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微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义中文摘要微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义中文摘要【研究目的】应用流式细胞术(FMC)动态监测经诱导治疗后的多发性骨髓瘤微小残留病,探究其与临床治疗及预后的意义，并分析MRD与疗程、疗效、治疗方案的选择及其生存预后的关系，从而评估MRD对疾病的状态、判断疗效、预测复发及早期干预方面的临床意义，研究出一套适合临床治疗的方法。【研究方法】1.用回顾性分析的方法针对2010年1月~2013年12月在我院接受治疗的44例多发性骨髓瘤患者,随访结束日期为2014年5月31日，进行治疗效果及预后判断,。其中男性26例，女性18例,分为两组，PD/PAD组22例，VAD组22例，PD/PAD组组用硼替佐米+地塞米松±阿霉素（PD/PAD）进行治疗；VAD组则使用传统治疗方法即长春新碱、阿霉素、地塞米松（VAD）进行治疗。2.用四色流式细胞术(CD38/CD138/CD19/CD45或CD38/CD138/CD56/CD45)检测我院血液研究中心治疗44名多发性骨髓瘤患者的初次免疫表型并对其二个疗程、四个疗程及移植后3个月的MRD进行检测。根据MRD检测结果，分为2组，即低MRD和高MRD两组，其中分组标准定义为低MRD组（MRD<10e-3），高MRD组（MRD≥10e-3）,并且MRD<10e-5为MRD阴性。3.总结临床资料，采用SPSS19.0统计软件分析观察MRD对疗效、治疗方案的选择及预后的影响。【研究结果】1.进行单因素分析发现血β2微球蛋白、血清钙浓度和白蛋白是影响患者预后生存期的不良预后因素。2.初治患者免疫表型中位值为12.6%，两个疗程及四个疗程的中位MRD值分别为1.5*10e-3、2.9*10e-4，疗程增加MRD水平明显下降。3.疗程对疗效的影响结果显示：2疗程的有效率72.73%，4疗程的有效率为III 中文摘要微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义84.09%，虽然P＞0.05，无统计学意义，但随疗程增加，患者的有效率较前增高。4.二个疗程与四个疗程治疗后,低MRD组病例数分别为7例、17例，高MRD组病例数分别为37例、27例，从两组结果对比发现，四个疗程比两个疗程更能获得低MRD，并且两组之间存在统计学意义（P<0.05）。5.两个疗程的诱导治疗以后，低MRD组中位OS及PFS均尚未出现,，高MRD中位OS时间30个月，中位PFS时间23个月,低MRD组的中位OS及PFS比高MRD组延长，P=0.117(＞0.05)，差异无统计学意义.。四个疗程的诱导治疗以后，低MRD的OS及PFS时间尚未出现，高MRD中位OS时间28个月，中位PFS时间23个月，故低MRD患者的生存时间明显延长，P=0.011（＜0.05），差异有统计学意义。6.MRD水平对CR率的影响，结果显示：①两个疗程以后，低MRD组CR率为71.42%，高MRD组CR率为54.05%，P值为0.092（P＞0.05），两组无统计学差异；②四个疗程以后，低MRD组CR率为76.47%，高MRD组CR率为40.74%，P值为0.218（P＞0.05），两组无统计学差异。7.MRD水平与治疗方案的关系，结果显示：①两疗程PD/PAD组与VAD组比较，低MRD率分别为18.18%和13.64%。P=1.00(P＞0.05)，差异无统计学意义。②四疗程PD/PAD组与VAD组比较，低MRD率分别为54.55%和22.73%，P=0.03(P<0.05)，差异有统计学意义。8.移植对MRD水平及预后的影响，结果显示：①初治免疫表型及两个疗程及四个疗程的MRD，并对移植患者移植后3个月患者MRD检测，结果示初治患者免疫表型中位值12.4%，两个疗程、四个疗程及移植后的中位MRD为2.5*10e-3、3.8*10e-4及4.0*10e-5，得出随着疗程数增加及移植维持治疗的选择，患者的MRD水平明显降低。②两个疗程、四个疗程及移植后，低MRD率分别为为11.76%、41.17%、64.71%。P=0.008(P<0.05)，差异有统计学意义。③移植对PFS及OS的影响，移植组中位PFS、OS时间均未出现，非移植组中位OS、PFS分别为28个月、23个月，两组对比P值分别为0.495、0.122，差异均无统计学意义。IV 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义中文摘要9.诱导治疗方案的选择对PFS及OS的影响，，，，结果显示：PD/PAD组中位PFS、OS时间均未出现，VAD组中位OS时间17个月，中位PFS时间未出现，两组对比P值分别为0.006、0.000，差异均有统计学意义。【研究结论】1.在本研究中，无论是PD/PAD组还是VAD组，四个疗程以后，更能获得低MRD的水平，并且对比两个疗程之后两组之间存在的差异，得出四个疗程后低MRD组生存时间明显延长，故MRD水平可预测患者OS及PFS，并对评估疾病状态、判断疗效、预测复发及早期干预有重要的临床意义。2.PD/PAD组与VAD组相比，PD/PAD组在四个疗程之后，低MRD率明显增高，并且得到更长的生存时间。得出MRD比传统的细胞形态学、本周氏蛋白等预后指标预测疾病的复发更敏感，故MRD可作为影响患者预后生存的不良预后因素。3.进行移植维持巩固治疗与诱导治疗相比，能够获得更多的低MRD率，并且从中位值上得出移植组MRD为阴性的人数明显增加，以及对比生存时间，移植可能会延长患者的PFS及OS。4.新型靶向药物硼替佐米联合化疗进行诱导治疗多发性骨髓瘤，其效果明显，特别低MRD组病人可明显延长患者的PFS及OS，对改善预后具有重要意义。【关键词】多发性骨髓瘤；PAD；VAD；细胞流式术（FMC）；微小残留病（MRD）；疗效；预后；作作作者者者：者：：：陈中磊陈中磊指导老师指导老师：指导老师：：：傅琤琤傅琤琤V AbstractTinyresiduallesiondetectionforclinicaltreatmentandprognosisofmultiplemyelomaTinyresiduallesiondetectionforclinicaltreatmentandprognosisofmultiplemyelomaAbstract【【【objective】】】Applicationofflowcytometry(FMC)dynamicmonitoringtinyresidualdiseaseafterinductiontherapyofmultiplemyelomaandexploretheirsignificanceandclinicaltreatmentandprognosis,andanalyzetheMRDandcourseoftreatment,efficacy,CRrate,therelationshipbetweenthechoiceoftreatmentandprognosisofsurvival,toassessMRDstatus,judgethecurativeeffectandpredictingrecurrenceofdiseaseandtheclinicalsignificanceofearlyintervention,developedasetofsuitableforclinicaltreatment.【【【methods】】】1.UsethemethodofretrospectiveanalysisonfromJanuary2010toDecember2010inourhospitalfortreatmentof44patientswithmultiplemyeloma,follow-upenddateisonMay31,2014,treatmenteffectandprognosticjudgment,effect.10casesof14casesofmen,women,dividedintotwogroups,22casesofPD/PADgroup,VADgroupof22cases,PD/PADwayfortheuseofboronwithm+dexamethasone+adriamycin(PD/PAD)treatment;VADgroupusingtraditionaltreatmentsvincristine,adriamycin,dexamethasonetreatment(VAD).2.Usefour-colorflowcytometry(CD38/CD138/CD19/CD45orCD38/CD138/CD56/CD45)detectioninourbloodresearchcenterforthetreatmentof44patientswithmultiplemyelomaprimaryimmunephenotypeandthesecondcourse,fourperiodoftreatmentand3monthsaftertransplantationofMRDdetection.AccordingtotheresultsoftheMRDdetectionisdividedintotwogroups,namelylowMRDandhighMRDinthetwogroups,onegroupstandardisdefinedasalowMRDgroup(MRD<10e-3),highMRDgroup(MRD10e-4orhigher).3.Summarizeclinicaldata,usingobservationMRDSPSS19.0statisticalsoftwareanalysisofcurativeeffect,theinfluenceoftheselectionoftreatmentplanandprognosis.VI