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分类号：Ｓ８５５．３单位代码：１０１８３研究生学号：２０１６８５４０２１密级：公开吉林大学硕士学位论文专业学位（）猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ＥＬＩＳＡ方法的建立ＤｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆａｎＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｉｎｆｅｃｔｅｄｆｒｏｍｐｇｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｎｉｍａｌｓｏｆＰＲＶ作者姓名：王杨专业：兽医硕士领研究方向兽医技术服务指导教师：丛彦龙教授合作导师：赵荣茂博士培养单位：动物医学学院２０１８年６月 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年Ｚ月Ｇ日 猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立DevelopmentofanELISAmethoddifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRV作者姓名：王杨专业名称：兽医硕士指导教师：丛彦龙教授合作指导教师：赵荣茂博士学位类别：硕士论文答辩日期：2018年6月5日 中文摘要猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立猪伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）主要经消化道、呼吸道、空气及胎盘等进行传播。病毒感染后，猪可能终生带毒并持久排毒，目前尚无有效治疗药物，给养猪业带来巨大的经济损失。2011年底，我国山东、河南、河北等多个免疫了某PRV疫苗的猪场暴发了疑似PR的疫病，发病猪出现高温（40～42℃）、咳嗽、腹泻并伴随有系统性神经症状，新生仔猪死亡率高。病毒分离结果表明，引起此次发病的病原体是变异的PRV，这对伪狂犬病（Pseudorabies，PR）的防控提出了新的挑战。PRV基因组可编码多种蛋白质，其中gE蛋白是PRV主要的毒力因子，在病毒跨神经元传播过程中发挥重要作用。以gE蛋白为靶点鉴别野毒感染与疫苗免疫的优势在于gE基因具有高度的保守性，表达于所有野毒株，并且gE糖蛋白抗体产生迅速且持续时间长，因此被用来作为PRV野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的首选靶标。目前大部分商品化的PRV弱毒疫苗和灭活疫苗均缺失gE基因，由于野毒感染猪的存在，单纯使用疫苗并不能根除PRV。因此，在PRV净化过程中，结合野毒感染猪与疫苗免疫猪的鉴别诊断方法，坚决淘汰PRV野毒感染猪是根除PR的根本措施。目前，我国主要依赖国外昂贵的试剂盒来鉴别诊断PRV野毒与疫苗毒。虽然国内一些公司也有PRV检测的同类试剂盒，但效果较国外进口有一定差距。因此，有必要研发能准确鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫的国产试剂盒。为建立PRV抗体检测间接ELISA方法，本研究通过PCR扩增出PRVgE基因优势抗原表位区片段gE37～243，将其与pET-32a(+)载体进行连接构建重组质粒。经过蛋白表达条件优化，获得可溶性表达的gE37～243蛋白。利用Ni-NTA亲和层析纯化的gE37～243蛋白免疫小鼠，经过辛酸硫酸铵纯化获得了2株PRV的单克隆抗体，以I 期为PRV单抗阻断ELISA方法的建立奠定基础。利用纯化的gE37～243蛋白作为包被抗原建立了PRV抗体检测的间接ELISA方法，并对抗原包被条件、血清稀释液、封闭液、一抗，二抗工作浓度、作用时间等进行优化，通过与商品化试剂盒进行对比检测，本研究所建立的ELISA方法的敏感性为93.33%，特异性为93.75%，批内以及批间变异系数均小于10%，与商品化试剂盒符合率为92.00%。因此，与商品化试剂盒相比，本实验建立的PRV抗体检测间接ELISA方法同样具有良好的敏感性、特异性及检出率，为国内鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫提供了技术支持。关键词：猪伪狂犬病毒，gE基因，单克隆抗体，间接ELISA，鉴别诊断II AbstractDevelopmentofanELISAmethoddifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRVPorcinepseudorabiesvirus(PRV)mainlytransmittedacrossthedigestivetract,therespiratorytract,theairandtheplacenta.Afterinfection,pigsmaycarryPRVforalifetimeandcontinuouslydrainthemtooutside.Atpresent,thereisnoeffectivetreatmentforthiskindofdisease,whichbringshugeeconomiclossestotheswineindustry.Attheendof2011,thereweresuspectedPRoutbreaksinpigfarmsinShandong,HenanandHebeiprovincesthatwereimmunizedwithcertainPRVvaccines.Thepigsdevelopedhightemperatures(40~42°C),cough,diarrheaandsystemicneurologicalsymptoms.Thenewbornpigletmortalityishigh.TheresultofvirusisolationshowedthatthepathogencausingthisdiseaseisavariantPRV,whichraisednewchallengesforthepreventionandcontrolofpseudorabies(PR).ThePRVgenomecanencodeavarietyofproteins,gEproteinisthemainvirulencefactor,whichplaysavitalroleinthetransmissionofthevirusacrosstheneuron.TheadvantageofchoosingthegEproteinasatargetdifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRVisthatthegEgeneishighlyconserved，expressedinallfieldstrains.AndtheantibodiesofgEglycoproteincanberapidlyproducedandlastedforalongtime.SogEproteiniscommonlyusedasthefirsttargetfordifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRV.Currently,gEgeneisdepletedinmostcommercializedPRVattenuatedandinactivatedvaccines.Becauseofthepresenceoffieldstraininfectedpigs,thegEgenedepletedvaccinesalonecannoteradicatePRVproperly.Therefore,combiningwiththedifferentialdiagnosisofinfectedfromvaccinatedpigs,eliminatingPRVfieldstraininfectedpigsisthefundamentalmeasureintheprocessofPRVpurification.III Atpresent,ChinareliesmainlyonforeignexpensivekitstodifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRV.AlthoughsomedomesticcompaniesalsohavesimilarkitsforPRVdetection,thereisacertaingapfortheeffectscomparedtoforeignimports.Therefore,itisnecessarytodevelopadomestickitfortheaccurateidentificationofdifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRV.InordertoestablishanindirectELISAmethodforPRVantibodydetection,thisstudyamplifiedthePRVgEgenedominantepitopefragmentgE37~243byPCRandconnecteditwithpET-32a(+)vectortoconstructrecombinantplasmid.Aftertheoptimizationofproteinexpressioncondition,thesolubleexpressedgE37~243proteinwasobtained.ThemicewereimmunizedwithgE37~243proteinbyNi-NTAaffinitychromatographypurified,twokindsofmonoclonalantibodiesofPRVwereobtainedafterpurificationwithammoniumoctanoate,soastolayafoundationforthedevelopmentofPRVmonoclonalantibodyblockingELISA.AnindirectELISAmethodfordetectionantibodiesofPRVwasestablishedusingthepurifiedgE37~243proteinasacoatingantigen,andoptimizingtheconditionofantigencoatingprocess,serumdiluting,sealingliquid,theworkconcentrationofantibodies,reactiontime,theELISAmethodestablishedinthisstudyhasasensitivityof93.33%andaspecificityof93.75%,theintra-assayandinter-assaycoefficientsofvariationarelessthan10%,thecoincidenceratewiththecommercialkitsis92.00%.Therefore,comparedwithcommercialkits,thePRVantibodydetectionindirectELISAmethodestablishedinthisstudyalsohasagreatsensitivity,specificityanddetectionrate,whichcanprovideatechnicalsupportfordomesticdifferentiationinfectedfromvaccinatedanimalsofPRV.Keywords:PRV,gEgene,mAb,indirectELISA,differentialdiagnosisIV 