照组和空白对照组都有不同程度的增加。pcDD，p3XFLAG—gD、p3XFLAG-gO-VP22质粒免疫组与载体质粒p3XFLAG、pcONA3．i对照组相比，其激活鼠的CD4+和CD8+淋巴细胞数量百分比较载体质粒对照组的有显著提高(P<0．05)。p3XFLA—gD—VP22免疫组激活的CD8+T淋巴细胞百分含量显著高于p3XFLAG-gD免疫组相比(P<0．05)，其结果与SergioC．0(2001)报道的结果相符；VP22主要激活CD8+T淋巴细胞分化，通过携带蛋白转导周围细胞，使目的抗原gD作为一种细胞内抗原，主要诱导MHCIT淋巴细胞反应。并且Wills(2001)Zender(2002) 西南火学项上学位论文第五带分析’J讨论等运证实VP22缓自礁i锌肉嬲转导效袋汔在髂努蛲舞躲坌蒌照rp更强一些。茈辨，Roy(2002)等其他学者也报道表达VP22一p53融台滋白的重组腺痫毒能增强p53住体外或佛内诱导细胞捌亡和抗肿瘤效应。可以看出，VP22萤内对PrY曲艇冈的免瘦增强fi')lJ主要表现盎细胞王屯痰方面，对体液免蹬耱效果不麓缓突出。5．2．3攻毒后的保护情况率次试验中，用5xl旷p如的PrVEa株对Balb／cd,鼠进舒玻击，pcDD免疫组、p3XFLAG-gD免疫组和D3xFLAG．gD．VP22免疫组对小鼠的保护攀分别为87．5％、75％帮187．5％。墩毒试验结果说翻，本试验拣建戆矮较I)NA可在小蹑终内裹效表迭，诱导试验动物产生免疫应誉反应，获得较好的免疫僳护。与洪文洲123j采粥gD基因单瑟圆筏苗pcDD对Baf¨：，j、鼠的保护率为100％相比，本次试验所获得的对小鼠的保护率相对较低，但是磬异不显薷(p>0．05)，这可能是由I二不嗣麴试验掰选瑙麴试验动物斡个体差异，戏键奏条}|：等闲索爨恣成。 l珥南人学坝．I二学位论义第六章结论1、以重组质粒pcDD为模扳，设计引物，通过PCR扩增，在gD基因的上、F游引入HindlIl神IPstI协点；将扩增的gD基闪克隆到载体puCll9，构建质粒pUC．gD；通过酶切和序列测定结果表明扩增的gD基冈片段长1266bp，上、r游具有Hindlll和PstI位点，且其碱基序列与GeneBank中公布的PrV的bD基因(AF086702)标准序列一致，在PCR扩增过程中没有发生碱基突变。2、以重组质粒pMD．VP22为模板，根据GeneBank中公布的PⅣ的VP22基因(AYl90527)标准序列设计引物，PCR扩增，在VP22基因的上、下游引入XbaI和EcoRI位点，井将扩增的VP22基因与载体pUCll9连接，构建质粒pUC-VP22。扩增产物经酶切、电泳雨I序列鉴定表明基因片段长756bp，上、下游具有XbaI和EcoRI位点，且其碱基序列与标准序列一致．在PCR扩增过程中没有发生碱基突变。3、HjXbal和EcoRI酶切质粒pUC-VP22和pUC—gD，构建具有融合基因gO—VP22的重组质粒pUC·go-VP22，测序结果表明，融合基因gD-VP22片段长2028bp，上、_卜游具有Hind111和EcoRI位点。4、使用核酸内切酶Hindlll和EcoRl，酶切质粒puc·gD、pUC-gO-VP22及原核表达载体pET28a(+)：}ll真核表达载体p3XFLAG-CMV“-10，连接、构建原核表达质粒pET-gD、pET-gD-VP22以及真核表达质粒p3XFLAG-gD和p3XFLAG—gD·VP22。5、原核表达质粒pET-gD和pET-gD-VP22分别转化BL21(DE3)细胞，IIPTG诱导表达，pET-gD表达了约47kD的蛋白质，pET-gD-VP22表达了约72KD的蛋白质，根据PrV—gD基闲和VP22基因片段的火小，Westernblot检测结果表明，扩增的gD基因和gD．VP22基因表达的蛋白具有较好的反应原性。6、将免疫质粒p3XFLAG*gD和p3XFLAG-gD—VP22，以100,ug／R免疫BALB／c小鼠，间隔15天增强免疫一次，二免4周后采用5×1驴pfu的PrVEa株强毒攻击：p3XFLAG-gD-VP22免疫组和p3XFLAG．gD免疫组DNA疫苗对小鼠的保护率分别为87．5％和75％。7、将表达gD-VP22融合蛋白的质粒p3XFLAG·gD-VP22免疫小鼠后诱导的免疫反应情况，与非融合表达质粒p3XFLAG-gD进行比较，发现表达融合基因的质粒p3XFLAG-gD-VP22能够诱导全面的体液免疫和细胞免疫应答反应，与VP22融合表达能显著增强特异性ELISA抗体水平．并且通过对小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞百分含量分析发现，p3XFLAG．gD．VP22和p3XFLAG．gD免疫组CD4+和CD8+T淋巴细胞百分含量均极显著高于载体组和空白对照组，且p3XFLAG．gD．VP22免疫组小鼠外周血中CD4+T细胞的数量显著高于p3XFLAG．