TinyresiduallesiondetectionforclinicaltreatmentandprognosisofmultiplemyelomaAbstract【【【results】】】1.Afterthesinglefactoranalysisfoundthatthebloodβ2microglobulinandtheprognosisofpatientswithserumcalciumconcentrationandthealbuminisadverseprognosticfactorsforsurvival.2..Totreatpatientswithearlyimmunephenotypethemedianvalueof12.6*10e-2,fourcoursesoftwoperiodoftreatmentandthemedianvalueofMRDwere1.5*10e-3,4,2.9*10e-treatmentincreasetheMRDleveldeclinedobviously.3.Theeffectoftreatmentoftheresultsshowedthatthe4coursesofeffectiveratewas72.73%,2treatmenteffectiveratewas84.09%,whileP>0.05,nostatisticalsignificance,butwiththeincreaseoftreatment,patientswithhigherefficientcomparedwiththeprevious.4.Aftertwocoursesandfourcoursesoftreatment,lowMRDgroupthenumberofcasesof7casesrespectively,17cases,highMRDcasesof37cases,27cases,respectively,fromtheresultsoftwogroupsfoundthatfourcoursecangetlowMRDmorethantwoperiodoftreatment,andthereisstatisticalsignificancebetweenthetwogroups(P<0.05).5.Aftertwocoursesofinductiontherapy,themedianOSandPFSMRDgroupwerelower,hasyettohappen,lowmedianOSMRDgroupandprolongPFSthanhighMRDgroup,P=0.117(>0.05),therewasnostatisticallysignificantdifference.Afterfourcoursesofinductiontherapy,lowMRDOSandPFStimehasnotyetappeared,highMRDSOS28months,themedianPFS23monthstime,sothelowMRDpatientssignificantlyprolongsurvivaltime,(P=0.011<0.05),thedifferencewasstatisticallysignificant.6.MRDlevelinfluenceonCRrate,theresultsshowed:(1)aftertwocourseoftreatment,remissionratewas71.42%,lowMRDgrouphighMRDgroupofremissionratewas54.05%,Pvalueis0.092(P>0.05),nostatisticaldifferencebetweentwogroups;(2)afterfourtreatment,lowMRDgroupofremissionratewas76.47%,highMRDgroupofremissionratewas40.74%,Pvalueis0.218(P>0.05),nostatisticaldifferencesinthetwogroups.7.MRDlevelandtherelationshipbetweenthetreatment,theresultshowsthat:(1)twocoursesofPD/PADgroupcomparedwithVADgroup,lowMRDratewere18.18%and13.64%respectively.P=1.00(P>0.05),therewasnostatisticallysignificantdifference.VII AbstractTinyresiduallesiondetectionforclinicaltreatmentandprognosisofmultiplemyeloma(2)fourcoursesofPD/PADgroupcomparedwithVADgroup,lowMRDratewere54.55%and22.73%respectively,P=0.03(P<0.05),thedifferencewasstatisticallysignificant.8.TransplantationeffectonMRDlevelandprognosis,theresultsshowed:(1)earlyimmunephenotypeandtwoperiodoftreatmentandcureMRD,fourtreatmentand3monthsaftertransplantationinpatientswithtransplantpatientswithMRDdetection,earlyresultsincureinpatientswithimmunephenotypemedian12.4*10e-2,twoperiodoftreatment,fourperiodoftreatmentandaftertransplantationofthemedianMRD2.5*10e-3,3.8and4.0*10*10e-4-5e,itisconcludedthatastimeincreaseinthenumberandtheselectionoftransplantmaintenancetreatment,patientswithMRDleveldecreasedobviously.(2)twoperiodoftreatment,Fourcyclesaftertransplantation,lowrateofMRDrespectivelyis11.76%.,41.17%,64.71%.P=0.008(P<0.008),thedifferencewasstatisticallysignificant.(3)theinfluenceoftransplantationofPFSandOS,themedianPFS,OStimetransplantationgroupwerenotpresent,notinthetransplantationgroupOS,PFS28months,respectively,23months,twogroupsofcontrastPvalueswere0.495,0.122,differenceswerenotstatisticallysignificant.9.InductiontherapyschemeofPFSandtheinfluenceoftheOS,theresultsshowedthatthePD/PADsetofmedianPFS,OS,timeforVADgroupOS17months,themedianPFStime,twogroupsofcontrastPvalueswere0.006,0.000,differenceswerestatisticallysignificant.【Theresearchconclusion】1.Inthisstudy,whetheritbeaPADorVADgroup,afterfourtreatmentcourse,lowMRDlevel,andcomparethetwothedifferencebetweenthetwogroupsaftertreatment,itisconcludedthatlowMRDafterfourtreatmentgroupssignificantlyprolongsurvivaltime.SotheMRDlevelcanpredictpatientswithOSandPFS,andpredictionandjudgethecurativeeffectandtheassessmentofdiseaserecurrenceandearlyinterventionhasimportantclinicalsignificance.2.ThePADgroupcomparedwithVADgroup,PADgroupafterfourtreatment,lowrateofMRDsignificantlyincreased,andgetalongersurvivaltime,itisconcludedthatMRDthanconventionalprognosticindicators,suchascellmorphology,thezhouproteintoVIII TinyresiduallesiondetectionforclinicaltreatmentandprognosisofmultiplemyelomaAbstractpredictdiseaserecurrence,moresensitive,sotheMRDcanbeusedaspoorprognosisfactorsaffectingtheprognosisofpatientssurvival.3.Thetransplanttomaintaincomparedwithinductiontherapy,consolidationtreatmentcanobtainalowerrateofMRD,andtransplantgroupofMRDplacevalueondrawnegativesignificantlyincreased,thenumberofPFSandOSinpatientswillextend.4.Thenewtargeteddrugsboronforricecombinationchemotherapyfortreatmentofmultiplemyelomainduced,itseffectisobvious,especiallylowMRDpatientcanobviouslyprolongthepatient'sPFSandOS,isofgreatsignificancetoimprovetheprognosis.