目录引言.........................................................................................................1第一篇猪伪狂犬病的研究进展............................................................21猪伪狂犬病病原学研究进展...........................................................21.1猪伪狂犬病毒结构.....................................................................21.2猪伪狂犬病毒的基因组特征....................................................31.3猪伪狂犬病毒的毒力基因........................................................31.4猪伪狂犬病毒的主要蛋白........................................................52猪伪狂犬病流行病学研究进展.......................................................72.1猪伪狂犬病流行形式.................................................................72.2猪伪狂犬病毒株变化.................................................................83猪伪狂犬病诊断研究进展...............................................................93.1基于gE基因的分子生物学诊断方法......................................93.2基于gE蛋白的血清学方法....................................................11第二篇研究内容..................................................................................13第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备........................131材料..............................................................................................131.1病毒、细胞、二抗及载体...................................................131.2主要试剂购置.......................................................................131.3主要试剂配制.......................................................................141.4主要仪器...............................................................................152方法..............................................................................................152.1引物设计...............................................................................152.2目的基因扩增.......................................................................162.3目的片段回收.......................................................................162.4目的片段和载体的双酶切...................................................16V 2.5目的片段与载体连接转化...................................................172.6重组表达质粒的鉴定...........................................................182.7重组表达菌株的培养及表达...............................................182.8原核表达条件优化...............................................................192.9蛋白Ni柱纯化.....................................................................192.10表达产物的免疫印迹.........................................................192.11ELISA筛选系统的建立.....................................................202.12单克隆抗体的制备.............................................................203结果..............................................................................................223.1目的基因扩增结果...............................................................223.2pETgE37～243菌液PCR鉴定...............................................223.3pETgE37～243表达.................................................................233.4诱导时间优化.......................................................................233.5诱导温度和转速的优化.......................................................233.6gE37～243蛋白纯化及Westernblot分析...............................233.7融合前SP2/0的生长状态...................................................263.8单克隆孔中杂交瘤细胞的生长状态...................................263.9单抗筛选结果.......................................................................274讨论..............................................................................................275小结..............................................................................................29第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立...........................301材料..............................................................................................301.1阴阳性血清及二抗...............................................................301.2主要试剂购置.......................................................................301.3主要试剂配制.......................................................................301.4主要仪器...............................................................................312方法..............................................................................................312.1兔抗猪IgG与HRP偶联.....................................................31VI 2.2iELISA检测方法..................................................................322.3iELISA检测方法条件优化..................................................322.4iELISA检测方法的性能评价..............................................343结果..............................................................................................353.1iELISA检测方法条件优化..................................................353.2iELISA检测方法性能评价..................................................404讨论..............................................................................................415小结..............................................................................................43结论.......................................................................................................44参考文献...................................................................................................45作者简介及在学期间所取得的科研成果..............................................51导师简介...................................................................................................52致谢.......................................................................................................53VII 中英文缩写表英文缩写英文全称中文全称BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CSFVclassicalswinefevervirus猪瘟病毒E.coliEscherichiacoli大肠埃希氏杆菌EDTAthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HSVherpessimplexvirus单纯疱疹病毒iELISAindirectenzyme-linkedimmunosorbent间接酶联免疫吸附试验assaymAbmonoclonalantibody单克隆抗体PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠SPFspecificpathogenfree无特定病原体SuHV-1suidherpesvirus1猪疱疹病毒I型PCV2porcinecircovirustype2猪圆环病毒2型PEDVporcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒PRpseudorabies伪狂犬病PRRSVporcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征病毒syndromevirusPRVpseudorabiesvirus伪狂犬病毒PPVporcineparvovirus猪细小病毒VIII 引言引言PR是危害全球养猪业的重大传染病之一。