猪伪狂犬病毒ge抗体检测红细胞凝集试验方法和金标免疫层析法的建立与应用

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1、immunochromatographicstripissimpleandtheresultc锄bejudgedwitIlnakedeyesin15minutes；storageofthestripsatroomtemperatureforsixmonthshasnotchangedtheirsensitivityandspecificity．ComparedwiththeresultsfromtheAmericanIDEXXandtheFrenchLSIgE-ELISAantibodydetectioncases，theto

2、talcoincidencerateofthenegativeandpositivereactionreached90．60％．The—seresultssuggestthattheestablishedColloidalGoldImmunochromatographyAssayCanbeusedtodetecttheporcineserumantibodiestogEproteinofPRVwiththeadvantagesofsimpleoperation，hi曲sensibilityandstrongspecificit

3、y．KEYWORDS：PseudorabiesVirus；Anti—HumanRedBloodCellScFv；Er—ythrocyteAgglutinationAssay；ColloidalGoldImmunochromatographicAssay；V常用缩写词VⅡ—1厶—jL．刖『舌伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的一种急性传染病，在自然条件下可感染猪、野猪、犬、猫、兔、鼠、貂等多种家畜和野生动物【11。以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为特征的一种高度急性、接触性传染病[21。国际兽疫局(ore)将伪狂犬病列为法定报告的B类多

4、种动物共患传染病，我国也将其列为二类传染病。伪狂犬病属于自然疫源性疫病，猪是该病的传播者和天然宿主，其主要临床症状是引起怀孕母猪繁殖障碍：流产、产死胎、木乃伊胎；新生仔猪体温升高、呼吸困难[31。任何年龄猪耐过PRV急性感染后，均引起潜伏感染，且终生带毒，在一定条件下向J,I-扫IE毒，成为传染源，对养猪业造成巨大的损失，是各个猪场首要净化的疫病之一。目前，针对国内广泛使用PRVgE基因缺失苗进行预防免疫的现状，通过检测gE抗体即可区分出是疫苗免疫抗体还是野毒感染产生抗体M】，从而筛查野毒感染猪。伪狂犬病毒病原学检测方法主要有

5、病毒分离和PCR法，这两种方法需要的实验条件高，只适合实验室的检测；伪狂犬病血清学检测方法主要有微量血清中和试验、乳胶凝集试验、琼脂免疫扩散试验、血凝试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验【8】等，前面五种都无法区分疫苗免疫和野毒感染，ELISA方法虽可区分，但是试剂盒价格昂贵，且需要专门的操作人员和仪器，难以在基层生产单位推广。因此，建立简便、快速、特异、敏感且适合基层单位使用的检测方法对开展伪狂犬病净化意义重大。1988年，Kemp【9】等首先报道了建立检测HIV抗体的自体红细胞凝集试验快速检测方法。只需采待检人一滴血，5m

6、in内即可观察结果，操作程序简单，结果可以目测，不需要特殊昂贵的仪器和专门的技术人员。其基本原理是：以红细胞作为指示剂【lo】，利用重组双功能融合蛋白既能与红细胞结合又能与被检抗体／抗原结合，通过被检样品中抗体／抗原的桥联作用，使红细胞发生肉眼可见的凝集，根据红细胞的凝集情况可快速进行结果判定。免疫胶体金技术(ImmuneColloidalgoldtechnique，ict])是20世纪80年代发展起来的一种新型固相载体标记免疫检测技术。它以胶体金作为标记物，利用特异性抗原抗体的反应，通过胶体金颗粒的颜色来放大免疫反应系统，使

7、反应结果直接在固相载体上显示出来，用于检测待测样品中的抗原或抗体【l¨。其基本原理是：将胶体金标记到特异的抗原或抗体并吸附于玻璃纤维膜上，然后固定于硝酸纤维素膜的某一特定位置(一般为顶端)作为胶体金结合垫，将另一特异的抗原或抗体以条带状固定于硝酸纤维素膜上的某特定区域(检测带)，在硝酸纤维素膜上的另一端固定吸水垫；当干燥的硝酸纤维素膜一端浸到样品后，由于毛细作用，样品沿着膜向吸水垫端移动，当移动至胶体金结合垫(金标垫)时，如样品中含有待检物，则发生特异性免疫反应形成免疫复合物，继续前移至检测带时，待测物和免疫复合物与之发生特异

8、性结合而被截留在条带区域上，通过胶体金标记物的富集而得到直观的显色结果[121o根据红细胞凝集的原理，本实验开展了用于快速检测猪伪狂犬病抗体双功能试剂相关研究工作，利用SOEPCR方法成功构建了用于快速检测猪伪狂犬病gE抗体的双功能融合基因并在大肠杆菌中得到了高效表达，通过对