【【【keywords】】】multiplemyeloma;Boronforzcmeters;Cellsflowtechnique(FMC);Microscopicresidualdisease(MRD);Curativeeffect;TheprognosisWrittenby:ChenzhongleiSupervisedby:FuchengchengIX 目录第一章前言....................................................................................................................1第二章资料与方法............................................................................................................5一、一般资料....................................................................................................................5二、实验方法....................................................................................................................7三、诊断标准及分期........................................................................................................7四、治疗方法....................................................................................................................8五、疗效观察与随访........................................................................................................9六、统计方法..................................................................................................................12第三章结果..................................................................................................................13一、基本临床资料及生物学指标与不良预后因素分析..............................................13二、FMC检测结果分析.................................................................................................13三、疗程对MRD水平的影响.......................................................................................14四、疗程对疗效的影响..................................................................................................15五、疗程对低MRD率的影响.......................................................................................15六、MRD水平对OS及PFS的影响...........................................................................16七、MRD水平对CR率的影响.....................................................................................19八、MRD水平与治疗方案的关系................................................................................20九、移植组对MRD水平及预后的影响.......................................................................21十、诱导治疗对PFS及OS的影响..............................................................................24第四章讨论..................................................................................................................26第五章结论..................................................................................................................32参考文献..............................................................................................................................33综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展......................................................38参考文献..............................................................................................................................43中英文缩略词汇表..............................................................................................................46致谢................................................................................................................................47 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第一章前言第一章前言多发性骨髓瘤（MM）是恶性肿瘤中的一种，多发于中老年人，我国MM的发病年龄多在50岁以上，男性发病率要高于女性，并且占血液恶性肿瘤疾病发病率的10%，西方发达国家只有2.5%。它一个最显著特征是患者的骨髓中出现了可以无限克隆的恶性浆细胞，其迅速繁殖以后，在患者的血液、尿液中都存在单克隆免疫球蛋白或者是[1]轻链，患者在短时间之内会发生骨质疏松或者溶骨性病变。因发病机制并不明晰，起病隐秘，所以误诊率较高，很多时候患者的症状为发热、尿频、腰腿疼痛会被误诊为感染、肾炎，耽误了治疗时间，对预后恢复有较大的影响。多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆增生的恶性肿瘤疾病，作为一种不可治愈的恶性疾病，其临床表现主要有骨分解代谢所致的溶骨损害、病理性骨折、高钙血症、贫血、免疫抑制、分泌单克隆免疫蛋白所导致的终末器官损害，占新诊断肿瘤的1%，[2]血液肿瘤的10%。其中肾功能不全是MM常见的合并症之一，发病率为20％～[3]40％。合并肾功能不全的MM患者预后较差，早期病死率高，中位生存期不足2年。在现行的传统治疗方法中，不可避免的受到增值比例很低以及耐药性强的影响，因此目前对MM的治疗仍然十分困难，没有根治的手段和方法。多发性骨髓瘤目前主要有三种治疗方法，一种是移植，一种是传统治疗方法，另外一种是使用美国引进的万珂进行联合治疗。化疗是目前治疗多发性骨髓瘤的最基础治疗方法，可以延长患者的生存期，但并不能够治愈。传统的治疗方法是在化疗的基础上，使用VAD、MP等化疗方案来帮助患者延长生存期，但疗效因人而异，且起效慢，反应率较低，大多数患者易复发及进展，完全缓解率(CR)才不到l0％，中位生存期仅3年左右。移植分为异基因造血干细胞移植和自体造血干细胞移植，相比之下自体造血干细[4]胞移植的安全性较为安全，但MRD导致的复发率较高，且异基因造血干细胞移植[4]患者在移植的过程中所要承受的痛苦较大、死亡率较高，但复发率明显下降，患者年龄不能够超过65周岁。鉴于以上两种治疗方案都或多或少的存在一些弊端，无论是患者还是医务人员都迫切的想要寻找一种治疗多发性骨髓瘤的最有效治疗药物，而万珂就是目前效果较好新型靶向药。1 第一章前言微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义目前主要治疗手段仍是化疗，参与传统化疗以后的MM患者中位生存期为3~4年。在治疗MM的标准方案中，存在MP（马法兰+泼尼松）方案、VAD（长春新碱+阿霉素+地塞米松）方案等标准方案存在，但这些传统的化疗方案对于多发性骨髓瘤的治疗效果并不理想，且疗效不能够长期维持。因传统化疗完全缓解（CR）率低，缓解时间短，大剂量化疗后联合自体造血干细胞移植能显著提高CR率，延长无进展生存[5]（PFS）时间和总生存期（OS），已成为目前65岁以下患者的一线标准治疗方案。随着医疗技术的不断提高，很多新兴的治疗方案应用于多发性骨髓瘤的临床治疗中，鉴于近年来研究发现新生血管的生成在MM的发病机制中占有重要地位，新药沙利度胺在MM的临床治疗中疗效很好，虽然延长了缓解期，但是对于生存期的延长没有实质性的作用。异基因造血干细胞移植一直被认为是可以根治MM的方法，但在实际的操作中往往因为患者年龄大、配型困难、手术费用达、移植后并发症多、死亡率较高而让人望而却步。大剂量的化疗加上自体造血干细胞移植能够提高MM的缓解率，生存期延长，但缓解遗留的微小残留病灶（MRD）依旧是MM复发的主要诱导因素，MRD的存在[6]让MM的复发成为可能。患者始终不能够通过以上治疗手段，阻止进入进展期和终末期。微小残留病（MRD）是多发性骨髓瘤患者经过治疗以后，获得完全缓解（CR）后体内残存的少量血液肿瘤细胞的状态，针对在这种微小残留病的检测需要使用流式细胞术来进行。很多患者认为在细胞形态学缓解以后，临床症状逐渐消失，就是病情得到控制的先兆，继而不再进行继续治疗，殊不知这样是非常危险的，多发性骨髓瘤的微小残留病灶是引发再次复发的罪魁祸首，其后果不堪设想。因此对于微小残留病灶的监测，在多发性骨髓瘤的治疗中至关重要，首先在临床上重视MRD检测的意义在于能够在早期预测到多发性骨髓瘤的复发，并且对于患者的治疗情况及预后进行判断，为MM临床治疗提供技术指导；其次在患者病情达到完全缓解以后，尽早的发现耐药的骨髓瘤细胞，能够促使医护人员提供更有效、更敏感的杀伤力临床治疗。随着流式细胞术近来的发展，通过流式细胞仪对MM患者骨髓细胞进行微小残留病灶动态监测，可为MM的诊断、治疗及预后提供重要的实验室依据。最后MRD的检测也能够对造血干细胞移植以后骨髓微环境给予评价。在多发性骨髓瘤的MRD检测中存在四种基本的检测方法，聚合酶链反应（PCR）、2 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第一章前言PET/CT、多参数流式细胞术（FCM）和荧光原位杂交技术。在MRD检测当中，PCR技术的检测是通过检测小分子微粒，单个分子被扩增几百万倍以后，对特意的基因顺序测定和分析。其特点是检测小分子微粒非常方便快捷，并且检测特意的基因可以不经过分子克隆，需要的组织样本量少，例如单根发丝、漱口水、干血等即可以进行分析。但在实际的多发性骨髓瘤的检测中，虽然其对MRD的检测的灵敏性较高，但该病中可控性检测的特殊分子标志较少，因此也大大的限制了PCR的检测效果。