我国政府在2011年制定的《国家中长期动物疫病防治规划（2012~2020年）》中提出：截止到2020年，全国所有种猪场PR达到净化标准的目标。从全国范围来看，gE基因缺失疫苗与gE抗体检测方法的联合应用是目前净化PR的唯一办法。但病原体的净化非常困难，而且野猪群中携带的PRV对PR的防控构成极大的威胁。我国自20世纪80年代引入基因缺失疫苗以来，PR的防控取得了良好的进展，保持稳中有降的趋势，很多猪场已达到免疫无感染的状态。到2011年底，由于PRV变异，导致PR的再次暴发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。同时，由于野毒株的存在，给野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断带来困难。哈兽维科市场技术服务部于2014～2017年期间对全国28个省市443个规模猪场的1,636份病料（淋巴结和脑组织）和30个省市874个规模猪场的33,517份血清样品进行检测和数据分析，发现目前我国野毒感染依然严重。PRV野毒中均带有gE基因，而市场上用于PR防控的商品化疫苗多为gE基因缺失的弱毒疫苗，这给野毒和疫苗毒的鉴别诊断提供了依据。基于此，本研究利用大肠杆菌表达系统表达了PRV的gE蛋白，将其作为抗原建立PRV抗体检测的间接ELISA方法，为鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫提供技术支撑。同时，制备了针对gE蛋白上具有抗原优势表位的单克隆抗体，以期为PRV单抗阻断ELISA方法的建立奠定良好的基础。1 第一篇猪伪狂犬病的研究进展第一篇猪伪狂犬病的研究进展猪伪狂犬病（PR）是危害养猪业的重要动物疫病，该病目前尚无有效治疗药物，给养猪业造成巨大的经济损失。当前市场上应用的大部分PRV疫苗均为gE基因缺失苗。但由于PRV具有潜伏感染性，单纯使用疫苗并不能根除PRV。因此，结合相应的能够准确鉴别野毒感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断方法，坚决淘汰PRV野毒感染猪是净化PR的唯一办法。目前，我国PRV野毒与疫苗毒鉴别诊断的试剂盒主要依赖于国外进口，因此研发出能够鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫的国产试剂盒迫在眉睫。1猪伪狂犬病病原学研究进展PR是由PRV引起的急性、高度接触性传染病。PR亦称奥耶斯基氏病（Aujuszky’sdisease，AD）。PRV是一种猪的疱疹病毒，在分类学上命名为猪疱疹病毒I型（SuidHerpesvirus1，SuHV-I）、与人的单纯疱疹病毒（HSV-1、HSV-2）、牛疱疹病毒I型（BHV-1）和马疱疹病毒I型（EHV-1）等同属-[1]疱疹病毒。PRV一旦感染，猪将终身带毒排毒，给养猪业带来毁灭性的打击。1.1猪伪狂犬病毒结构PRV粒子呈圆形或椭圆形，直径约150～180nm。一个具有感染性的病毒[2]颗粒主要由四个典型的结构组成，分别是囊膜表面蛋白、囊膜、核衣壳、芯髓。核衣壳包括衣壳蛋白和病毒基因组DNA；核衣壳外由一层非晶体状蛋白样结构所包裹；病毒粒子的外层囊膜是由宿主细胞膜结构衍生而来的脂质双层结[3]构；囊膜上镶嵌有病毒编码的囊膜蛋白，大部分为糖蛋白。PRV囊膜表面的[4][5]纤突与病毒感染也密切相关。此外，PRV的核衣壳也具有感染性。2 第一篇猪伪狂犬病的研究进展1.2猪伪狂犬病毒的基因组特征PR的基因组为线性双链DNA分子，大小约为150kb，GC含量约为75%，[6]可编码70～100种病毒蛋白质，其中大部分已被测序。PR的基因组分为长独特区（UL）、短独特区（US）及位于US两侧的内部重复序列（IR）与末端重[7]复序列（TR）等部分。其命名是以US和UL加入指定基因位置的数字标明。[8]PRV的基因组上有三个复制起点，分别是IR区的两个OriS与UL区的OriL。PRV基因组外部分布着带有保护作用的衣壳，其衣壳蛋白（VP5或MCP）的162个病毒壳粒（12个五位体和150个六位体）是由UL19编码并组装成，[9]呈直径约为125nm的二十面体结构。其中，衣壳边和面形成的六位体，分别由6个UL35（VP26）分子与6个UL19（VP5）分子组成，其它12个五位体[10][11]组成顶点。衣壳与囊膜之间包括内壳皮层与外壳皮层两个十分复杂的结构。壳皮蛋白中来自于病毒编码的蛋白至少有14个，其中的主要成分是VP2蛋白[12]（UL49基因），其肌动蛋白也可参与壳皮层的形成，但是由宿主细胞编码的。1.3猪伪狂犬病毒的毒力基因PRV的毒力通常受到多个基因的共同控制，其中起决定性作用的基因分别是TK和gE。gE基因，一旦缺失仅能对PRV的一级神经元造成感染，并不能[13]感染二级和三级神经元。TK基因，参与PRV的潜伏感染及其在中枢神经系统中的复制和传播，当前所使用的PRV基因缺失苗大都缺失了该基因。核糖核苷酸还原酶（ribonucleotidereductase，RR），作为PRV的另一毒力基因，是合成脱氧核糖核酸的重要途径。RR缺失株在猪体内不排毒，能够产生中和抗[14]体但仅具有部分保护力。除TK、gE和RR基因缺失可使病毒致弱外，其他[15]基因也能起到致弱作用。3 第一篇猪伪狂犬病的研究进展[13]图1.1PRV基因组转录图谱Figure1.1ThetranscriptionalmapofthePRVgenome4 第一篇猪伪狂犬病的研究进展1.4猪伪狂犬病毒的主要蛋白PRV编码的11种囊膜糖蛋白在其复制和传播的不同阶段发挥作用。gE蛋白是一种囊膜糖蛋白，位于US8区，可编码577个氨基酸。gE蛋白中含丙氨[16]酸12%，甘氨酸8%，脯氨酸11%，精氨酸8%。能够促进细胞融合，并能够介导PRV在神经细胞内的传导。gE蛋白是病毒的主要毒力因子，一旦缺失将严重影响PRV对神经系统的侵害。但即使缺失gE基因，也并不会影响PRV[17]的复制，所以病毒的免疫原性并不会受到很大的影响。同时，由于gE糖蛋白产生抗体迅速，持续时间长，因此被选用作为鉴别诊断的首选靶标。PRV的净化过程中，以gE蛋白作为标记区分野毒感染抗体和疫苗免疫抗体的优势在于gE基因高度的保守性，表达于所有野毒株且gE基因缺失苗较其他基因缺失苗的安全性更高。gE蛋白主要的抗原表位区位于N端的52～238位氨基酸，[18][19]其中存在两个线性表位和三个空间表位。Jacobs等应用免疫印迹法，对PRVgE糖蛋白的抗原表位进行分析。发现五个抗原表位区位于前面的52～238位氨基酸中。不同动物常针对不同的抗原表位产生相应的抗体，因此相同毒株[19]感染不同动物产生的抗体类型是不同的。在PRV基因组中，gE基因由于血清型单一，碱基序列保守，同源性高，所以其本身遗传变异性并不大。gE作为PRV重要的糖蛋白，不仅能够介导病毒在细胞间的扩散，还能够促进感染细胞[20]与附近非感染细胞的融合，影响PRV在猪体内的组织趋向性，有助于病毒[21]向神经系统扩散，是PRV经三叉神经节侵入中枢神经组织所必须的。gC蛋白，位于UL44区，编码480或者487个氨基酸，由于糖基化形式不同，gC蛋白有两种形式，分子量分别是51.2kDa和74.9kDa。gC是一种重要的囊膜糖蛋白，以单体形式存在于PRV囊膜表面且表达量较为丰富，对病毒的体[22]外复制是非必需的。gC对病毒的复制和侵入细胞不是必须的，但是缺失gC基因后其病毒株的感染力下降。gC蛋白的单抗也能在体外中和病毒感染而且还[23]能够保护小鼠和猪体免受感染。gC蛋白免疫诱导产生的中和抗体主要针对该蛋白的HS结合域里的表位，尽管宿主细胞间进行膜融合时使用的HS结合5 第一篇猪伪狂犬病的研究进展蛋白与PRVgC蛋白的HS结合域很相似，但由自身抗原造成的免疫耐受并不[24]影响机体产生针对gC蛋白HS结合域的抗体。因此，gC蛋白的HS结合域也可用于疫苗制备。在PRV所有的基因中，gC的保守型适中，常常被用来做[25]遗传进化分析。gB蛋白，位于UL27区，编码914个氨基酸，分子量为100.2kDa，是一种[26]I型糖蛋白，在病毒囊膜表面的表达量较为丰富。gB作为一种主要的糖蛋白，在病毒的穿入过程中不仅能够促进细胞膜与病毒包膜之间的融合，还能促进病[27]毒粒子与外层核膜的融合，以及感染与未感染细胞膜之间的融合。其N端前58个氨基酸为信号肽，C端有三个疏水域，最后一个疏水域是其跨膜区，胞内区含有93个氨基酸，在最后65个氨基酸中有两个α螺旋域和双亮氨酸及YQRL[28]内吞基序。在缺乏gC的情况下，病毒依然可以依赖gB和受体的结合侵入细胞，只是侵染能力下降。gB蛋白诱导产生的小鼠血清和猪血清均能在体外中和病毒感染，同时gB蛋白免疫后均能保护小鼠和猪体免受PRV感染，因此gB[29]蛋白是良好的亚单位疫苗靶标及诊断抗原。其N端59～126位氨基酸间存在3个连续性表位，214～279位氨基酸间存在1个连续性表位；在540～734位氨基酸间存在8个非连续性表位，其中2个非连续性表位位于540～646位氨基酸[30]间。这种表位分布与其它疱疹病毒gB蛋白的表位分布非常一致，再次表明gB蛋白的保守性。gD蛋白，位于US6区，编码400或402个氨基酸，分子量约为44kDa，[31]是1种I型糖蛋白，是病毒粒子表面重要的受体结合蛋白。gD蛋白是PRV的囊膜蛋白，参与病毒对宿主细胞的吸附和穿透过程，是病毒穿透细胞所必须[32]的受体结合蛋白，而且也是重要的保护性抗原。gD蛋白与PRV感染的猪血清反应性非常高，免疫原性较好。gD蛋白的单抗能够在体外中和病毒感染，携带gD基因的DNA疫苗或gD蛋白疫苗在小鼠及猪体内均能提供足够的免疫保护力；在囊膜蛋白中，gD蛋白诱导宿主产生的中和抗体应答水平最高，单独免[33]疫gD蛋白的亚单位疫苗即可保护猪体免受感染。研究发现：同时缺失gD6 第一篇猪伪狂犬病的研究进展和gI时会降低病毒在神经元细胞中的侵染能力，这一现象的机制目前还不清楚[34]。gH蛋白，位于UL22区，编码686个氨基酸，分子量约为72kDa，是一种[35][36]I型囊膜蛋白。gH蛋白具有高度保守性，包含4个保守的功能结构域。gH是病毒侵染宿主所必需的结构蛋白，参与病毒感染细胞与相邻细胞的融合过程。[37]gH蛋白通常和gL蛋白以复合体形式存在。gH蛋白是重要的免疫原性蛋白，[38]包含关键的能够识别中和抗体的表位，可以产生中和抗体。[39]gK蛋白，位于UL53区，编码313个氨基酸，分子量为34KDa。在病毒的入侵过程中，gK蛋白是非必需糖蛋白，但对于其在细胞与细胞之间的传播[40]却是不可或缺的。在病毒的复制过程中，gK突变株在正常细胞中的病毒滴[41]度会显著下降；此外，gK蛋白能够降低病毒重复感染的可能性。2猪伪狂犬病流行病学研究进展[42]该病1800年首次在美国发现，1902年Aujeszky在匈牙利将此病与狂犬[43]病（PR）鉴别开来，称为猪伪狂犬病（PR）。PR自发现以来，在全球范围[44]内广泛流行，造成了巨大的经济损失。我国自1947年刘永纯首次发现至今，流行情况依然严峻。为了预防、控制最终根除该病，各国研究学者对该病进行了大量的研究。同时建立了许多针对该病的诊断方法，现就PR流行病学的研究进展综述如下。2.1猪伪狂犬病流行形式PR流行范围广，在世界范围内均有猪群感染发病。许多欧美国家已经净化PR，部分国家在PRV的净化过程中也取得了显著的效果。我国在20世纪70年代使用基因缺失疫苗以来，在PR防控方面取得了很好的进展。但在2011年底，我国多个地区猪场在正常做好疫苗防控的情况下仍然出现了PRV感染发病的情况。随着疾病的进一步发展，许多猪场育肥后期猪群率先出现PR转阳的7 第一篇猪伪狂犬病的研究进展情况，且出现明显的呼吸道症状并伴随继发感染，使猪群死亡率上升，母猪妊娠后期出现流产，哺乳仔猪的死淘率持续上升，给猪场造成严重的经济损失。当前猪病在流行方面普遍面临“两新”现象，即老病新状，新发疾病。PR面[45]临gE、gC等多抗原点发生变异，属亚洲型强毒，免疫原性增强。从国外引进的疫苗因为同源性差所以效果不佳，分离本土毒株制得新型疫苗是防治该病[46]的关键。面对当前PR的流行现状，陈焕春院士曾提醒到疫苗Bartha株的保护力为60%，要想增强疫苗的保护力，最好采用病发的毒株研制基因缺失疫苗。猪群一旦感染此病，体内会产生免疫抑制，不仅严重影响疫苗的抗体水平，还会继发感染呼吸系统疾病。此外，多种病原之间的混合感染或继发感染也越来越常见。当前临床上PR的防控主要面临以下两个问题，即野毒感染猪的广泛存在以及商品猪群的免疫程序不合理，使得病毒在猪群中大量增殖。因猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrhea，PEDV）为了能够促进病毒的水平传播，在[47]很多猪场采用腹泻病例返饲，传播途径多也是造成该病流行的主要原因之一。猪群疫病综合防控监测措施不配套也是造成当前PR持续流行的主要因素。2.2猪伪狂犬病毒株变化从2011年后PR的发病率持续升高，经病毒分离等证实，PRV变异株与经典毒株存在一定的差异。