伪狂犬病病毒gD基因核酸疫苗及VP22免疫增强效应的研究

《伪狂犬病病毒gD基因核酸疫苗及VP22免疫增强效应的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、西南大学硕士学位论文摘要伪狂犬病(Pseudorabies)是当今危害养猪业的最重要传染病之一，虽然～些国家实施了根除计划，但在绝大多数国家尤其是发展中国家，该病仍然频繁发生，造成的经济损失巨大，严重制约着这些国家和地区养殖业的发展。免疫接种仍是目前控制和预防该病的主要手段。传统的猪伪狂犬病疫苗对控制疾病的发生和流行发挥了巨大作用，但无论是灭活疫苗还是弱毒疫苗均不同程度的存在免疫效果不佳或毒力返强等缺陷。研制更安全、高效、廉价的新型疫苗一直是伪狂犬病研究的重要方向。本研究在克隆、表达猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies

2、Virus，PrV)鄂A株的主要免疫原性基因2D的基础上，构建了这一基因的真核表达质粒并作为核酸疫苗，通过肌肉注射的方式免疫试验动物，检测了动物产生的免疫应答水平以及对病毒攻击的保护能力，结果证实这些核酸疫苗可以有效激活试验动物产生全面的免疫应答反应。同时还研究证明伪狂犬病毒VP22对猪伪狂犬病核酸疫苗具有免疫增效作用。主要研究内容如下：1．PrVEa株gD基因、VP22基因的克隆分别以重组质粒pcDD和pMD．VP22为模板，设计引物，通过PCR扩增，在gD基因的上、下游引入HindllI和风fI位点，在VP22基因的上

3、、下游引入Xbal和l}cnRl位点，将扩增的gD基因和VP22基因基因片段克隆到载体pUCll9，构建质粒pUC-gD、puc-w22和pUC-gD-VP221并将pUGgD、pUC-VP22送上海博亚生物工程公司测序。酶切电泳鉴定，gD基因片段长度约为1200bp，VP22基因片段长约760bp，gO—VP22基因片段长约2000bp：测序结果表明，扩增的gD基因片段为1266bp，VP22基因片段756bp，go-wz2基因片段为2028bp。经对比发现扩增的gD基因、V'P22基因与GeneBank中公布的Prv的

4、gD基因(AF086702)和VP22基因(AYl90527)标准序列一致，在PCR扩增过程中没有发生碱基突变。2．表达质粒的构建使用核酸内切酶HindllI和EcoRI，酶切携带目基因片段的pUC-gD、pUC-go-VP22及原核表达载体pET28a(+)和真核表达载体p3XFIAO．CMVTM．10，连接、构建原核表达质粒pET-gD、pET-gD-VP22以及真核表达质粒p3XFLAG-gD、p3XFLAG-gD—VP22。原核表达质粒、真核表达质粒分别酶切电泳后，分别在1300bp处和2000bp附近均出现了明亮

5、的条带．结合序列鉴定结果，可以表明目的基因已经插入到表达载体的多克隆位点处。3．gD基因在大肠杆菌中的高效表达原核表达质粒pET-go和pEr-go—VP22分别转化BL21∞E3)细胞，IPTG诱导，SDS—PAGE结果显示：pET-gD能够在大肠杆菌中表达出约47kD的蛋白，pET-gD-VP22能够在大肠杆菌中表达出约72kD的融合蛋白，Westernblot结果表明以上两种原核表达蛋白具有良好的反应原性。4．Pry．gD基因DNA疫苗的免疫保护．及VP22蛋白免疫增强作用将以p3XFLAG为载体，构建的妒基因真核表

6、达质粒p3XFLAG·gD和03XFLAG-gD．VP22，以loogg／p,免疫BALB／c小鼠，间隔15天增强免疫一次。二免4周后采用5x105pfu的PrVEa株强毒攻击，p3XFLAG-gD-VP22免疫组和p3XFLAG，gD免疫组DNA疫苗对小鼠的保护率分别为825％和75％。两南大学硕士学位论史摘要将表返gD．VP22融合蛋白的质粒p3XFLAG-gD．VP22免疫小鼠，与非融合表达质粒p3XFLAG．gD进行比较，间接ELISA检测发现与VP22融合表达能显著增强特异性IgG水平。通过对小鼠外周tin中CD

7、4+,}HCDS+T淋巴细胞百分含量分析发现，p3XFLAG．gD-VP22和p3XH,AG。gD免疫纽CD4+_手rlCDS+T淋巴细胞百分含量均极显著高于空载体组和空白对照组，且p3XFLAG．gD．VP22免疫组小鼠外周血中CD4+T细胞的数量显著高于p3XFLAG-gO免疫组(P<0．05)，可见融合基冈p3XFLAG-gD—VP22质粒能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答。关键谰：伪狂犬病毒gD基因克隆表达DNA疫苗VP22蛋白转导免疫增强II西南大学硕士学位论文AbstmtAbstractPseudorabie

8、s，alsodesignatedasAujeszky’Sdisease(AD)，isaseriousillnessofswineandcausessignificantfinanciallossesinthepigindustry．TocontrolADandloreduceeconomiclosses