PET/CT是一种应用正电子作为放射示踪标记的核影像技术，能够将PET的功能性影响与CT的形态学评价结合在一起，来检测髓内外高代谢损害，并且能够精确的进行解剖学定位。PET/CT的敏感性极高，值得一提的是它能够区分有活性和无活性的病灶，能够更精确的显示出局灶性损害、潜在的非分泌MM细胞和骨髓腔外的活性病灶，对于检测治疗后的微小残留病灶意义重大，对多发性骨髓瘤患者的预后评估奠定了坚实的基础，但在实际应用中因检测价格较为昂贵，操作复杂，导致其应用范围较小。FISH技术是使用非放射性的荧光物质标记克隆化的基因或者是DNA片段，在与染色体DNA进行杂交以后，直接从染色体上观察杂交部位荧光信号的方法，来对细胞分裂中期和分裂间期进行观察，因它的敏感性仅为10e-2至10e-3，不能满足用于MRD检测，因此在临床上多使用FCM对多发性骨髓瘤进行检测。FCM多参数流式细胞术是目前多发性骨髓瘤MRD检测的主要手段，它是一种结合了生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体激光技术。作为一种结合了信息技术的高新技术，它能够使用高能量激光照射高速流动状态下的单细胞或者微粒，测量其散射光和发射荧光的强度，同时进行多个物理化学参数的检测，也因此成为了目前为止最为先进的细胞定性和定量分析技术。并且FCM可直接检测恶性浆细胞，[7][8]同时该技术还可以定量检测残留恶性浆细胞。FCM具备以下几个特点（1）所有的组织细胞都可以进行分析。（2）所用时间较短，方便快捷。（3）可同同时并列分析单个细胞的多方面特征，在较短时间内，就可以分析单个细胞中多个特征，检测的识别和计量结果更为准确。（4）能够定性定量的分析细胞。就目前的FCM检测技术来看，针对于多发性骨髓瘤的MRD检测原理是通过检测相关肿瘤细胞的免疫表型来确定种类和数量。国外有文献报道,对于多发性[9]骨髓瘤的MRD检测灵敏度很高，可达10e-4～10e-5。3 第一章前言微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义硼替佐米（万珂）是美国食品药物管理局（FDA）与2003年批准使用的治疗多发性骨髓瘤的靶向药物。它是人工合成的蛋白酶体抑制剂，可以有选择性的抑制蛋白[10]酶体，从而达到抑制泛素—蛋白酶体通路的目的。对通路的控制达到对多种蛋白质的降解。促进细胞对环境的应急反应，机体对化疗的敏感性由此增强，组织细胞凋亡就可以有效的遏制肿瘤的进一步增长。万珂在临床应用中与地塞米松有良好的协同作用，可以解决患者对其他药物的耐药性问题。针对多发性骨髓瘤的反应率可以达到30%~50%，其良好的治疗效果，使其成为了多发性骨髓瘤临床治疗中的主要药物。经研究证明，在临床治疗中，硼替佐米与其他药物联合治疗的效果较好，尤其与地塞米松的联合疗效提高较为明显。国外对万珂的治疗评价来源于2002年开始的研究，从2003年万珂获批可以治疗多发性骨髓瘤以后，2005年国际APEX实验小组就对万珂在多发性骨髓瘤的临床效果中进行了随机研究，结果万珂和地塞米松对MM的治疗有效率分别为48%和18%，[11]病例的生存率也是万珂组优于地塞米松组。由此得出了在多发性骨髓瘤的MRD水平确定后，万珂成为了联合治疗的首选药物，特别联合地塞米松可获得更好的疗效也得到了医疗界的认可，同时给予自体移植加入巩固维持治疗，得到更好疗效。因此选择怎样的治疗方案能够提高患者的生存率，不同的治疗方案对MRD水平是否存在影响也成为了讨论热点。4 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第二章资料与方法第二章资料与方法一、一般资料采用回顾性分析的方法针对2010年1月~2013年12月在我院接受治疗的44例多发性骨髓瘤患者,随访结束日期为2014年5月31日,中位随访时间为14个月,进行治疗效果及预后效果判断。其中男性25例，女性19例，随机分为两组，PD/PAD组22例，VAD组22例，其中一组用硼替佐米联合地塞米松（PD/PAD）进行治疗；另外一组则使用传统治疗方法长春新碱、阿霉素、地塞米松（VAD）进行治疗。所有患者均为初治患者，其中PD/PAD组男性病例共13例，女性病例9例，中位年龄为55岁。VAD组男性病例13例，女性病例9例，中位年龄为56.岁。其中ISS分期I期病例10例，II期病例17例，III期病例17例。分型主要有三种IgA型共15例，IgG型[12]共23例，轻链型共6例。本研究的患者均符合2012年NCCN指南中的诊断标准。基本临床资料见表1,及图1,2，两组在性别、年龄、分型以及分期等方面无显著差异示两组的一般资料经均衡性检验具有可比性。表表表1两组MM患者一般临床资料的比较临床资料PAD/PD组（n=22）VAD组（n=22）总体患者（N=44）P值性别（男/女）13/913/926/181.000中位年龄（岁）55(40~67)56(41~72)56(40~72)分型（例）0.139IgG14923IgA51015IgD000轻链型246ISS分期0.056Ⅰ2710Ⅱ8917Ⅲ10717肾功能A（Cr<176.8mmol/L）2116370.760B（Cr³176.8mmol/L）5275 第二章资料与方法微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义骨损害0.762³3处121123<3处101121血红蛋白（g/L）85（39~156）101（51~134）84（42~135）0.231血钙（mmol/L）2.15（1.72~2.91）2.22（1.71~2.48）2.18（1.71~2.91）0.725LDH161（71~663）178（106~891）167（71~891）0.503白蛋白（g/L）32.1（13~51）41（21.7~49.6）33.5（13~51）0.124血小板123（36~311）124（41~320）124（36~320）0.052b2-微球蛋白（mg/L）2.58（1.95~15.2）2.41（1.1~19）2.57（1.95~19）0.067注：P值PAD/PD组与VAD组两组之间比较；计量资料以中位数及范围表示。图1例多发性骨髓瘤中ISS分期构成情况图2例多发性骨髓瘤患者分型构成情况6 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第二章资料与方法二、实验方法1、、、病人标本的处理、病人标本的处理将肝素抗凝的新鲜骨髓液用pH7.2的无Ca2+、Mg2+PBS液作1:3稀释后，轻悬于淋巴细胞分离液上，1800rpm离心20min；吸取中间界面云雾层细胞，加5倍以上体积的PBS液，混匀，1296rpm离心10min，弃上清；加入10mlPBS液，混匀，1296rpm离心10min，弃上清。显微镜下计数细胞后，留取2×106个细胞进行流式细胞仪检测，剩余细胞用冻存液调整细胞密度为1´107/ml，于液氮长期保存。2、、、用、用用用流式细胞术流式细胞术FCM检测MRD采用活细胞直接免疫荧光标记的四参数流式细胞术(FCM9EPICS9XL型BeckmanCoulter，USA)，CD38/CD138/CD19/CD45或CD38/CD138/CD56/CD45标记，敏感度10e-4至10e-5,并运用EXPO32(BeckmanCoulter9USA)分析软件分析患者初次免疫表型结果，并对其进行定期MRD检测。3、、、FCM检测MRD分组标准流式4色（CD38/CD138/CD19/CD45或CD38/CD138/CD56/CD45）敏感度为10e-4至10e-5，故本研究中，根据检测结果，分为两组，检测值小于10e-3定义为低MRD组，而将检测值大于等于10e-3者定义为高MRD组，并且MRD<10e-5为MRD阴性。三、诊断标准及分期（（（一（一一一））））诊断标准诊断标准诊断标准依据张之南编著的《血液病诊断及疗效标准》第二版有关多发性骨髓瘤的诊断标准。（（（二（二二二））））诊断分期诊断分期7 第二章资料与方法微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义表2ISS分期标准分期分期标准I期血清β2微球蛋白＜3.5mg/L，白蛋白＞3.5g/dlII期I与III期之间III期血清β2微球蛋白＞5.5mg/L1.I期条件需要符合以下四项：血红蛋白＞100g/L；血钙正常；实验室影响检查无异常；M蛋白水平IgG＜50g/L，IgA＜30g/L，尿本一周氏蛋白＜4g/44h。2.II期条件介于I期与III期之间。3.III期条件为以下4项中的任何1项：血红蛋白＜85g/L；血钙＞2.98mmol/L；实验室影响检查发现有溶骨病变；M蛋白水平IgG＞70g/L，IgA＞50g/L，尿本一周氏蛋白＞12g/44h。四、治疗方法（（（一（一一一））））诱导组治疗方案诱导组治疗方案44例多发性骨髓瘤患者分为PD/PAD组和VAD组，PD/PAD组22例，VAD组22例，其中一组用硼替佐米+地塞米松±阿霉素（PD/PAD）进行治疗；另外一组则使用传统治疗方法长春新碱、阿霉素、地塞米松（VAD）进行治疗。硼替佐米的用法为d1、4、8、11均给予静脉推注硼替佐米0.8-1.3mg/m2,并且在d1~2,4~5，8~9，11~12给予地塞米松20mg静脉输液,，或阿霉素10mg/d。VAD组长春新碱0.5mg/d，阿霉素10mg/d，地塞米松10mg/d口服。三种药物在连用三天以后间歇4天为一个周期，3个周期为一个疗程。每例患者均要接受4个疗程的诱导治疗。（（（二（二二二））））移植组治疗方案移植组治疗方案44例多发性骨髓瘤患者中移植病例共17例。所有患者在取得部分缓解（PR）及以上疗效或进入平台期后进行造血干细胞移植。动员方案：患者采用HDCTX2-1（3~4g/m）+G-CSF（5~10mg/kg×d）2例患者在诱导化疗后单独应用G-CSF、2例患者因G-CSF动员采集失败后改用Plerixafor（AMD3100）联合G-CSF方案，连续+6采集1~3次。其中1例患者因两次外周血干细胞采集CD34细胞<1.0´10/kg而进行自+6身骨髓干细胞采集。采集的中位CD34细胞数为2´10/kg。诱导治疗分为PD/PAD组和VAD组，PD/PAD组12例，VAD组5例，其中一组使用硼替佐米+地塞米松±阿8 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第二章资料与方法霉素（PD/PAD）进行治疗；另外一组则使用传统治疗方法长春新碱、阿霉素、地塞米松（VAD）进行治疗。硼替佐米的用法为d1、4、8、11均给予静脉推注硼替佐米0.8-1.3mg/m2,并且在d1~2,4~5，8~9，11~12给予地塞米松20mg静脉输液。VAD组长春新碱0.5mg/d，阿霉素10mg/d，地塞米松10mg/d口服。三种药物在连用三天以后间歇4天为一个周期，3个周期为一个疗程。每例患者均要接受4个疗程的治疗。整体治疗定义为：移植前予以硼替佐米为主的方案进行诱导治疗，达缓解后巩固2~4次，行自体移植，移植后继续使用PD/PAD与VAD方案维持治疗。非移植组按照诱导组的治疗方案进行。