多体现在几个碱基的增加、替换或缺失。如PRVJS株中gE、gB、gC、gD均存在多个碱基对的变化，使PR的多个病毒蛋白发生[48]特异性变化。该种变化使该毒株处在不同于经典毒株的另一个分枝上。经研[49]究发现新分离的流行毒株对于小鼠和猪的致病力明显增强。怀疑此种变化与PRV多个功能区域及结构蛋白的变化有关。也正是由于此种变化的出现使得现有疫苗不能为猪群提供全面的保护，出现目前PR的流行新形势。但接受变化的同时我们不能过分夸大PRV变异带来的危害，因为经典毒株与目前流行毒株仍同属一个血清型，之间仍存在有较高的交叉保护率，合理的采用疫苗免疫，仍然能够提供较高的保护率。同时我们需要了解疫苗的免疫保护力与很多因素8 第一篇猪伪狂犬病的研究进展有关，如猪群的健康状况良好是免疫成功的基础。目前，PR引起猪群大量发病的原因，除了毒株发生变异、毒力增强外，与当前我国猪场环境差、大多数猪群均处于亚健康的状态也有很大关系，这使得猪群无法对疫苗产生较好的保护[50]力。3猪伪狂犬病诊断研究进展PR作为危害全球养猪业的重大疫病之一，其诊断方法的研究进展一直受到各国研究学者的重视。目前用于PRV防控的疫苗多为gE基因缺失的弱毒疫苗，但野毒感染猪的出现，使得野毒与疫苗毒的鉴别诊断成为关注的重点。因此，以gE基因为靶标建立的ELISA方法由于其对高通量样本检测的优点而受到越来越多的关注。现就以gE为靶标建立的各种血清学以及分子生物学诊断方法的发展前景及研究现状进行综述，以期为我国猪群PR的诊断提供合理的科学依据。3.1基于gE基因的分子生物学诊断方法3.1.1PCR与多重PCR方法PCR技术是20世纪80年代建立起来的一种体外扩增DNA的分子生物学技术，由于其敏感性高、准确性好、特异性强等优点在实验室诊断中得到广泛应用。在PRV的实验室诊断中，应用PCR方法能够扩增PRV病料或活体样本中的基因，同时可检测大批样品。此外，还可用于特定病原体核苷酸序列的检测，用于监测PRV的流行病学及临床发病情况等，是目前实验室广泛应用的诊[51]断方法。多重PCR可以同时检测并鉴定多种病原微生物。通过在同一反应体系内的多对引物来实现多个核酸片段的扩增。该方法具有很好的特异性和敏感性，不仅能对PRV、猪圆环病毒（porcinecircovirustype2，PCV2）、猪细小病毒（porcineparvovirus，PPV）、猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）9 第一篇猪伪狂犬病的研究进展的单个或混合感染进行快速鉴别诊断，而且还能节省检测成本，是一种具有实用价值的分子生物学诊断方法，具有广阔的应用前景。3.1.2实时荧光定量PCR与多重实时荧光定量PCR方法实时荧光定量PCR（real-timefluorescequantitativepolymerasechainreaction，FQ-PCR）是在常规PCR的基础上通过加入荧光标记探针或相应荧光染料来实现其定量检测功能的。该技术具有较高的敏感性、较强的特异性强，而且不需[52]要进行电泳即可实现检测等优点。在PRVFQ-PCR检测方法中，该方法仪器运行时间仅为1h，检测速度快，与病毒分离相比，具有快速、敏感、特异、重复性好等优点。FQ-PCR不仅能对PRV的感染程度进行分析，而且还能够对PRV进行准确的鉴别诊断。FQ-PCR为PRV的诊断提供了一种科学的诊断方法，但所需成本较高，结果需要专业人员进行数据分析，限制了该方法在基层单位的推广应用。3.1.3环介导等温扩增方法环介导等温扩增方法（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增技术，与常规PCR相比，省略了模板的热变性、电泳及紫外观察等过程。操作简单，肉眼即可判读结果，适用于临床现场检测。在PRV的LAMP检测中，在改进反应体系后，建立了快速检测的可视化方法。比普通PCR相比，该方法的灵敏度要高出100倍，仅需40min[53]就能检测出结果。该技术在检测范围与敏感、特异等指标上均优于PCR技术，而且不需要任何仪器即可实现大量样本的检测，且成本也远低于FQ-PCR，可满足基层检测的需要，为PRV的诊断提供了便捷的的分子生物学检测方法。3.1.4核酸探针方法核酸探针技术是20世纪晚期发展起来的一种新型分子生物学诊断技术，其原理是碱基配对。不同病原体的核酸片段均不同，可以通过标记这些核酸片段[54]来制备探针，从而用于相应疾病的诊断研究。在PRV的核酸探针检测方法中，该方法具有很高的特异性和敏感性，可用于PRV野毒株的检测。该技术的10 第一篇猪伪狂犬病的研究进展本质是核酸与核酸之间的反应，由于探针能够重复使用，大大降低了检测所需成本，而且操作简便，适合于在基层进行推广使用。3.2基于gE蛋白的血清学方法3.2.1红细胞凝集试验1988年首次报道了建立检测人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）抗体的自体红细胞凝集试验方法。其原理是通过被检样本中抗原/抗体的桥联作用，使起指示作用的红细胞发生肉眼可见的凝集，然后根据凝集[55][56]情况实现快速检测的目的。在PRV的检测方法中，廖文军等建立了PRV抗体的红细胞凝集试验方法，将其与进口酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）抗体诊断试剂盒进行比较，符合率为100%。该方法操作简便、对实验人员和环境均无太多要求，对于基层单位疾病的诊断提供了一种选择。3.2.2酶联免疫吸附试验[57]自1971年Engvall等首次应用ELISA方法进行IgG的定量测定后，ELISA因具有简便，敏感，特异及高通量等优点，迅速成为继免疫荧光和放射性同位素之后的一种新型免疫酶技术，其原理是抗原、抗体间的免疫学反应。该方法在PRV的临床诊断方面得到了快速发展与广泛应用。在PRV的检测方法中，[58]柴虹等以纯化的gE蛋白为抗原包被酶标板建立PRV抗体检测的间接ELISA方法，与国外进口试剂盒的符合率高达93.6%。该方法由于敏感、特异，操作简便等优点，被广泛用于临床PRV的检测。此外，ELISA方法还有一个重要优点，可用于高通量样本的检测，满足了市场需要而被广泛应用。ELISA方法是目前临床上猪病检测与流行病学调查最常用的诊断方法，由于该方法原理简单、操作简便，可同时检测大批量样本，尤其适用于当前国内猪病现状的检测而受到广泛关注。11 第一篇猪伪狂犬病的研究进展3.2.3胶体金免疫层析方法胶体金免疫层析技术（goldimmunochromatigraphyassay，GICA）是20世纪80年代发展起来的。其原理是以胶体金作为示踪标志物，通过带颜色的胶体金颗粒来放大抗原抗体的特异性反应系统，使结果直接在固相载体上显示出来[59][56]的一种免疫测定技术。在PRV的GICA检测中，廖文军等在2010年用抗人红细胞的单链抗体－PRVgE蛋白为胶体金标记物和诊断抗原，以羊抗猪IgG包被NC膜作为质控线，研发了检测PRVgE抗体的gE-GICA，与国外gE抗体检测试剂盒对比，其符合率高达90.55%。该方法简便、特异、快速，肉眼于[60]15min内可判定结果，且不需任何仪器设备，特别适合于基层高通量检测和PRV的疾病普查，在未来PRV的诊断中具有广阔的应用前景。12 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备[61]gE蛋白是PRV主要的毒力因子，对病毒跨神经元传播不可或缺。gE基因的开放阅读框长度约为1731bp，可编码577个氨基酸，其抗原表位主要位于[61]N端的52～238位氨基酸。目前大部分商品化疫苗均缺失gE基因，然而，由于gE基因具有高度保守性，表达于所有野毒株，并且gE糖蛋白抗体产生迅速、持续时间长，因此被用来作为PRV野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的首选靶标。因此，要想净化PRV，野毒与疫苗毒的鉴别诊断具有重要意义。本研究为研发适合国内市场PRV抗体检测的间接ELISA方法，考虑到研发成本及市场应用，选取大肠杆菌系统对gE37～243蛋白进行表达，经过条件优化获得可溶性表达的蛋白gE37～243。用所表达的gE37～243蛋白作为抗原免疫小鼠，通过诱生小鼠产生腹水、辛酸硫酸铵纯化的方法制备单克隆抗体，以期为阻断ELISA方法的建立奠定坚实的基础。1材料1.1病毒、细胞、二抗及载体猪伪狂犬病毒汤阴株、SP2/0细胞、羊抗鼠IgG（goatanti-mouseIgG）、载体pET-28a、pET-32a、pCold-TF均由实验室保存。1.2主要试剂购置2×PfuPCRMasterMix、感受态细胞Rosetta（DE3）、质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒等均购自北京天根生化科技有限公司；DNAMarker购自13 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备TAKARA公司；T4DNALigase购自Thermo公司；SalI、KpnI购自NEB公司；DMEM培养基、HATSupplement购自GIBCO公司。1.3主要试剂配制（1）LB（Amp）液体培养基：称取蛋白胨2g、酵母浸出物1g、NaCl2g，加入超纯水混匀，定容至200mL。高压灭菌后，加入终浓度为34μg/mL的氯霉素，加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，4℃保存。（2）LB（Amp）板：称取蛋白胨2g、酵母浸出物1g、琼脂粉1.5g、NaCl2g，加入超纯水混匀，定容至200mL。高压灭菌后，待培养基冷却至40℃左右，加入终浓度为34μg/mL的氯霉素，加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，倒入平板中，即为LB（Amp）平板。（3）5×SDS-PAGELoadingbuffer：将2.4mL0.5MTris-HCl（pH6.8）、4mL10%SDS、0.1g0.5%BPB、10mL50%甘油放于洁净离心管中，加超纯水定容至20mL。（4）12%SDS-PAGE分离胶（15mL）：4.8mL超纯水、6mL30%丙烯酰胺溶液、3.9mL1.5MTris（pH8.8）、150μL10%SDS、150μL10%AP、6μLTEMED。（5）5%SDS-PAGE浓缩胶（6mL）：3.4mL超纯水、1mL30%丙烯酰胺、1.5mL0.5MTris（pH6.8）、60μL10%SDS、60μL10%AP、6μLTEMED。（6）SDS-PAGE电泳缓冲液：将15.1gTris、94gGlycine、5gSDS溶于1L超纯水，室温保存。14 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备1.4主要仪器名称型号/规格厂家/产地电子天平T1000常熟市双杰测试仪器厂PCR仪PTC-220BIO-RAD凝胶成像仪pgDeTect1Bioteke高速低温离心机GL-21M长沙湘仪蛋白纯化仪ATKAstsrtGE生物安全柜BSC-1100-LIIA2北京东联哈尔仪器-80℃超低温冰箱TH86340LA北京天地精仪医用低温保存箱DW-25L262中国海尔定时双向磁力搅拌器JB-2型金坛市科析仪器双通道数显注射乳化器RHQ-II保定市阳光科教仪器厂帕恩特纯水仪XYF2-40-H北京湘顺源有限公司2方法2.1引物设计经DNASTAR预测，发现gE蛋白前300位氨基酸的抗原指数较高，具有较好的亲水性，见图1.1。图1.1gE37～243基因表位预测Figure1.1TheepitopepredictionofgEgene15 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备根据gE基因预测结果，应用生物软件Premier5.0软件在氨基酸37～243区间设计了一对能扩增681bp片段的引物，并在上游引物和下游引物5'端加入酶切位点KpnI和SalI。引物送上海捷瑞公司合成，序列见表1.1。表1.1基因扩增引物序列Table1.1Primersforgeneamplification主要抗原表位区引物序列（5'→3'）上游（F）：GGGGTACCGAGGTTCCATCCCCATCTG37～243下游（R）：ACGCGTCGACGAGAATTTCACTGCCACC2.2目的基因扩增参考2×PfuPCRMasterMix说明书，以合成的基因片段为模板，用合成的引物进行PCR，反应体系如下：2×PfuPCRMasterMix25μLF2μLR2μLDNA1μLddH2020μLTotalVolume50μL反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；循环结束后72℃延伸5min。2.3目的片段回收PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用DNA回收试剂盒进行目的基因回收，步骤见DNA回收试剂盒说明书。