伪狂犬病毒受体基因nectin1转基因的研究论文

《伪狂犬病毒受体基因nectin1转基因的研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、伪狂犬病毒受体基因Ncetin．I的转基因研究摘要伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)可引起野生动物和多种家畜的伪狂犬病，尤其是猪伪狂犬病，给中国乃至世界养猪业都造成了巨大的经济损失。与其它a．疱疹病毒亚科的成员一样，伪狂犬病具有神经嗜性和潜伏感染等特征，是一种具有重要研究意义的动物病毒性传染病。目前，预防和控制该病的主要措施仍然是免疫接种疫苗。虽然它可以减少潜伏感染的建立，但是却不能完全阻止病毒的感染和散毒，也不能阻止建立潜伏感染。若要是能够从动物自身的角度出发，培育出具有抗伪狂犬病的转基因动物，无疑对养殖业

2、来说，是划时代的进步。PRV基因组编码膜蛋白与其它疱疹病毒相似，gD基因的质粒作为免疫原可以诱导细胞毒性淋巴细胞反应，是伪狂犬病毒入侵靶细胞所必需的一种糖蛋白。Nectin-1基因是a疱疹病毒的受体，介导伪狂犬病毒进入猪的上皮细胞和神经细胞。Nectin-1的N端有一个类似免疫球蛋白的结构域，该结构域与伪狂犬病毒糖蛋白基因gD相结合，进而导致病毒囊膜与细胞膜融合，核衣壳进入细胞，造成机体感染发病。所构建的转基因动物模型，正是利用nectin-1的这一特点，首先使转基因动物表达nectin．1基因胞外区的可溶性片段，在伪狂犬病毒感染

3、细胞前先与gD基因竞争性结合，阻断gD基因与细胞上的nectin．1基因受体相结合，从而达到阻止伪狂犬病毒感染细胞的目的，增强转基因动物抗伪狂犬病的能力。鉴于以上研究背景，本试验分别通过转染和转导的方法获得表达nectin-1基因胞外区可溶性片段的PK．15细胞系，为构建具有抗伪狂犬病的转基因猪模型奠定基础。主要工作包括：1．PRV受体nectin．1基因的克隆与分子特征分析本试验根据GenBank上已登录的猪nectin-1基因序列(登录号AF308632)，设计1对引物Pl、P2，本试验首先运用RT-PCR的方法从猪肝脏组织中

4、克隆到了猪nectin-1基因，并采用生物信息学软件对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪nectin．1基因与犬、人、恒河猴、黑猩猩、家鼠、牛、马的nectin-1基因核苷酸序列同源性分别为92％、92％、91％、91％、89％、93％和93％；推导氨基酸序列的同源性分别为100％、95％、67％、100％、100％、100％和100％。在执行功能的胞外区具有很高的保守性，序列分析中的3个N．糖基化位点和7个半胱氨酸残基都位于胞外区，且在不同物种间也都具有很高的保守性，这从一定程度上解释了PRV可感染猪、羊、牛、猫、

5、犬等35种脊椎动物，具有宿主范围广的原因。也为后期利用nectin-1胞外区来生产抗伪狂犬病毒的转基因动物提供了理论依据。2．猪necfin．1胞外区基因的克隆与原核表达本试验同样运用Prime5软件设计l对引物P3、P4，以从猪肝脏组织中提取总华中农业大学专业学位硕士学位论文RNA为模板，RT-PCR扩增猪nectin．1胞外区完整编码区序列，并将其克隆至pGEX．6p一1原核表达载体，成功构建pGEX-6p-1．nectin．1-ecto质粒，在IPTG370C条件下诱导表达3h后，在大肠杆菌BL21表达体系中，表达猪的nec

6、tin-1胞外区基因的蛋白。SDS．PAGE电泳检测可以得到一条大小约62kDa的与GST标签相融合的表达条带，并且主要以不溶性的包涵体形式存在。再以抗6个组氨酸的单抗为一抗，通过Westernblot检测证实了表达蛋白的特异性后，以表达产物为抗原免疫3只新西兰白兔，制备nectin．1一ecto的多克隆抗体。40天后动脉放血采集少量血清，通过ELISA试验测定其效价为1：640。3．表达猪nectin．1胞外区基因的PK-15细胞系的构建构建了表达猪nectin．1胞外区基因的真核表达质粒pCA．nectin．1．ecto，运用

7、脂质体法转染PK．15细胞，并在3周内用G418来筛选稳定表达猪nectin．1胞外区的PK．15细胞系。并采用流式细胞仪、间接免疫荧光和Westernblot从蛋白质水平上证实猪nectin-1胞外区基因在所构建的细胞系中获得表达。在PK．15细胞系抑制PRV病毒增殖试验中，跟正常PK一15细胞相比较，所筛选的PK．15细胞系具有明显的抑制PRV病毒增殖的能力。4．慢病毒转导的PK-15细胞系的构建在众多逆转录病毒载体中，本试验运用HIV慢病毒载体作为构建转基因动物的载体。同时利用293ft细胞做为制备慢病毒粒子的包装细胞。本试

8、验在转染293ft包装细胞时，同时转染除携带有外源目的基因pLenti．7．3CA质粒之外的另外三个辅助质粒pLPl、pLP2和pLP／VSVG，使其表达四个HIV慢病毒的结构基因。通过在包装细胞中装配后分泌到细胞上清中，收集细胞上清、超离获得HI