五、疗效观察与随访（（（一（一一一））））MM治疗效果评价及不良反应判定根据国际骨髓瘤工作组的标准，治疗效果分为严格完全缓解（SCR），完全缓解（CR），非常好的部分缓解（VGPR），部分缓解（PR）和病情稳定（SD），疾病进展（PD），CR后复发，按照世界卫生组织（WHO）制定的标准来判断不良反应情况。根据国际骨髓瘤工作组的标准，治疗效果分为完全缓解（CR），非常好的部分缓解（VGPR），部分缓解（PR)和病情稳定（SD），SCR为接近完全缓解，患者符合游离轻链比例正常，免疫组化、免疫荧光正是骨髓中无单克隆浆细胞。CR为完全缓解，患者血清及尿中免疫固定电泳检测阴性，软组织未见浆细胞，骨髓浆细胞＜5%。VGPR为非常好的部分缓解，患者免疫固定电泳检出血清及尿中M蛋白，但常规电泳没有检测出M蛋白。血清中的M蛋白减少90%以上，尿中M蛋白＜100mg/24h。PR为部分缓解，患者血清M蛋白较少＞50%，且24小时内尿M蛋白减少＞90%或＜200mg/24h。SD为病情稳定，且患者各项指标不符合以上疾病进展标准。具体标准如下表3。9 第二章资料与方法微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义表3MM治疗效果评价分类标准符合游离轻链比例正常，免疫组化、免疫荧光正是骨髓中无单SCR严格完全缓解克隆浆细胞血清及尿中免疫固定电泳检测阴性，软组织未见浆细胞，骨髓CR完全缓解浆细胞≤5%。免疫固定电泳检出血清及尿中M蛋白，但常规电泳没有检测出VGPR非常好的部分缓解M蛋白。血清中的M蛋白减少90%以上，尿中M蛋白＜100mg/44h血清M蛋白较少＞50%，且44小时内尿M蛋白减少＞90%或PR部分缓解＜200mg/44h.SD疾病稳定不符合CR、VGPR、PR、PD标准者符合下面任何一项或者几项血清M蛋白增加≥25%或绝对值增加≥0.5g/dl尿M蛋白增加≥25%或绝对值增加≥200mg/44h若血尿M蛋白水平不可检测时：单克隆和非单克隆游离轻链水平之间的差异增加≥25%，绝对值应增加＞10mg/dlPD疾病进展骨髓浆细胞百分比绝对值增加≥10%出现新的骨病、软组织浆细胞瘤，或者现有骨病、软组织浆细胞瘤有明显增加状况由浆细胞瘤增殖造成的高钙血症出现以下任意一项：CR后用于研究重点是DFS免疫固定电泳和蛋白电泳又出现血清和尿M蛋白骨髓浆细胞复发时数目≥5%。出现新的浆细胞瘤、溶骨性病变、高钙血症（（（二（二二二））））疗效分析和总缓解率疗效分析和总缓解率疗效分析和总缓解率、疗效分析和总缓解率、、、复发标准复发标准国际骨髓瘤工作机对MM疾病进展及复发标准分为三类疾病进展、临床复发、完全缓解后复发三个阶段。其中临床复发的标准为基础值升高≥25%、血清M蛋白水平升高的绝对值达到0.5g/dL、24小时尿MN蛋白无法检出，轻链增长绝对值＞10mg/dL、骨髓浆细胞比例的绝对值至少达到10%、出现新的溶骨性病变或者软组织浆细胞瘤、现存骨病变、软组织浆细胞瘤增大、排除其他原因引起的高钙血症加重（校正血钙＞11.5mg/dL,或者2.65mmol/L）几项中的任意一项。临床复发为出现新的额溶骨性病变或者是软组织浆细胞瘤、现存骨病变或软组织浆细胞瘤增大＞50%（至少1CM、高钙血症11.5mg/dL,或者2.65mmol/L、血红蛋白下降≥2g/dL、血肌酐上升≥2mg/dL中的任意一项。完全缓解后复发则至少符合以下标准中的任意一项，免疫固定或者常规电泳检查血或尿M蛋白再次出现、骨髓浆细胞比例≥5%、疾病进展的任何指征之一。具体标准如下表4。10 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第二章资料与方法表4国际骨髓瘤工作组疾病进展及复发标准分类标准符合以下标准之一基础值升高≥25%血清M蛋白水平升高的绝对值达到0.5g/dL44小时尿MN蛋白无法检出，轻链增长绝对值＞10mg/dL疾病进展骨髓浆细胞比例的绝对值至少达到10%出现新的溶骨性病变或者软组织浆细胞瘤、现存骨病变、软组织浆细胞瘤增大排除其他原因引起的高钙血症加重（校正血钙＞11.5mg/dL,或者2.65mmol/L）符合以下条件之一出现新的额溶骨性病变或者是软组织浆细胞瘤现存股病变或软组织浆细胞瘤增大＞50%（至少1CM）临床复发高钙血症11.5mg/dL,或者2.65mmol/L血红蛋白下降≥2g/dL血肌酐上升≥2mg/dL至少符合以下条件之一免疫固定或者常规电泳检查血或尿M蛋白再次出现完全缓解后复发骨髓浆细胞比例≥5%疾病进展的任何指征之一（（（三（三三三））））MM诊断标准1.骨髓中浆细胞瘤或骨髓涂片检查，浆细胞＞10%，并有原浆或幼浆细胞，或者通过组织活检证实为浆细胞瘤。2.血清单克隆免疫球蛋白（M蛋白）：IgG＞35g/L；IgA＞20g/L；IgM＞15g/L；IgD＞2g/L；IgE＞2g/L，或尿中单克隆免疫球蛋白轻链（本周蛋白）K或者λ轻连＞1g/24小时，或血清游离轻链异常，排除淀粉样变。3.存在CRAB症状。符合上述所有三项者则判定为活动性MM。符合第1和第3项而缺少第2项者，属不分泌型MM，应注意除外骨髓转移癌，若有可能，应进一步鉴别属不合成亚型抑或合成而不分泌亚型。11 第二章资料与方法微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义（（（四（四四四））））临床表现临床表现患者初治疗时在体征和病程中均出现不同程度的感染、骨骼疼痛、出血、肾功能损伤、高粘滞血症、高钙血症、神经系统损害等情况。（（（五（五五五））））实验室检查项目实验室检查项目患者在治疗前后需要进行的实验室检查项目：血常规、血清蛋白电泳、免疫球蛋白定量、血白蛋白、β2、微球蛋白、血沉、肌酐、尿素氮、尿酸、血钙、尿常规、尿蛋白定量、尿本-周氏蛋白、尿轻链、骨髓象、X线、B超、MRI、ECT、骨髓病理检查等。（（（六（六六六））））预后评价与随访预后评价与随访44例患者随访结束日期为2014年5月31日，中位随访时间为16个月。生存时间（OS）的计算法是从确诊日期开始至随访结束或者是患者死亡日为结束。PFS定义为：自接受治疗和移植首次达最大疗效至疾病进展或复发的时间间隔，非移植组从诱导化疗后首次达最大疗效算起。分析内容单因素包括患者的一些临床指标：年龄、性别、细胞遗传学、ISS分期、疾病类型、肾功能、血清白蛋白、血红蛋白、血清钙；以及与之相关联的多因素分析。六、统计方法采用SPSS19.0医学软件进行统计学分析。描述性统计采用散点图、箱图、直方图及原图。计量资料呈非正态分布，用中位数描述，比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料比较采用Fisher确切概率法。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，单因素生存比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。12 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果第三章结果一、基本临床资料及生物学指标与不良预后因素分析44例患者的年龄、性别、血红蛋白、血小板、血清钙、血肌酐、骨髓浆细胞、血β2微球蛋白、白蛋白、LDH、不同分型一系列指标为基础计算患者的生存时间，在进行单因素分析以后发现血β2微球蛋白、血清钙浓度和白蛋白是影响患者预后生存的不良预后因素。表5基本临床资料及生物学指标与不良预后因素关系检测项目A组例数B组例数（OS）P值年龄≥65岁8＜65岁36P=0.699性别男25女19P=0.326血红蛋白男≥100g/L9＜100g/L16P=0.970女≥90g/L11＜90g/L8P=0.80899血小板≥100×10/L28＜100×10/L16P=0.403血清钙≥3mmol/L2＜3mmol/L22P=0.000血肌酐≥175umol/L7＜175umol/L37P=0.138骨髓浆细胞≥30%26＜30%18P=0.236血β2微球蛋白≥5.5mg/L8＜5.5mg/L36P=0.002白蛋白≥35g/L18＜35g/L26P=0.031LDH≥225U/L13＜225U/L31P=0.984分型：IgA+IgD12其他32P=0.585IgG21其他23P=0.648二、FMC检测结果分析本研究中，44例患者均为首次入院的初诊病人，在没有接受治疗的情况下对其免疫表型进行FMC检测，并得出初次免疫表型结果。44例患者依次完成两疗程及四疗程诱导治疗，其中17例患者在完成四疗程诱导后进一步采用移植方法对疗效进行维持巩固。根据相应的初诊免疫表型结果，对两疗程、四疗程以及移植后的MRD进行检测。结果显示：在44例患者中，诱导治疗两疗程后低MRD组为7人，低MRD率15.91%（7/44）；诱导治疗四疗程后低MRD组17人，低MRD率38.64%（17/44）；13 第三章结果微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义44例患者中有17例在完成四疗程诱导治疗后进一步采用移植方法进行维持巩固，并对移植后3个月的MRD进行检测，低MRD组为11人，低MRD率为64.71%（11/17）。结果可以看出，疗程增加低MRD率较明显提高。三、疗程对MRD水平的影响本研究中，将44例多发性骨髓瘤初治患者分为PD/PAD组和VAD组，其中PD/PAD组22例，VAD组22例，所有病例均完成4个疗程。用FCM检测初治患者的免疫表型，并根据初治免疫表型对诱导治疗两个疗程及四个疗程后MRD水平的监测，结果显示：初治患者免疫表型中位值为12.6%，两个疗程及四个疗程的中位MRD值分别为1.5*10e-3、2.9*10e-4，见图3,4，从图中可以看出，随着疗程数的增加，各疗程的中位值明显下降，得出结论，疗程增加MRD水平明显下降。图3MRD与疗程关系及分布注:1表示初次免疫表型;2表示二疗程;3.表示四疗程14 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果图4MRD与疗程关系及分布四、疗程对疗效的影响本研究中，PD/PAD组及VAD组所有病例均完成四个疗程，在两个疗程和四个疗程结束时对病例进行疗效评价。两个疗程以后初治组CR+VGPR+PR=32例，治疗有效率达到72.37%。四个疗程以后初治组CR+VGPR+PR=37例，治疗有效率达到284.09%。利用X2进行检验统计以后，X=0.275,P=0.073(P＞0.05)，差异无统计学意义。结果显示：4疗程的有效率为84.09%，2疗程的有效率72.37%，虽然P＞0.05，无统计学意义，但随疗程增加，患者的有效率较前增高。表6疗程与疗效的关系变量例数CRVGPRPRSDPDCR复发有效率两疗程44231865672.73%四疗程44262952684.09%五、疗程对低MRD率的影响本次研究的44个病例，用FCM检测经过诱导治疗两个疗程及四个疗程后MRD的结果分析，低MRD（MRD<10e-3）病例数分别为7例、37例，高MRD（MRD≥10e-3）,病例数分别为17例、27例，从两组结果对比发现，四个疗程比两个疗程更15 第三章结果微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义能获得低MRD率，并且两组之间存在统计学意义（P<0.05）。