2.4目的片段和载体的双酶切2.4.1目的片段的双酶切将回收的PCR产物，使用限制性内切酶KpnI-HF和SalI-HF，在37℃条件下酶切2～3h。酶切后采用DNA回收试剂盒进行回收，酶切反应体系如下：16 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备10×CutSmart5μLKpnI-HF2μLSalI-HF2μLDNA8μLddH2033μLTotalVolume50μL2.4.2载体的双酶切用KpnI-HF和SalI-HF37℃酶切2h，使载体线性化。酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用DNA回收试剂盒进行回收。酶切反应体系如下：10×CutSmart4μLKpnI-HF1μLSalI-HF1μLpET32a10μLddH2024μLTotalVolume40μL2.5目的片段与载体连接转化将酶切后回收的目的片段与载体连接转化，按照如下方法构建重组质粒。连接反应按目的基因与载体的摩尔比5～10：1的反应体系进行连接。室温连接30min后，将连接产物转化E.coliRosetta（DE3）细胞。体系如下：T4DNAligasebuffer1μLT4DNAligase0.5μLDNA0.8μLpET32a0.2μLddH207.5μLTotalVolume10μL17 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备2.6重组表达质粒的鉴定++从转化平板上挑取单个菌落接种于1mL含Amp和Cmr的LB液体培养基，220rpm摇菌4h，进行菌液PCR鉴定；鉴定正确后送北京擎科生物进行测序，-20℃保存。2.6.1重组质粒的菌液PCR鉴定参考2×PfuPCRMasterMix说明书，以重组质粒为模板，用T7通用引物进行PCR，然后将PCR产物进行凝胶电泳。反应体系如下：2×PfuPCRMasterMix5μLT70.5μLT7TER0.5μLDNA1μLddH203μLTotalVolume10μL反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；循环结束后72℃延伸5min。2.6.2核苷酸序列测定将菌液PCR鉴定正确的重组质粒命名为pETgE37～243。菌液送北京擎科生物测序。2.7重组表达菌株的培养及表达++将鉴定正确的pETgE37～243细菌培养液接种于含Cmr和Amp的LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养。待培养至OD600=0.6～0.8时取出200μL菌液，做为未诱导对照。剩下的菌液中加入IPTG至终浓度为0.25mM，继续振荡培养3h左右。取IPTG诱导后的菌液200μL，13000rpm离心1min，弃上清，沉淀用40μLPBS重悬后，加入8μL5×Loadingbuffer，100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，取上清进行SDS-PAGE，观察表达情况。18 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备2.8原核表达条件优化2.8.1诱导时间优化++将pETgE37～243表达菌接种于含Amp和Cmr的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600=0.6～0.8左右，加入IPTG至终浓度为0.25mM，分别在诱导2h、4h和6h时取菌液200μL，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳分析。2.8.2诱导温度和转速优化++将pETgE表达菌接种于含Amp和Cmr的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600=0.6～0.8左右，分别在37℃200rpm条件下诱导培养6h和18℃180rpm条件下诱导培养14～16h，各取诱导前后菌液200μL，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳分析。2.9蛋白Ni柱纯化将gE重组蛋白命名为gE37～243，将其在18℃摇床以180rpm转速条件下诱导表达14～16h，离心收集菌体上清，用bufferA（50mMTris、300mMNaCl、5mM咪唑pH8.0）重悬沉淀，冰浴超声破碎后离心收集上清，用0.22um的滤膜过滤除菌，待上柱。先用超纯水冲去柱子中的乙醇；然后用bufferA平衡柱子，给蛋白提供最适的环境；再通过恒流泵上样，此时蛋白在Ni柱中与Ni已经结合。通过bufferB（50mMTris、300mMNaCl、500mM咪唑pH8.0）进行梯度洗脱，当咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，当咪唑的终浓度为500mM时，洗脱下来的即为目的蛋白。将纯化后的蛋白置于1×PBS中4℃搅拌透析过夜。透析后的蛋白用来做Westernblot分析、免疫小鼠制备单抗和ELISA抗原包被。2.10表达产物的免疫印迹将表达产物先经12%凝胶进行SDS-PAGE，然后转移至NC膜上，进行Westernblot鉴定。19 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备2.11ELISA筛选系统的建立采用iELISA方法检测抗体效价，操作步骤如下：（1）包被：用gE37～243蛋白包被ELISA酶标板，每孔100μL，放于4℃冰箱过夜；（2）为了保证实验过程中的条件统一，尽可能减小实验误差，本试验中一致使用洗板机进行洗板，用PBS+0.1%吐温作为洗液洗涤五次；（3）封闭：用1%的牛血清白蛋白（bovineserumalbumin；BSA）进行封闭，每孔150μL，37℃封2h，拍干后2%蔗糖室温封闭30min，洗板重复步骤（2）；（4）加一抗：加入稀释好的抗体，设置阳性对照和阴性对照各1孔，每孔各100µL，37℃孵育1h后，洗板重复步骤（2）；（5）加酶标抗体：加1:2000倍稀释的酶标抗体，每孔100µL，37℃孵育1h，洗板重复步骤（2）；（6）显色：加入TMB显色液，每孔100µL，37℃避光显色10min；（7）终止：用0.05MH2SO4终止反应，每孔50µL；（8）检测：用酶标读数仪测定波长为450nm处的OD值。（9）结果判定：以阳性对照孔OD450值>0.2判定结果有效，检测孔OD450值大于阴性孔OD450值2倍判定为阳性，待测血清的最高OD450值即为抗体效价。2.12单克隆抗体的制备2.12.1细胞融合与培养（1）骨髓瘤细胞的培养：细胞融合前至少一个星期从液氮中解冻复苏SP2/0细胞。（2）饲养细胞的制备：细胞融合常用的饲养细胞多为腹腔巨噬细胞、小鼠正常[62]脾细胞和胸腺细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞具有吞噬死亡细胞的作用，并且制备方便，因此被广泛使用。2.12.2细胞融合选取3免或4免后效价最好的小鼠冲击免疫，两天后取脾脏进行细胞融合。[63]参考刘秀梵介绍的细胞融合方法进行融合。20 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备2.12.3阳性孔筛选按照iELISA的方法筛选阳性孔，取杂交瘤细胞的培养上清做ELISA检测。2.12.4阳性孔亚克隆采用有限稀释法对筛选到的阳性孔进行亚克隆，亚克隆后将检测到的阳性孔扩到24孔细胞板进行培养，长满后转移到6孔板继而转移到T75细胞瓶中进行培养。2.12.5腹水制备培养好的杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔制备腹水。2.12.6腹水纯化饱和硫酸铵沉淀纯化腹水。具体操作过程如下：2.12.6.1一次沉淀（1）4℃条件下腹水12000rpm离心5min，去除杂质，记录名称和体积；（2）每1mL腹水加入3mL的乙酸-乙酸钠缓冲液（0.06MpH4.0），在磁力搅拌器上混匀5~10min，再滴加30μL正辛酸，搅拌15~30min；（3）脱脂棉过滤一次，过滤后的液体4℃12000rpm离心5min；（4）取上清，精确确定其体积，并滴加等量的饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃静置沉淀过夜。2.12.6.2二次沉淀（1）一沉后的溶液弃上清，沉淀转移入离心管中，4℃12000rpm离心5min；（2）沉淀用0.01MPBS重悬，至沉淀完全溶解；（3）将重悬后的溶液移入小烧杯中，并用移液枪确定其体积，滴加一半体积的饱和硫酸铵至终浓度为33%，边加边搅拌，4℃静置沉淀过夜。2.12.6.3透析（1）二沉后溶液弃上清，沉淀移入离心管中，4℃条件下12000rpm离心15min；（2）弃上清，将下面的沉淀用0.01MPBS重悬，至沉淀完全溶解；（3）处理透析袋，用去离子水煮沸5~10min，注意使用前需对透析袋进行验漏；（4）将溶解后的溶液加入透析袋中，置于0.01M的PBS中，透析过夜。21 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备2.12.6.4收集单抗、测浓度将纯化好的单抗从透析袋中取出，确定其体积并测浓度后贴标签，于-20℃保存。3结果3.1目的基因扩增结果通过PCR扩增出gE37～243基因，经琼脂糖凝胶电泳，可见1条大小为681bp的目的条带，与预期大小一致，鉴定结果如图1.2。图1.2PRVgE37～243优势抗原表位区段基因PCR扩增结果M：蛋白质分子质量标准；1：gE37～243基因Figure1.2ThePCRamplificationresultofmajorantigenicepitopedomainofglycoproteinE37～243ofPRVM:Marker;1:ThegeneofgE37～2433.2pETgE37～243菌液PCR鉴定经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见一条大小约681bp的目的条带，与预期大小一致，鉴定结果如图1.3。22 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备图1.3菌液PCR鉴定结果M：蛋白质分子质量标准；1：pET-gE37～243重组质粒Figure1.3TheidentificationresultofbacterialiquidPCRM:Marker;1:TherecombinantplasmidofpET-gE37～2433.3pETgE37～243表达诱导前后的菌液进行SDS-PAGE电泳。诱导后，有一条分子量约为45kDa的条带，与预测大小一致，表明gE37～243蛋白在大肠杆菌中表达。结果如图1.4所示。3.4诱导时间优化将pETgE37～243表达菌分别在诱导2h、4h和6h时取样，进行SDS-PAGE，结果如图1.5所示，诱导时间对蛋白表达并无显著影响3.5诱导温度和转速的优化将pETgE37～243表达菌分别在37℃200rpm条件下诱导培养2～3h和18℃180rpm条件下诱导培养14～16h，进行SDS-PAGE，结果如图1.6显示，在18℃180rpm条件下为可溶表达。3.6gE37～243蛋白纯化及Westernblot分析利用Ni-NTA亲和层析对gE37～243蛋白上清进行纯化，得到较纯的目的蛋白（图1.7）；纯化后gE37～243蛋白的最终得率为42mg/L。Westernblot分析表23 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备明gE37～243蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体反应，具有良好的反映原性。