gD免疫组和pCDD免疫纽(P<0．05)。 西南大学硕士学位论文参考文献【1】股簇，刘景华．动物病毒学(第二版)【M】．北柬：科学出版利‘，1997．{2j哭雅玲．猪伪狂犬瘸fJ】，青海畜牧蛰篷杂芯，2001，31(2)：34～35．f31俺稿盖，陈焕舂．猪伪藏犬癌新鹣溅行病学褥往鼙l，华中农娃太学学鞭，2000，堙髑：22～23．【4】零学伍，阎玉河，张改平≮．河南销猪伪犯犬瘸的流行动淼及防制研究fJ】．河南农业科学，2∞【0，2：34～36，【5】苏双，咸京淑，李萌等．猪伪狂犬病的诊断【J1．吉林畜牧兽医，2002，5：24～25．【61顾小根，俞因养，陆圜林．浙江省莽猪场母猪缭殖障硝癍主要病因调碴【J】．中翻预防兽版学掇，2002，1(24)：62～63．(7】娩卫东，E写荣桶，予国明．猪伪狂犬病的分予生物学进聪【J】．巢菇汽瞽牧兽医，2002，4：44～45．【8】KargerA，SaalmullerA·TufaroF，eta1．Cellsurfaceproteoglycansamnotessentialforinfectionbypseudorabiesvirus[J]。J．Virol，1995，69(9)：3482～3489．【9】簧强。陈溥育．伪狂犬瘸辅毒的囊膜耱蛋AgE的研究进展【J】．中国兽医⋯：Zq—f：，2002，12(38)：31～33．【l国范稼兴，魏鬟，张霞蕊等．PRVlA椿gp蒸因戆痔捌瓣定及萁委鬟裹变医ll奄发凌翻。中国兽医学报，2003．23(4)：350～352．【11】ErikAPetrovskis，JamesGTimmins·ManyAArmentrout，eta1．DNAsequenceofthegeneforpseudorabiesvirusgP50，aglycoproteinwithoutN-linkedglycoslation[J]．J．Vlrol·1986，59(8)：2i6～223．【12】NixdorfRtKluppBG，MeltenleilerTC．RoleofIhecytoplasmictailsofpseudorabiesrimsglycoproteinsB、E、andMinintracellularlocationandvirionincorprotein[J]．j，Gen．Virol-2001，8(2)：215～226．【13】许雁峰．郫万桎，“谦．Rl爱豳，杨爱明．猪伪狂犬瘸薄gD基因的研究进展【J1．四川蔚牧兽臌，2005，7：22．【141DasikaGK，LetchworthGJ+Homologousandheterologousinterferencerequiresbovineherpesvirus-1glycoproleinDatthecellsurfaceduringvirusentry[J]．J．Gen．Viralt2000-1(5)：1041～1049．【151GeraghtyRJ，JoggerCR，SpearPG．CellularexpressionofalphaherpesvirusgDinterfereswithentryofhomologousandheterologousalphahcrpesvimsbyblockingaccesstoasharedgDreceptor[J]．Virology·2000t26(8)：】47～158-【t6lConnollySA，Whitbeck玎，RuxAH，etal．GlycoproteinDhomologsinherpessimplexvirustype1，pseudorabiesvirusandbovineherpesvirustype1binddirectlytohumanHveC(nectin·1)withdifferentaffinities[J]．Virology，2001．28(4)：7～18．【17】KargerA。SchmidtJ，MettenleiterTC．InfectivityofapseudorabiesvirusmutantlackingattachmentglycoproteinsCandD【J】。1．锈fol，1998t72(9>：7341～7348．[18】甜涛，糍保安，杨孵凡等伪狂犬病病毒gD、gE基因的克隆及转移载体的构她fJj．中国预|{：磬兽医学报，2004，26(2)：149～151．119lThomasCMettenleiter．Aujeszky’Sdisease(pseudorabies)virus：thevirusandmolecularpathogenesis-stateoftheart[J]．VetRes·2000,31(12)：99～115．【20】杨承槐，豢高明，谌南辉．伪狂犬旃甄单位疫苗研究进腿【J】．江西黼牧兽医杂志，2004．3：5。 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