表7疗程与低MRD率的关系变量低MRD例数高MRD例数低MRD率卡方值P值两疗程73720.59%5.7290.017四疗程172738.64%六、MRD水平对OS及PFS的影响1、两疗程后MRD水平对OS及PFS的影响1.1在本次研究中，对44个病人进行诱导治疗，对低MRD组与高MRD组OS时间比较，其中低MRD组7人，高MRD组37人，低MRD组OS时间尚未出现，高MRD组中位OS时间30个月，从图5中可以看出，进行2个疗程的诱导治疗以后，低MRD组的中位OS时间比高MRD组延长，虽然P值大于0.05，可能为随访时间太短。P=0.117，差异无统计学意义.见图5图5两疗程后OS时间比较注：MRD-：低MRD，MRD+：高MRD。1.2在本次研究中，对44个病人进行诱导治疗，对低MRD组与高MRD组PFS时间比较，其中低MRD7人，高MRD组37人，低MRD组PFS时间尚未出现，高MRD组中位PFS时间23个月，从结果中可以看出，进行2个疗程的诱导治疗以后，16 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果低MRD组的中位PFS时间比高MRD组延长，虽然P值大于0.05，可能为随访时间太短。P=0.198，差异无统计学意义。见图6图6两疗程后PFS时间比较2、四疗程后MRD水平对OS及PFS的影响2.1在本次研究中，对44个病人进行诱导治疗，对低MRD与高MRD组OS时间比较，其中低MRD17人，高MRD27人，低MRD的OS时间尚未出现，高MRD中位OS时间28个月，从图7中可以看出，进行4个疗程的诱导治疗以后，使低MRD患者的OS明显延长，P=0.011，差异有统计学意义。见图717 第三章结果微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义图7四疗程OS时间比较2.2在本次研究中，对44个病人进行诱导治疗，对低MRD组与高MRD组PFS时间比较，其中低MRD组17人，高MRD组27人，低MRD组PFS时间尚未出现，高MRD组中位PFS时间23个月，从图8中可以看出，进行4个疗程的诱导治疗以后，低MRD患者的PFS明显延长，P=0.035，差异有统计学意义。18 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果图8四疗程PFS时间比较综上结果显示，不管两疗程还是四个疗程诱导，低MRD组均能使患者生存时间及无病生存时间比高MRD组明显延长，并且四疗程后,两组之间存在差异，故MRD水平随着疗程的深入可预测患者OS及PFS，即MRD对预后有重要的评估价值。七、MRD水平对CR率的影响本次研究的44个病例，所有病例均完成四个疗程，在两疗程和四疗程时对本组病例进行缓解率评价。两个疗程以后，低MRD组7例病人中有5个病人达CR，缓解率为71.42%，高MRD组37例病人中有20个病人达CR，缓解率为54.05%，利用X2进行检验统计以后，P值为0.092（P＞0.05），各组之间无明显统计学意义；四个疗程以后，低MRD组17例病人中有13个病人达CR，缓解率为76.47%，高MRD组27例病人中有11个病人达CR，缓解率为40.74%，利用X2进行检验统计以后，P值为0.218（P＞0.05），两组之间存在统计学差异。从图表中得出，随着疗程的延长，低MRD的CR率较前增加，虽然P均大于0.05，可能跟患者随访时间较短，故得出MRD对判断疗效有主要的评估价值，见表8,9。19 第三章结果微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义表82个疗程低MRD组及高MRD组CR率变量例数CR数CR率卡方值P值低MRD组7571.42%0.0100.092高MRD组372054.05%表94个疗程低MRD组及高MRD组CR率变量例数CR数CR率卡方值P值低MRD组171376.47%1.5190.218高MRD组271140.74%八、MRD水平与治疗方案的关系本次研究的44个病例，分为PD/PAD组和VAD组，各为22例病人，各组病人均为初治病人，所有病例均完成4个疗程，在2疗程和4疗程后对不同方案中低MRD率进行比较。PD/PAD组中，两个疗程以后低MRD组有4例病人，高MRD组有18人，VAD组中低MRD人数为3人，高MRD人数为19人，低MRD率分别为18.18%和13.64%。利用X2进行检验统计以后，P=1(P＞0.05)，差异无统计学意义。四个疗程以后低MRD组有12例病人，高MRD组有10人，VAD组中低MRD人数为5人，高MRD人数为17人，低MRD率分别为54.55%和22.73%。利用X2进行检验统计以后，P=0.03(P<0.05)，差异有统计学意义。从结果中得出，含有硼替佐米组，随着疗程延长，低MRD率明显提高，即MRD对治疗方案的选择有重要的评估价值。见表10表10二个疗程后不同治疗方案组中的低MRD率变量低MRD例数高MRD例数低MRD率卡方值P值PAD/PD组41818.18%0.0001.000VAD组31913.64%20 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果表11四个疗程后不同治疗方案组中的低MRD率变量低MRD例数高MRD例数低MRD率卡方值P值PAD/PD组121054.55%4.6970.030VAD组51722.73%九、移植对MRD水平及预后的影响1、移植对MRD水平的影响本次研究44例多发性骨髓瘤患者，有17例病人经过4个疗程的诱导治疗后进入移植维持治疗，移植前用FCM检测初治免疫表型及两个疗程及四个疗程的MRD，并患者移植3个月患者MRD水平监测，结果示初治患者免疫表型中位值12.4%，两个疗程、四个疗程及移植后的中位MRD为2.5*10e-3、3.8*10e-4及4.0*10e-5，见图9,10，从图中可以看出，随着疗程数增加及移植维持治疗的选择，患者MRD水平明显降低，并且得出移植组MRD阴性人数明显增高。图9移植组MRD水平与疗程相关变化趋势21 第三章结果微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义图10移植组MRD水平与疗程相关变化趋势2、移植对低MRD率的影响本次研究的44个病例，有17例病人经过4个疗程的诱导治疗后进入移植，其中两个疗程以后低MRD组为2人，高MRD组15人，低MRD率为11.76%。四个疗程以后低MRD组为7人，高MRD组10人，低MRD率为41.17%，移植后，低MRD组为11人，高MRD组6人，低MRD率为64.71%。利用X2进行检验统计以后，P=0.008(P<0.05)，差异有统计学意义。从结果中显示：进行移植维持治疗后可对低MRD率明显提高，得出选择移植进行维持治疗可以降低MRD水平。表12移植前后不同疗程组中的低MRD率变量低MRD例数高MRD例数低MRD率卡方值P值两疗程21511.76%四疗程71041.17%10.0350.008移植后11664.71%3、移植对PFS及OS的影响本次研究的44个病例，其中有17例病人经过4个疗程的诱导治疗后进入移植维持治疗，未采用移植治疗的27例，移植组中位PFS、OS时间均未出现，非移植组中位OS、PFS分别为28个月、23个月，两组对比P值分别为0.495、0.122,差异均无22 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果统计学意义（P＞0.05）。从结果中可以看出，诱导治疗结束后采用移植进行维持治疗的患者中位OS及PFS明显延长，虽然P值均大于0.05，可能为随访时间太短，病例数少有关。见图11（P=0.495）、图12（P=0.122）。图11移植组与非移植组OS时间比较图12移植组与非移植组PFS时间比较23 第三章结果微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义十、诱导治疗对PFS及OS的影响本次研究的44个病例，分为PD/PAD组和VAD组，各为22例病人，各组病人均为初治病人，前者中位PFS、OS时间均未出现，可能跟随访时间有关；后者中位OS时间17个月，中位PFS时间未出现，两组对比P值分别为0.006、0.000，差异均有统计学意义,从结果可以看出，含硼替佐米进行诱导治疗以后比传统治疗组中的患者的OS时间明显延长,PFS时间可能延长。见图13（P=0.000）、图（P=0.006），差异均有统计学意义（P＜0.05）。图13PAD/PD组与VAD组OS时间比较24 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第三章结果图14PAD/PD组与VAD组PFS时间比较25 第四章讨论微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第四章讨论多发性骨髓瘤是血液系统恶性疾病中占比10%的肿瘤疾病，由于患者体内的浆细[13]胞恶性克隆增殖导致的无法治愈类型疾病。目前MM的治疗取得了明显的进展，主要体现在大剂量化疗联合ASCT以及新型靶向药物如硼替佐米及来那度胺的临床[14]应用，中位生存期明显延长，特别是年轻患者。多个前瞻性随机对照研究结果均显示大剂量化疗联合ASCT治疗65岁以下MM患者，以及新药的加入，无论是CR率，[15-17]还是PFS和OS均显著优于传统的常规化疗。多发性骨髓瘤经过诱导化疗以后已经获得完全缓解，或者是经过移植治疗以后完全缓解，体内仍旧存在少量的骨髓瘤细胞的状态。多发性骨髓瘤在初治时的骨髓瘤细1210胞总数约为10，经过化疗诱导治疗后完全缓解以后，可以下降到10。这种情况下使用一般形态学的方法已经很难检测出肿瘤细胞的存在，只有依靠FCM、PCR、FISH等检测方法来检测骨髓内是否还存在骨髓瘤细胞，这些被检测出来的骨髓瘤细胞就是[18][19]导致多发性骨髓瘤复发的重要原因。故选择MRD作为预后指标对疾病的状态、疗效的平底、预测复发及早期干预有重要的临床意义。本研究采用回顾性分析的方法针对2010年1月~2013年12月在我院接受治疗的44例初诊多发性骨髓瘤患者进行治疗效果及预后效果判断。其中男性14例，女性10例,分为两组，PD/PAD组22例，VAD组22例，PD/PAD组使用硼替佐米+地塞米松±阿霉素（PD/PAD）进行治疗；VAD组则使用传统治疗方法长春新碱、阿霉素、地塞米松（VAD）进行治疗。根据患者初次免疫表型结果并对其二个疗程、四个疗程及移植后3个月的MRD进行检测。根据MRD检测结果，分为两组，即低MRD和高MRD两组，其中分组标准定义为低MRD组（MRD<10e-3），高MRD组（MRD≥10e-3）。随着新一代化疗药物的研制，以及造血干细胞移植技术的不断完善和发展，多发性骨髓瘤的患者生存时间已经有了明显的延长，但多发性骨髓瘤的复发已经成为提高[20-22]治疗和改善预后的关键因素。