图1.4IPTG诱导gE37～243重组蛋白表达M：蛋白质分子质量标准；1：pET-32a(+)对照上清；2：pET-32a(+)对照沉淀；3：诱导前；4：诱导后Figure1.4TheexpressionofgE37～243recombinantproteininducedbyIPTGM:Marker;1:controlsupernatantofpET-32a(+);2:controlprecipitationofpET-32a(+);3:beforeinduction4.postinduction图1.5pETgE诱导时间优化结果M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前；2：诱导后2h；3：诱导后4h；4：诱导后6hFigure1.5TheoptimizationresultofthetimeofpET-gEinductionM:Marker;1:beforeinduction;2:2hourspostinduction;3:4hourspostinduction;4:6hourspostinduction24 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备图1.6pETgE诱导温度和转速的优化结果M：蛋白质分子质量标准；1：37℃200rpm诱导上清；2：37℃200rpm诱导沉淀；3：18℃180rpm诱导上清；4：18℃180rpm诱导沉淀Figure1.6TheoptimizationresultofthetemperatureandrotationalspeedofpET-gEinductionM:Marker;1.Supernatant(inducedunder37℃200rpm);2.Precipitation(inducedunder37℃,200rpm);3.Supernatant(inducedunder18℃,180rpm);4.Precipitation(inducedunder18℃,180rpm)图1.7PRVgE蛋白Ni-NTA亲和层析纯化结果M：蛋白质分子质量标准；1：纯化前；2：纯化后；3：与His单抗反应Figure1.7TheNi-NTAaffinitypurificationresultofgE37～243proteinofPRVM:Marker;1:beforepurification;2:postpurification;3:reactionwithHismAb25 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备3.7融合前SP2/0的生长状态融合前的SP2/0处于对数生长期。细胞大小均一，浑圆透亮，如图1.8。图1.8SP2/0生长状态Figure1.8ThegrowthstatusofSP2/03.8单克隆孔中杂交瘤细胞的生长状态图1.9为杂交瘤细胞经过三次亚克隆后，第5天孔内细胞的生长状态。可见孔底较干净。图1.9单克隆孔中杂交瘤细胞生长状态Figure1.9Thegrowthstatusofhybridomacellsinmonoclonalhole26 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备3.9单抗筛选结果纯化的gE37～243蛋白免疫小鼠筛到单抗21株，ELISA检测结果显示3G8-1F2和3G8-1B6与PRV汤阴株病毒发生特异性反应。结果见表1.2。表1.2单抗筛选结果Table1.2TheresultofmonoclonalantibodyscreeningmAbOD450值mAbOD450值4G8-1F10.2251H6-1H40.1234G8-1D20.2241H6-1F70.0484G8-1G60.2551H6-H70.2164G8-1G90.1551H6-1C80.1871H6-1C40.0732F8-1F50.7262G6-1A20.1565G1-1D10.1633D11-1A70.1625G1-1G10.1292F8-1B30.2075G1-1C20.2755C5-1E70.1882F8-1H10.1763G8-1B62.1034G2-1H100.193G8-1F21.49NC0.1714讨论目前用于PR防控的商品化疫苗主要是gE基因缺失的弱毒疫苗。但是，由于野毒感染猪的存在，野毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断在PR的防控中具有重要意义。因此，gE蛋白作为鉴别诊断的靶标，其蛋白表达方式、载体的构建与是否具有生物活性等均具有重要意义。[64]覃雅丽等在2002年用巴斯德毕赤酵母表达系统表达了gE蛋白，毕赤酵母表达系统具有蛋白质翻译后加工和修饰的功能，可以使外源蛋白在毕赤酵母细胞中实现分泌表达，但周期长、成本高及目的基因表达水平低等缺点限制了其在市场上的应用。与真核表达系统相比，大肠杆菌是目前最常用的蛋白表达27 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备系统，具有周期短、成本低、操作简便、目的基因表达水平高与抗污染能力强[58]等诸多优点。柴虹等在2006年用大肠杆菌表达系统表达了gE蛋白，并将其作为靶标检测gE抗体，在临床上取得了较好的效果。因此，本研究选取大肠杆菌系统对gE蛋白进行表达。实验初期，分别构建了表达gE蛋白1～410位氨基酸及51～150位氨基酸的重组pET28a和pCold载体，然而这两种重组质粒在E.coliBL21和E.coliOrigamiB（DE3）宿主菌中均未表达。采用EMBOSS分析gE基因核苷酸序列，发现在50bp～1200bp中有两个CpG岛，再一次证实了PRV的高GC含量。选取37～243位氨基酸与pET-32a载体连接转化E.coliRosetta（DE3）宿主菌，经SDS-PAGE检测获得成功表达，确定表达产物以包涵体的形式存在。对gE基因序列进行分析，发现gE基因除高GC含量外，二硫键以及稀有密码子的存在均是影响其在大肠杆菌中能否获得可溶性表达的因素。为克服上述缺点，本实验尝试了不同的表达条件，在18℃180rpm诱导过夜的条件下获得具有可溶性表达的gE37～243蛋白。鉴于基因优势抗原表位区能在大肠杆菌中获得高效表达，而全基因合成的片段（1～410位氨基酸）则不能。因此，推测基因3'端的密码子偏爱性或者3'端的稳定性可能是其不能在大肠杆菌中表达的原因。同时，pET-32a(+)原核表达载体与pET-28a(+)载体相比，具有强大的外源蛋白表达功能，载体中能协同表达His、S和TrxA标签，为后续蛋白纯化与检测带来了方便。并且pET-32a(+)载体容易通过降低诱导物的浓度[65]来削弱蛋白表达水平，进而提高目的蛋白的可融部分产量。因此，推测本研究所摸索的重组质粒的诱导条件对获得可溶性表达的蛋白具有一定的借鉴意义。此外，大肠杆菌表达系统中的宿主菌有Origami系列、BL21系列及Rosetta系列等。OrigamiB（DE3）表达菌株包含突变的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶基因，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白可溶性。E.coliRosetta（DE3）表达菌是从BL21衍生而来，通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AGG、AGA、AUA、CUA、CCC和CGA的tRNAs，能明显增强[66]大肠杆菌稀有密码子或真核蛋白的表达。28 第二篇研究内容第一章猪伪狂犬病毒gE蛋白的表达及单抗制备由于部分临床血清中抗体水平较低，与iELISA方法相比，阻断ELISA方法效果更好。因此，本实验使用Ni-NTA亲和层析纯化的gE37～243蛋白免疫小鼠，通过诱生小鼠产生腹水、辛酸硫酸铵纯化的方法制备了具有抗原优势表位的单克隆抗体，以期建立灵敏度高、稳定性好的阻断ELISA方法。5小结5.1利用大肠杆菌表达系统获得了可溶性表达的PRVgE37～243蛋白，Westernblot和ELISA表明gE37～243蛋白具有良好的反应原性。5.2利用gE37～243蛋白免疫小鼠，获得了两株单克隆抗体，分别为3G8-1F2和3G8-1B6。29 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立传统的PR防控和净化策略是gE基因缺失疫苗与gE抗体诊断方法联合应用。利用此种方法，很多欧洲国家如英国、奥地利、丹麦和瑞典已经净化了PR，但PR在我国以及一些其他国家仍广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。因此，建立简便、快速、敏感、特异的抗体检测ELISA方法迫在眉睫。PRV抗体的血清学检测方法有SNT、IPMA和ELISA等，其中ELISA是国际贸易中指定的检测方法。当前市场上商品化试剂盒较常使用的是间接或阻断模式。因此，在本研究中，我们建立了PRV抗体检测的间接ELISA方法，同时对该方法的敏感性、特异性及重复性进行评价，并将该方法初步应用于临床样本的检测，以期为PR的临床检测、疫情监测和流行病学调查提供技术支撑。本研究以gE37～243蛋白作为包被抗原，建立抗体检测间接ELISA方法。用所建立的ELISA方法检测临床猪血清，拟达到PRV野毒与疫苗毒鉴别诊断的目的。1材料1.1阴阳性血清及二抗PRV、PCV2、PRRSV和CSFV等阴阳性血清由各地养殖场提供；兔抗猪IgG（rabbitanti-pigIgG）由北京纳百生物科技有限公司保存；1.2主要试剂购置辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase；HRP）、硼氢化钠（NaBH4）、高碘酸钠（NaIO4）、鸡卵清蛋白（OVA）等均购自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Seebio公司；HRP稳定剂II购自Biopanda公司；显色液TMB购自北京梅科万德有限公司。1.3主要试剂配制（1）0.2MPBS缓冲液配制：称取氯化钠170g、磷酸氢二钠57.6g、磷酸二氢钠30 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立5.92g放于洁净的锥形瓶中，加超纯水充分溶解，调节pH值至7.2。然后定容至1L，0.22μm滤膜过滤后常温保存。（2）0.2MpH7.2磷酸氢盐缓冲液（PBS）配制：称取磷酸氢二钠71.63g、磷酸二氢钠31.2g放于洁净的烧杯中，加超纯水充分溶解，调节pH值至7.2，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后常温保存。（3）0.05MpH9.6碳酸氢盐缓冲溶液（CB）配制：称取碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g放于洁净的烧杯中，加超纯水充分溶解，调节pH值至9.6，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后常温保存。（4）0.2MNaH2PO4配制：称取磷酸二氢钠31.2g放于洁净的烧杯中，充分溶解后加超纯水定容至1L，0.22μm滤膜过滤后常温保存。（5）0.2MNa2HPO4配制：称取磷酸氢二钠71.632g放于洁净的烧杯中，充分溶解后加超纯水定容至1L，0.22μm滤膜过滤后常温保存。（6）0.5MH2S04终止液配制：量取972mL超纯水、28mLH2S04溶液放于洁净的烧杯中，在搅拌器上充分混合均匀。1.4主要仪器名称型号/规格厂家/产地酶标仪MK3型美国Thermo公司全自动酶标洗板机PW-960深圳市汇松科技公司包被机B296北京拓普分析仪器公司微孔板振荡器QB9002海门市其林贝尔公司涡旋振荡器MX-F北京大龙兴创有限公司生化培养箱SPX-150B-Z上海博迅实业有限公司2方法2.1兔抗猪IgG与HRP偶联[67]采用简易过碘酸钠法将兔抗猪IgG与HRP进行偶联。偶联步骤如下：31 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立2.1.1称取2.0mgHRP溶解于0.5mL去离子水中，并向其中加入0.06MNaIO4溶液500μL，混合均匀，用铝箔纸包裹后室温静置30min。2.1.2加入0.16M乙二醇水溶液500μL，用铝箔纸包裹后室温静置30min。2.1.3加入含有2mg纯化抗体的水溶液1mL，混合均匀，装入透析袋，用0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液缓慢搅拌使其结合，4℃透析过夜。2.1.4加入2mg/mL的NaBH4200μL，混合均匀后室温静置2h。2.1.5取出后装入透析袋，在0.01MpH7.2的PBS溶液中溶解，4℃透析过夜。2.1.6加入优质甘油后分装到1.5mL的EP管中，-20℃保存。2.2iELISA检测方法iELISA检测方法操作步骤详见第二篇第一章2.11。2.3iELISA检测方法条件优化2.3.1抗原最佳包被浓度及最佳样品稀释倍数的确定采用棋盘法来确定gE37243蛋白的最佳包被浓度以及待检猪血清的最佳稀释倍数，具体步骤如下：用pH为9.6的碳酸盐缓冲液将纯化的蛋白进行稀释，浓度依次为：0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL，依次包被酶标板，4℃冰箱包被过夜。第二天用PBS+0.1%吐温洗涤后，以1%BSA37℃封闭2h，拍干后用2%蔗糖室温封闭30min。每孔加入用PBS稀释好的猪血清，稀释倍数依次为：1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640。