伪狂犬病毒pcr诊断

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1、实验九伪狂犬病毒PCR诊断实验目的：1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；2、掌握伪狂犬病毒PCR检测的方法；实验内容：1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤，让同学们观看PCR反应的动画；2、伪狂犬病毒PCR检测。什么是PCR？聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。一、PCR反应的原理、方法及操作步骤PCR及有关技术的发展历史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。1985关于PCR的文章首

2、次由Cetus公司Saiki等人在Science上发表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)PCR及有关技术的发展历史（2）1987当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus仪器公司（PECI）于这一年的11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪。1989Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第

3、一个“年度分子”。PCR及有关技术的发展历史（3）1992年3月Cetus公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利；KaryMullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR及有关技术的发展历史（4）九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测1999年西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查PCR原理PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA

4、变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。PCR原理PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增。（1）DNA模板的热变性将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为

5、模板。（2）模板与引物的结合（退火或复性）将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。（3）引物延伸将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸，形成两条与模板互补的新链。以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环，PCR产物呈指数扩增。模板DNA扩增倍数T=2n(n:循环次数)。PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimere

6、xtensionPCRproduct标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul2.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；RNA作为模板时，需要：RNA-------cDNA-------PCR,称此为RT-PCR.（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃

7、稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。逆转录酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则（一）①引物长度：15-30bp，常用

8、为20bp左右引物的有效长度不能大于38bpmer，否则最适延伸温度会超过Taq