国内外对白血病预后方面多项研究证明MRD水平与患者的复发及预后有直接的相关性，它是造成多发性骨髓瘤的复发的直接原因，是已经获得完全缓解的患者体内依旧存在微小残留病（MRD）。26 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第四章讨论本次研究中，统计出初治患者免疫表型中位值为12.6*10e-2，两个疗程及四个疗程的中位MRD值分别为1.5*10e-3、2.9*10e-4，行移植治疗后3个月的MRD给中位值为4.0*10e-5,疗程的深入，MRD水平明显下降,但化疗后仍有高MRD存在。并且PD/PAD组和VAD组所有病例均完成四个疗程，在两个疗程和四个疗程结束时对病例进行疗效评价。得出两疗程的有效率72.73%，四疗程的有效率为84.09%，得出随疗程增加，患者的有效率较前增高。结合以上两次结果分析，可以看出已经获得完全缓解的患者体内依旧存在微小残留病（MRD），它可能会造成多发性骨髓瘤的复发的直接原因，本次研究结果跟国内外研究结果一致。多参数流式细胞术(FCM)是目前多发性骨髓瘤MRD检测的主要手段，它是一种结合了生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体激光技术。他可根据浆细胞表[23-26]面免疫表型可鉴别正常浆细胞、反应性浆细胞和克隆性浆细胞,并能在较短时间内，就可以分析单个细胞中多个特征，检测的识别和计量结果更为准确，并能够定性定量的分析细胞。就目前的FCM检测技术来看，针对于多发性骨髓瘤的MRD检测原理是通过检测相关肿瘤细胞的免疫表型来确定种类和数量，对于多发性骨髓瘤的MRD检测灵敏度很高，可达10e-4～10e-5。虽然骨髓瘤细胞来源于B细胞，但几乎不表达正常B细胞抗原，大部分MM患者的免疫表型为：CD38强阳性、CD138阳性，并且CD38／CD138的共表达，[27]CD56阳性，CD45阴性／弱阳性，CD19阴性。19世纪末，Benjamin等人首先报告CD56在骨髓瘤细胞的表达，在正常成熟浆细胞上几乎不表达，但在MM细[28][29]胞中表达率较高；故目前检测中把CD56和CD19作为区分良恶性浆细胞的重要标记，并应用于临床；CD45，为白细胞共同抗原，几乎所有的造血细胞中均有表达，除了成熟红细胞和血小板以外，在淋巴细胞的发育激活中有重要的作用，在浆细胞表面高度表达，而在MM细胞中呈阴性或弱阳性表达。AdamC4等人发现，有相当比例的MM病人可监测到CD45高强度表达，故需要结合CD138或CD38设门来提高检测的精确性。骨髓瘤协会组推荐MM检测至少要用CD38、CD138、CD45中其中的一种抗体来识别浆细胞。[30]初诊设浆细胞门要基于CD38／CD138的共表达，Almeida等采取CD38／SSC和CD138／ssc双设门的方法，对61例MM患者进行DNA分析及免疫表型测定，并且检测残留的骨髓瘤细胞，同时进行DNA含量及免疫表型检测，95%的MM患27 第四章讨论微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义者可见异常表型或DNA异倍体胞。FCM检测的MRD检测敏感度可达10e-4～10e-5。故本研究实验室，采用四色（CD38/CD138/CD19/CD45或CD38/CD138/CD56/CD45）多参数流式细胞术，检测44位初治患者免疫表型，并对其进行定期MRD监测，结[31-33]果与文献报道相近。[34]SanMiguelJF等人通过分析多例初诊MM的病人，以诱导治疗后MRD水平将其危险度分两类：危险度低(MRD<10e-3)，高危险度(MRD≥10e-3)。结合本研究中，使用四色流式细胞术（FCM）检测我院血液研究中心治疗44名多发性骨髓瘤患者的初次免疫表型并对其二个疗程、四个疗程及移植后三个月的MRD进行检测。根据MRD检测结果，又将其分为2组，即低MRD和高MRD两组，其中分组标准定义为低MRD组[34]（MRD<10e-3），高MRD组（MRD≥10e-3）。分组标准与相符合。本研究中得出，[35]MRD灵敏度达10e-4,而传统的细胞形态学仅为10e-2,故用FCM对MRD的检测比传统的细胞形态学、本周氏蛋白等预后指标更为敏感，国外有研究表明，流式细胞术检[36]测骨髓瘤浆细胞及动态监测MRD比传统的检测评估提供了更多的信息。对MM患者来说采用流式细胞术（FCM）行MRD的检测对疾病发展、治疗、预后和危险分级有重要指导意义。目前，已有相关证据表明，若将MRD监测作为危险[37]度分层的标准之一，对完全缓解后的远期治疗会产生更深远的意义。[38]Kem等人曾提出增加多发性骨髓瘤分子诊断CR标准，以MRD检测作为MM缓解和治愈的标准。多项研究已表明，MM治疗后骨髓MRD水平CR率的影响有直接的相关性。本次研究结果显示，①两个疗程以后，低MRD组7例病人中有5个病人达CR，缓解率为71.42%，高MRD组37例病人中有20个病人达CR，缓解率为54.05%，P值为0.092（P＞0.05），两组之间无统计学差异；②四个疗程以后，低MRD组17例病人中有13个病人达CR，缓解率为76.47%，高MRD组27例病人中有11个病人达CR，缓解率为40.74%，P值为0.218（P＞0.05），两组无统计学差异。从结果①②中得出，随着疗程的延长，低MRD的CR率较前增加，虽然P均大于0.05，可能跟患者随访时间较短，样本小有关，故需大样本、长时间的随访研究进一步证实。本次研究结果，与国内外的报道一致，故得出MRD对判断疗效仍有重要的评估价值。多发性骨髓瘤在经过诱导治疗以后，MRD水平是否能够下降到10^-4以下对于[39]患者是否能够长期生存具有重要意义。结合本次研究中，MRD水平对OS及PFS的影响，结果显示：①两个疗程的诱导治疗以后，低MRD组中位OS及PFS均尚未28 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第四章讨论出现,，低MRD组的中位OS及PFS比高MRD组延长，虽然P值P=0.117(＞0.05)，可能为随访时间太短。②四个疗程的诱导治疗以后，低MRD的OS及PFS时间尚未出现，高MRD中位OS时间28个月，中位PFS时间23个月，故低MRD患者的生存时间明显延长，P=0.011（＜0.05），差异有统计学意义。综上结果①②显示，不管两个疗程还是四个疗程的诱导治疗，低MRD组均能使患者生存时间及无病生存时间比高MRD组明显延长，故MRD对预后有重要的评估价值，符合国内外报道，即MRD水平是否能够下降到10^-4以下对于患者是否能够长期生存有着重要意义。[40]Dworzak等很早就在急性白血病方面研究治疗以后MRD水平是否能降到10^-4以下对患者是否长期生存具有重要的意义。并且得出MRD比传统的形态学指标预测疾病的复发更为敏感。骨髓瘤的复发是由多种因素导致的，治疗骨髓瘤的药物耐药性低，骨髓瘤细胞增[41]殖速度快是其主要原因。因此在多发性骨髓瘤的临床治疗药物选择上，需考虑该药物具备以下特征：首先是能够克服药物的耐药性，另外是能够减缓或者是抑制肿瘤细胞的增殖。只有考虑到以上两点，才能够在多发性骨髓瘤的临床治疗当中有较好的治疗效果。针对以上内容一些现有的研究已经能够证明硼替佐米对于多发性骨髓瘤的治疗过程中，能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖，而且能够有较好的耐药性，因此在2003年美国食品和药品管理局已经批准硼替佐米作为治疗多发性骨髓瘤患者的新型靶向治疗药物。[42]Hideshima等研究表明，硼替佐米作用于骨髓瘤细胞后，可出现IL-6受体的β链，剂量及时间呈依赖性的下降，最终使多发性骨髓瘤细胞对IL-6的反应性降低，[43]抑制与之相关的生长，存活。Landowski等研究认为,硼替佐米的细胞毒作用是通2+过线粒体介导的细胞内Ca失调，继而特异性的激活凋亡蛋白酶caspase-12等引起的。结合本次研究的44个病例，分为PD/PAD组和VAD组，评估MRD水平与治疗方案的关系，结果显示：①PD/PAD组与VAD组比较，两个疗程以后低MRD率分别为18.18%和13.64%。P=1.00(P＞0.05)，差异无统计学意义。②PD/PAD组与VAD组比较，四个疗程以后，低MRD率分别为59.09%和22.72%，P=0.03(P<0.05)，差异有统计学意义。得出，含有硼替佐米的PAD/PD组，随着疗程数的延长，低MRD率明显提高，即MRD对治疗方案的选择有重要的价值。并且分析两组的预后，得出前者中位PFS、OS时间均未出现，可能跟随访时间短以及病例数少有关，后者中位OS29 第四章讨论微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义时间17个月，中位PFS时间未出现，两组对比P值分别为0.006、0.000，差异均有统计学意义，得出经硼替佐米进行诱导治疗以后比传统治疗组中的患者的OS时间明显延长,PFS时间可能延长。由此可以看出使用PD或PAD进行治疗后，虽然不能够完全治愈疾病，但是可以有效的降低MRD水平，获得更长生存时间。这提示早期应该使用硼替佐米联合化疗方案，最大程度地降低患者体内肿瘤负荷，使完全缓解早期低MRD率明显升高。为进一步比较ASCT对患者预后及MRD水平的影响，本研究中，本组44病例中已行四个疗程诱导治疗结束以后，使用ASCT移植维持治疗的病例一共17例，结果示初治患者免疫表型中位值12.4*10e-2，两个疗程、四个疗程及移植后的中位MRD为2.5*10e-3、3.8*10e-4及4.0*10e-5，得出随着疗程数增加及移植维持治疗的选择，患者的MRD水平明显降低。并且在移植的17人中，2个疗程、4个疗程及移植后3个月的低MRD率分别为11.76%、41.17%、64.71%。P=0.008(P<0.05)，差异有统计学意义。得出，进行移植维持巩固治疗后低MRD率明显提高，得出选择移植进行维持治疗可以降低MRD水平。Barlogie等人首次报道TT2研究结果时观察到维持治疗加入ASCT后CR率的获益和PFS时间的延长，但未发现OS时间的延长，然而中位随访时间延长至72个月时发现，OS与CR率之间存在一定的相关性，尤其伴有细胞遗传学异常的患者中更[44][45]具有统计学意义。即使ASCT与OS无明显相关性，PFS时间的延长对提高患[46]者的生活质量也具有非常重要的意义。本次研究结果示：移植组中位OS、PFS时间均未出现，非移植组中位OS、PFS分别为28个月、23个月，两组对比P值分别为0.495、0.122，差异均无统计学意义。从结果中可以看出，诱导治疗结束后采用移植进行维持治疗的患者PFS明显延长，虽然P值均大于0.05，可能为随访时间太短，病例数太少，需我们更多行临床资料的收集。本研究中心，在对临床资料及生物学指标与不良预后关系时，对患者年龄、性别、血红蛋白、血小板、血清钙、血肌酐、骨髓浆细胞、血β2微球蛋白、白蛋白、LDH、不同分型一系列指标为基础计算患者的生存时间，在进行单因素分析以后发现血β2微球蛋白≥5.5mg/L、血清钙浓度≥3mmol/L及白蛋白＜35g/L是影响患者预后生存期的主要不良预后因素，特别为β2微球蛋白，它对疾病的预后有重要的评估价值。