其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值来确定抗原最佳包被浓度及最佳样品稀释倍数。2.3.2最佳血清稀释液的确定在优化的最佳抗原包被浓度以及最佳样品稀释倍数条件下，将血清稀释液设置为：PBS、PBS+0.1%吐温、PBS+0.2%吐温、PBS+0.5%吐温、PBS+0.1%吐温+1%BSA、1%BSA+0.1%吐温、1%BSA+0.3%吐温、1%BSA+0.5%吐温。其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳血清稀释液。32 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立2.3.3最佳封闭液的确定在以上最优条件下，依次加入以下几种封闭液：3%BSA、2%BSA、1%BSA、0.5%BSA、1%明胶、0.5%明胶、1%OVA、0.5%OVA、1%兔血清、5%兔血清、1%马血清、5%马血清。同时分别设置阴性对照，其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳封闭液。2.3.4最佳封闭时间的确定在以上最优条件下，将封闭时间设置为三组，分别为：37℃封闭1.5h、37℃封闭2h、37℃封闭2.5h。其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳封闭时间。2.3.5最佳包被液的确定在以上最优条件下，将包被液分别设置为0.05MpH9.6的碳酸氢盐缓冲液（CB）、0.2MpH7.4的磷酸氢盐缓冲液（PBS）、0.2MpH5.6的磷酸缓冲液（PB）、0.2MpH7.0的磷酸缓冲液（PB）以及0.2MpH8.0的磷酸缓冲液（PB），其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳包被液。2.3.6最佳抗原包被时间的确定在以上最优条件下，将蛋白包被时间设置为：37℃2h、4℃过夜、4℃过夜后37℃1h。其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳抗原包被时间。2.3.7酶标抗体工作浓度的确定在以上最优条件下，对兔抗猪酶标抗体的工作浓度进行优化，浓度梯度依次为1:1000、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000、1:5000、1:10000。其他步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值确定酶标抗体最佳工作浓度。2.3.8酶标抗体最佳工作时间的确定在以上最优条件下，将酶标抗体的孵育时间依次设置为30min、45min、33 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立60min。其他步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值确定酶标抗体最佳工作时间。2.3.9最佳样本作用时间的确定在以上最优条件下，将猪血清样本作用时间依次设置为30min、45min、60min。其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳样品作用时间。2.3.10最佳显色时间的确定在以上最优条件下，对显色时间进行优化，将显色时间分别设置为10min、15min，20min，其余步骤按照第二篇第一章2.11iELISA的操作步骤进行，根据P/N值的大小确定最佳显色时间。2.4iELISA检测方法的性能评价2.4.1iELISA检测方法判定标准的确定采用本实验所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法对50份标准阳性血清样本进行检测，同时检测SPF猪血清作为对照。测定OD450值，经统计学分析确定ELISA检测方法的判定标准。2.4.2敏感性检测采用本实验所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法对30份标准阳性血清样本进行检测，根据结果评估所建立的抗体检测间接ELISA方法的敏感性。2.4.3特异性检测采用本实验所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法分别对PCV2、PRRSV、CSFV共32份标准血清进行检测，根据结果评估所建立的抗体检测间接ELISA方法的特异性。2.4.4重复性检测取同一批次的6个酶标板以及不同批次的6个酶标板，检测阳性样品和阴性样本，根据结果计算批间和批内的变异系数，评估所建立的抗体检测间接34 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立ELISA方法的重复性。2.4.5符合率检测采用本实验所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法对实验室保存的30份猪血清阳性样本及45份猪血清阴性样本进行检测，并与HiproPRVgE糖蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒检测结果进行对比，评价两种方法的符合率。3结果3.1iELISA检测方法条件优化3.1.1抗原最佳包被浓度和最佳样品稀释倍数的确定从表2.1可知，当抗原稀释为0.25μg/mL、血清稀释倍数为1:80时，阳性值（P值）更接近1，阴性值（N值）小于0.3，因此以抗原浓度为0.25μg/mL、抗体稀释倍数为1:80作为最佳工作浓度。3.1.2最佳血清稀释液的确定在最佳抗原包被浓度和样品稀释倍数条件下，选择不同的血清稀释液，结果如表2.2所示，当稀释液为PBS+0.5%吐温时，P/N值最理想，因此选用PBS+0.5%吐温为最佳血清稀释液。3.1.3最佳封闭液的确定在以上最优条件下，选择不同种类不同浓度的封闭液，结果如表2.3所示，当封闭液为1%BSA时P/N值最理想。因此，选择1%BSA为最佳封闭液。3.1.4最佳封闭时间的确定在以上最优条件下，将封闭时间设置为1.5h、2h、2.5h，结果如表2.4所示，当封闭时间为1.5h时，P/N值最理想，因此选择1.5h为最佳封闭液。3.1.5最佳包被液的确定在以上最优条件下，将包被液设置为0.05MpH9.6的CB、0.2MpH7.2的PBS、0.2MpH5.6的PB、0.2MpH7.0的PB、0.2MpH8.0的PB，结果如表2.5所示，当选择CB时P/N值最理想，因此选择CB作为最佳包被液。35 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立2.1抗原包被浓度和样品稀释倍数优化结果Table.2.1Theoptimizationresultofcoatingconcentrationofantigenanddilutiontimesofsample抗原包被浓度（μg/mL）血清稀释倍数0.50.250.1250.06250.03125P2.1981.9551.5831.3910.69820N0.8230.7060.6000.5580.538P1.7191.3061.2071.0320.69440N0.5560.4690.3390.3510.373P1.7170.9990.8360.7300.47280N0.3580.2900.2210.2280.217P0.7610.6220.4970.3810.275160N0.2470.2140.1510.1540.153P0.6640.4030.3030.2570.229320N0.2470.2150.1200.1350.138P0.3610.2630.0770.1720.144640N0.1690.2440.0900.0950.101表2.2血清稀释液优化结果Table.2.2Theoptimizationresultofthediluentofserum血清稀释液P值N值P/N值PBS1.4760.8521.789PBS+0.1%吐温0.9940.6911.438PBS+0.2%吐温1.0580.5861.805PBS+0.5%吐温0.9430.3382.789PBS+0.1%吐温+1%BSA0.7630.6281.2151%BSA+0.1%吐温0.6430.5491.1711%BSA+0.3%吐温0.7260.5471.3271%BSA+0.5%吐温0.5540.4991.1103.1.6最佳抗原包被时间的确定在以上最优条件下，将抗原包被时间设置为：37℃2h、4℃过夜、4℃过夜后37℃1h。由表2.6可知，当抗原的包被时间是4℃过夜时，P/N值最理想，因此选择4℃过夜为最佳抗原包被时间。36 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立表2.3封闭液优化结果Table.2.3Theoptimizationresultofsealingfluid封闭液P值N值P/N值0.5%明胶1.4790.6182.3930.5%明胶1.4710.5762.5540.5%OVA1.4250.5832.4441%OVA1.4500.7791.8610.5%BSA0.8810.4761.8511%BSA0.9960.3782.6352%BSA0.8620.4881.7663%BSA0.8520.3882.1961%RS1.0010.4082.4535%RS0.9650.3742.5801%HS0.9560.4682.0435%HS1.0470.6581.591表2.4封闭时间优化结果Table.2.4Theoptimizationresultofblockingtime封闭时间1.5h2h2.5hP值1.1490.9950.971N值0.1620.1860.211P/N值7.0935.3494.602表2.5包被液优化结果Table.2.5Theoptimizationresultofcoatingliquid包被液种类P值N值P/N值0.05MpH9.6CB0.8520.2613.2640.2MpH7.2PBS0.7580.2562.9610.2MpH5.6PB0.5140.2811.8290.2MpH7.0PB0.9690.4492.1580.2MpH8.0PB1.1220.4012.79837 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立表2.6抗原包被时间优化结果Table.2.6Theoptimizationresultofantigencoatingtime包被时间P值N值P/N值37℃2h1.2300.2774.4404℃过夜1.1850.2315.1304℃过夜后37℃1h1.1270.2354.7963.1.7最佳酶标抗体工作浓度的确定在以上最优条件下，将酶标抗体稀释浓度分别设置如下：1:1000、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000。由表2.7可知，当酶标抗体的工作浓度为1:2000时，P/N值最理想，因此选择1:2000为酶标抗体的最佳工作浓度。表2.7酶标抗体工作浓度优化结果Table.2.7TheoptimizationresultoftheworkingconcentrationofEnzyme-labeledantibody酶标抗体浓度P值N值P/N值1:10001.8310.6552.7951:20001.6970.5712.9721:25001.3560.5242.5881:30001.2350.4992.4751:35001.1040.4292.5731:40001.0810.3992.7091:45000.8130.2982.7281:50000.6180.2612.3683.1.8酶标抗体最佳工作时间的确定在以上最优条件下，将酶标抗体的作用时间依次设置为37℃30min、45min、60min。由表2.8可知，当样品的作用时间为30min时，P/N值最理想，因此选择样品作用时间为37℃30min。38 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立表2.8酶标抗体反应时间优化结果Table.2.8TheoptimizationresultofthereactiontimeofEnzyme-labeledantibody酶标抗体作用时间30min45min60minP值0.8801.0671.145N值0.2460.4600.362P/N值3.5772.3203.1633.1.9最佳样品作用时间的确定在以上最优条件下，将样品的作用时间依次设置为37℃30min、45min、60min。由表2.9可知，当样品的作用时间为30min时，P/N值最理想，因此选择样品作用时间为37℃30min。表2.9样品作用时间优化结果Table.2.9Theoptimizationresultofthereactiontimeofsample样品作用时间30min45min60minP值0.7450.8090.864N值0.1730.2490.354P/N值4.3063.2492.4413.1.10最佳显色时间的确定在以上最优条件下，将显色时间分别设置为10min、15min、20min。由表2.10可知，当显色时间为10min时P/N值最理想，因此选择显色时间为10min。表2.10显色时间优化结果Table.2.10Theoptimizationresultofchromogenicreactiontime显色时间10min15min20minP值1.3111.4931.848N值0.2790.3220.423P/N值4.6994.6374.36939 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立3.2iELISA检测方法性能评价3.2.1iELISA检测方法判定标准的确定用所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法对50份PRV标准阳性样本进行检测，同时检测SPF猪血清作为对照。发现阳性血清OD值与对照OD值比值（S/N）均大于2.0。据此，当S/N﹥2.0时，判定为阳性。3.2.2敏感性试验用所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法对30份阳性标准血清进行检测，按照敏感性计算公式Sensitivity=TP/(TP+FN)×100（TP代表真阳性，FN代表假阴性）评估所建立抗体检测间接ELISA方法的敏感性。经计算，所建立PRV抗体检测间接ELISA方法的敏感性为93.33%。3.2.3特异性试验用所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法分别对PCV2、PRRSV、CSFV共32份标准血清进行检测，按照特异性计算公式Specificity=TN/(TN+FP)×100（TN代表真阴性，FP代表假阳性）评估所建立间接ELISA方法的特异性。经计算，所建立PRV抗体检测间接ELISA方法的特异性为93.75%。3.2.3重复性试验重复性试验结果如表2.11所示，批内变异系数范围在2.175%～9.272%，批间变异系数范围在2.443%～7.688%，批内与批间变异系数均在10%以下。表明所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法重复性较好。3.2.4与商品化试剂盒检测结果比较采用本实验所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法对实验室保存的30份阳性猪血清样本及45份阴性猪血清样本进行检测，并与HipraPRVgE糖蛋白阻断抗体检测试剂盒检测结果进行对比。按照符合率计算公式Coincidence=(TP+TN)/(TP+FN+TN+FP)×100（TP代表真阳性，FN代表假阴性，TN代表真阴性，FP代表假阳性）评估所建立间接ELISA方法的符合率。经计算，结果如表2.12所示，符合率达到92.00%。40 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立表2.11重复性试验结果Table.2.11Theresultofrepetitivetests批内重复性试验批间重复性试验样品号份数平均变异系数平均变异系数x±SDCV(%)x±SDCV(%)161.444±0.0312.1751.372±0.0815.908260.971±0.0767.8591.014±0.0252.443360.711±0.0537.4700.706±0.0213.018460.721±0.0527.1780.710±0.0527.358561.641±0.0623.7701.783±0.0975.438660.115±0.0119.2720.110±0.0087.018760.152±0.0042.6090.150±0.0095.719860.211±0.0188.5000.248±0.0166.326960.249±0.0187.3170.268±0.0186.7021060.236±0.0135.6280.233±0.0187.688表2.12间接ELISA和阻断ELISA对临床样本检测结果对比Table.2.12ThedetectionresultofclinicalsamplesbetweenindirectELISAandblockingELISAHipraPRV试剂盒检测方法阳性阴性合计阳性28230抗体检测间接ELISA方法阴性44145合计3243754讨论PR净化主要依靠gE基因缺失疫苗与gE抗体诊断方法的联合应用。在兽医临床上，gE抗体检测的血清学方法对降低病毒的流行率具有重要意义。最早41 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立[68]建立的PRV抗体检测方法是阻断免疫过氧化物酶单层试验（IPMA），但该方法操作复杂，技术要求高，不适合大规模推广。在PR的大规模检测中，ELISA方法由于其原理简单、操作简便、对实验条件以及检测人员专业水平要求不高而受到广泛关注。随后，各国研究学者分别以大肠杆菌、昆虫细胞、酵母等表达系统对gE蛋白进行了表达，建立了间接、夹心、阻断等各种ELISA检测方[64]法。覃雅丽等在2002年将巴斯德毕赤酵母表达的蛋白作为抗原包被酶标板建立PR抗体检测鉴别诊断ELISA方法，与HerdChek公司的gPI抗体诊断试剂盒对比，符合率为90.8%。毕赤酵母表达系统具有蛋白质翻译后加工和修饰的功能，可以使外源蛋白在毕赤酵母细胞中实现分泌表达，但周期长、成本高，不利于临床应用。与真核表达系统相比，大肠杆菌是目前最常用的原核表达系统，尤其适用于市场上疾病诊断方面的研究，具有周期短、成本低、目的基因[58]表达水平高与抗污染能力强等优点，给临床检测提供了有力的工具。柴虹等将大肠杆菌表达的蛋白作为抗原包被酶标板建立间接ELISA方法，并与国外INGENASA公司的试剂盒进行比较，其符合率为93.6%。迄今为止，我国大部分科研机构、学院以及规模化猪场多采用国外进口试剂盒。虽然国内用于PR检测的同类试剂盒也有很多，但效果较国外进口有一定差距。目前，用于PR检测的试剂盒多为间接或阻断模式，因此，本研究用gE37～243蛋白作为包被抗原，建立PRV抗体检测间接ELISA方法，以期为临床PRV野毒与疫苗免疫的鉴别诊断提供技术支撑。本研究利用可溶性表达的gE37～243蛋白代替全病毒抗原建立ELISA诊断方法，克服了全病毒抗原生产成本高，工序繁琐，易散毒等问题，且与多种病毒抗原无交叉反应，特异性和敏感性较好。在iELISA方法建立过程中，考虑到猪血清成分复杂，非特异性结合较多，因此本实验尝试了不同的血清稀释液，经过比较，确定最佳血清稀释液为PBS+0.5%吐温；在优化了血清稀释液的基础上，发现本底值仍然较高，考虑到封闭效果和洗涤是否彻底的原因，本实验尝试了不同种类不同浓度的封闭液和洗液，经过比较，确定最佳封闭液为1%BSA，最佳洗液为PBS+0.5%吐温；在优化了血清稀释液、封闭液、洗液、42 第二篇研究内容第二章PRV抗体检测间接ELISA方法的建立包被液以及一抗、二抗作用时间的基础上，发现阴性值仍然比预期值偏高。因此，尝试用空载体裂解蛋白与血清样本阻断降低其背景值，结果显示在血清稀释液中加入不同浓度的空载体裂解蛋白对检测结果并无明显影响。由此对本实验采取空板直接封闭，发现即使没有包被抗原的情况下其OD值依然很高。综上分析，临床猪血清背景不清楚，且成分较为复杂，是阴性值偏高的主要因素。PRVgE抗体检测过程中存在诸多问题，因猪体内产生的针对不同表位的抗体应答差异较大，故常出现假阳性结果。另外也存在非特异性反应、假阴性反应或弱阳性率较高等问题。通常提高敏感性后假阳性结果也会增多，因此临界值的选择尤为重要。在血清学检测方法中，ELISA方法对高通量样品检测的优势最为明显。iELISA方法可提供较多的检测表位，但对检测抗原的纯度要求较高，为降低其非特异性反应，血清稀释液的优化起到至关重要的作用。在本研究中，我们选取PRVgE基因的优势抗原表位区在大肠杆菌中高效表达，利用Ni-NTA亲和层析纯化的gE37～243蛋白作为抗原包被酶标板建立了gE抗体检测间接ELISA方法，其敏感性为93.33%，特异性为93.75%，批内以及批间变异系数均小于10%。与商品化试剂盒相比，二者符合率为92.00%。说明本实验所建立的PRV野毒与疫苗免疫鉴别诊断方法在敏感性、特异性及重复性上均能满足对PRV鉴别诊断的需要。5小结5.1以gE37～243蛋白作为包被抗原，建立并优化了用于检测PRV抗体的间接ELISA方法，该方法的敏感性为93.33%，特异性为93.75%，批内与批间变异系数均小于10%。5.2与商品化Hipra伪狂犬病毒糖蛋白E特异性抗体阻断ELISA试剂盒符合率为92.00%。43 结论结论以大肠杆菌表达的可溶性PRVgE37～243蛋白作为包被抗原，本研究所建立的PRV抗体检测间接ELISA方法的敏感性为93.33%，特异性为93.75%，批内与批间变异系数均小于10%。与商品化Hipra伪狂犬病毒糖蛋白E特异性抗体阻断ELISA试剂盒符合率为92.00%。44 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作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介：姓名：王杨性别：女民族：汉籍贯：吉林松原政治面貌：共青团员出生年月：1993年05月教育背景：2014年9月~2016年7月，临沂大学生命科学学院农学学士2016年9月~2018年7月，吉林大学动物医学学院农学硕士51 导师简介导师简介丛彦龙，男，1977年3月出生，汉族，博士，教授，吉林大学动物医学学院预防兽医学系硕士研究生导师。现任吉林大学动物医学学院预防兽医学系动物传染病学教研室主任、中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会常务理事、国家自然科学基金委生命科学部同行评议专家、吉林省第五批拔尖创新人才。国家重点研发计划课题负责人，主持国家自然科学基金面上项目、国家自然科学青年基金项目、吉林省科技厅重点项目、吉林省教育厅“十二五”科技项目、吉林大学自然科学基本科研业务费资助项目、吉林大学杰出青年科学基金培育计划项目等10项课题。获得吉林省科学技术进步二等奖3项、吉林省自然科学学术成果二等奖2项、国家质检总局“科技兴检奖”三等奖1项；获得国家发明专利2项。主编《动物传染病学实验指导》、《犬养殖场消毒与疫苗防制技术》，副主编《猪病防治手册》、《奶牛场消毒与疫苗使用技术》，参编《动物微生态学》、《野生动物疫病学》、《犬病（兽医全攻略）》、《兽医微生物学实验指导》等著作与教材9部。在国内核心期刊和国外学术期刊上发表学术论文70余篇，其中第一作者署名SCI收录论文18篇。52 致谢致谢两年的时光转瞬即逝，在此论文完成之际，回首两年学习历程，衷心感谢我的导师丛彦龙教授给了我这样一个学习与进步的机会，这将是我人生中一笔巨大的财富。感谢导师在整个研究生学习过程中扮演着至关重要的角色。丛老师，他不仅是严师更是益友，不仅对于我的实验倾注了大量的心血和汗水，而且在生活上也给予了很大的帮助，更是我人生道路上一位重要的导师。导师严谨的为师之道，在以后的学习和工作中时刻鞭策和鼓舞着我！衷心感谢赵荣茂博士在整个实验过程中给予的指导和帮助。在赵老师悉心的指导和耐心的帮助下，我才能顺利完成我的学业。赵老师学识渊博，勤勉敬业，具有严谨的科研态度和敏锐的学术思维。他高尚的科学素养，对科学孜孜以求的精神，对困难迎难而上的态度，以及豁达宽广的胸怀时刻鼓舞着我，激励着我。感谢丁壮教授在课题、实验和论文撰写过程中给予的指导！他严肃的科学态度、严谨的治学精神、精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向丁老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！感谢动物医学学院韩文瑜教授、张西臣教授、雷连成教授、高丰教授、邓旭明教授、王新平教授、李建华教授、杨勇军教授、柳增善教授、母连志副教授、尹仁福老师、孙长江老师、宫鹏涛老师等在平时的学习、实验中给予的帮助和支持！感谢研究生处高英杰处长、崔成锐老师、郝永亮老师、王开宇老师及动物医学学院的领导在两年学习和生活中给予的支持和帮助！由衷感谢课题组的全体同学，在学习、工作、生活上给予我的关心和帮助。特别感谢宋辉、卢帅、陈谏、魏单平、吴佳兴、钱晶、徐小洪、邓颖琦、唐雨博、徐文章、杨莹莹、连晓欢、石立北等实验室各位同学在学习期间给予的支持与帮助！同时感谢孙胜楠、沈文奇、钟婉琪等同学在两年的学习和生活中热情的关怀与帮助！衷心祝愿各位同学学业有成，前程似锦。53