（P30 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第四章讨论[47]＜0.05）。本次研究中发现：MRD水平可预测OS及PFS，并对评估疾病的状态、疗效的判断、预测复发及早期干预有重要的临床意义.。.采用四色流式术（FMC）检测患者MRD敏感度高（10e-4至10e-5），故比传统的细胞形态学、本周氏蛋白等预后指标预测疾病的复发更敏感。.新型靶向药物硼替佐米进行诱导治疗多发性骨髓瘤，其效果明显，且低MRD病人明显增多，延长患者的PFS及OS，对改善预后具有重要意义。选择ASCT进行维持治疗，可以降低MRD水平，可能延长患者的PFS及OS.。总之，FCM检测多发性骨髓瘤CR后的MRD虽然差异明显，但因灵敏度较高，可提前预测复发等优点，而且治疗随疗程的延长，行MRD检测价值似乎更大，可以作为评价预后的一项重要指标，对患者提供了有力的个体化治疗的依据，因此MRD具有重要的临床应用价值。但是，我们也要认识到，由于各实验室检测MRD时所选择的抗体不同以及检测技术的差异，仍需要进行大量的研究，并行统一规范以及统一的MRD的检测标准。近年来，检测新技术广泛应用，关于MM的基因和染色体方面的研究较多，随着了解逐渐的深人，有利于阐明MM发病机制从而制订出更为优化[48]的相应治疗方案。31 第五章结论微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义第五章结论1.在本研究中，无论是PD/PAD组还是VAD组，四个疗程以后，更能获得低MRD的水平，并且对比两个疗程之后两组之间存在的差异，得出四个疗程后低MRD组生存时间明显延长，故MRD水平可预测患者OS及PFS，并对评估疾病状态、判断疗效、预测复发及早期干预有重要的临床意义。2.PD/PAD组与VAD组相比，PAD组在四个疗程之后，低MRD率明显增高，并且得到更长的生存时间。故MRD比传统的细胞形态学、本周氏蛋白等预后指标预测疾病的复发更敏感，并且MRD可作为影响患者预后生存期的不良预后因素。3.进行移植维持巩固治疗与诱导治疗相比，能够获得更多的低MRD率，并且从中位值上得出移植组MRD为阴性的人数明显增加，以及对比生存时间，移植会延长患者的PFS及OS。4.新型靶向药物硼替佐米联合化疗进行诱导治疗多发性骨髓瘤，其效果明显，特别低MRD组病人可明显延长患者的PFS及OS，对改善预后具有重要意义。32 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综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展陈中磊综述傅琤琤审校血液系统包括多种细胞成分，这些细胞均来源于造血干细胞.造血干细胞在分化、发育、成熟的过程中，细胞膜、细胞浆或细胞核抗原的出现，表达增多与减少甚至消失均与细胞的发育阶段密切相关，并表现出与细胞系列及其分化程度相关的特性抗原，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。FCM技术可以应用在单克隆抗体血细胞的表面或胞内抗原，具有敏感性高、信息量大等优势，以及准确的反应肿瘤的负荷及来源，某些特异性抗原的表达有助于研究疾病的进展和判断预后，故FCM在血液疾病的诊断、鉴别诊断以及疗效检测方面有着非常重要的价值，现就流式细胞术在某些血液病检测中的应用及目前研究进展作一综述。1.流式细胞术原理FCM多参数流式细胞术，它是一种结合了生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体激光技术。作为一种结合了信息技术的高新技术，能够使用高能量激光照射高速流动状态下的单细胞或者微粒，测量其散射光和发射荧光的强度，同时进行多个物理化学参数的检测，也因此成为了目前为止最为先进的细胞定性和定量分析技术。它为生物医学与临床检验学的发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。2.FCM在多发性骨髓瘤方面的应用及研究进展多发性骨髓瘤是血液系统恶性疾病中占比10%的肿瘤疾病，由于患者体内的浆细[1]胞恶性克隆增殖导致的无法治愈类型疾病。该疾病经过诱导化疗以后已经完全缓解，或者是经过移植治疗以后完全缓解，体内仍旧存在少量的骨髓瘤细胞的状态。多12发性骨髓瘤在初治时的骨髓瘤细胞总数约10，经过化疗诱导治疗后完全缓解以后，10可以下降到10。这种情况下使用一般形态学的方法已经很难检测出肿瘤细胞的存在，只有依靠FCM、PCR、FISH等检测方法来检测骨髓内是否还存在骨髓瘤细胞，[2][3]这些被检测出来的骨髓瘤细胞就是导致多发性骨髓瘤复发的重要原因。由于该病中可控性检测的特殊分子标志较少，因此也大大的限制了PCR的检测效果，此外FISH的敏感性仅为10e-2至10e-3，不能满足用于MRD检测，因此在临床上多使用FCM对多发性骨髓瘤进行检测。就目前的FCM检测技术来看，针对于38 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展多发性骨髓瘤的MRD检测原理是通过检测相关肿瘤细胞的免疫表型来确定种类和数量。国外有文献报道,对于多发性骨髓瘤的MRD检测灵敏度很高，可达10e-4～[4]10e-5。[5]关于何时进行MRD检测能更好地预测复发及评价预后仍存在议,SanMiguelJF认为诱导化疗后的MRD检测对预后有重要意义，诱导和巩固治疗后的MRD均与患者的无病生存(PFS)相关，但总生存率(OS)只和深入诱导后MRD水平相关。然而得到[6]大部分学者认可的是Venditti等人的研究，认为巩固治疗后MRD的检测更有意义。这可能是随着治疗时间的延长，治疗强度的加入，患者得到了分子生物学的缓解，故MRD检测比传统的检测能更好地预测复发及评价预后，患者能够获益更多。通过流式细胞术对细胞进行免疫表型分析，具有快速、准确、简便、客观、敏感等优点，目前已经得到广泛运用，在MM的诊断及鉴别诊断、预后判断、MRD的监测等方面，有着不可忽视的价值。然而MM细胞的免疫表型进行分析，可以从是否髓外浸润、耐药、复发、转归等多个方面来对MM患者的预后进行全面评估，有着极为广阔的应用前景。[7]首先CD20作为一种新的MM免疫治疗靶点已被许多学者关注。KapoorP等人用美罗华治疗CD20表达阳性的骨髓瘤病人，有10％的CD20阳性表达患者对美罗华有效，另外有50％～57％的CD20表达阳性患者可获得1O～27个月的病情控制。目前美罗华作为CD20阳性骨髓瘤的靶向治疗药物已经越来越多的人所认识和接受，但仍[8]需大规模的临床资料证实其效果。HayashiT等研究显示，抗CD40抗体(rhuCIMOmAb)引起了CD40阳性的骨髓瘤细胞的ADCC效应，预想在未来的临床治疗中可以帮助改善CD40表达阳性MM患者的预后。除了上述CD20、CD40外，还有CD38、CD138、CD54、CD117、CD33等也逐渐被越来越多的被学者关注，其单抗有可能在未来作为多发性骨髓瘤靶向治疗药物应用于临床。3.FCM在白血病方面的应用及研究进展由于进行流式细胞术和定量PCR在分子或免疫表型检测中具有高敏感性等优点，使得此两种方法成为目前最常用于MRD监测的两种方法。但目前来说，只有少部分[9-11]AML具有白血病特异融合基因和抗原受体基因重排(小于50％)，从而限制了PCR在AML中MRD检测的广泛应用。相比较之下，MFC可以在10000个正常骨髓(BM)细胞中检测到一个白血病细胞，不但敏感性高且可以应用到75％～85％的AML病人中39 综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义[12-14]去。近期研究显示MFC作为一种更全面的检测方法，已经可以用于大于90％以上的AML的免疫表型监测。不难看出，FCM在AML的MRD监测中作用越来越显著。目前由于实验室应用抗体组合的不同和新试剂的投入运用，使得MRD的抗体组合标准化未能达成一致。因此，欧洲白血病网络(ELN)正制定出标准化不同血液系别的抗体方向。[15]SanMiguelJ．F．16研究得出最常见的不同步抗体组合为CD117／CD33／HLA—DR(34％)和CD34CD117／CD33／HLA—DR一(21％)；在跨系表达中有CD2表达17％，CD7表达9％，CD22表达2％；4％的患者中发现HLA-DR和CD34呈现[16]过表达；WolfgangKern等研究发现LAIP阳性的骨髓细胞平均占19．07％，而正常[17]骨髓标本中对应的百分比为0．05％；VHJvanderVelden8等检测儿童AML患者的MRD得出包括跨系抗原表达(如CD2，CD7，CD56)占80％；抗原的表达呈强阳性[15]或阴性。SanMiguelJ．F．16等研究发现诱导治疗后MRD≥0．5％的病人复发频率较高(67％)，而小于此值的复发频率仅20％(P＜0.05)。同样的，这些病人的RFS也相对较短(P=0．01)。强化治疗后，用0．2％的残留白血病细胞将病人分为两组，复发率分别为69％和32％(P＜0.05)；该两组病人RFS也短(P=0．04)。诱导后MRD≥0．5％[18]和强化后MRD>10．2％与短的OS也相关。BuccisanoF11等人研究，并将3．5x[15]10e-4作为MRD阴性及阳性的阈值。SanMiguelJF16等人将其危险度分为4类：(1)极低危组(<10e-4个细胞)，(2)低危组(10e-3至10e-4个细胞)，(3)中危组(10e-3～10e-2个细胞)，和(4)高危险组(>10e-2个细胞)。由此可见，MRD的检测对白血病患者的疾病发展、治疗、预后和危险分级的起到重要的作用。4.FCM在骨髓增生异常综合症以及AA方面的应用及研究进展目前诊断MDS主要依赖外周血象、骨髓细胞形态学加活检、病理、细胞遗传学及分子遗传学等检查方法，尽管目前诊断标准已经确定，但仍有相当多的病例不能通过传统的检查确诊，如骨髓抽吸时血稀或骨髓纤维化均易影响形态学的判断，尽管细胞遗传学的改变对于MDS的诊断及预后也有重要的临床指导意义，但是异常染色体[19]核型的检出率较低，仅为4O%～6O%，因此，有必要寻找更为客观而特异的诊断和鉴别诊断方法。MDS患者骨髓细胞表面抗原在整个疾病过程中的表达范围和强度均发生改变，有文献表明，髓系细胞异常免疫表型可出现于病态造血之前，且其异常程度与病态造40 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展血严重程度密切相关。Stetler-Stevenson等检测了45例MDS患者骨髓的红系、巨核系和髓系的病态造血征，结果表明流式细胞仪可以检测到髓系高于红系的病态造血。认为，髓系的流式细胞术免疫表型分析比形态学检测敏感，是MDS研究领域一个不容忽视的检测方法。由于MDS和AA均可以表现为外周全血细胞减低，可有或无骨髓病态造血，两者在临床上鉴别相当困难，尤其是部分RA病态造血不典型或伴骨髓增生低下时，仅依靠细胞形态学很难和非重型不典型AA鉴别。国外有研究表明，CD10、CD13、CD15、CD33、HIA—DR及髓系分化指数两者均有显著统计学差异，而且在RA和非重型也是如此，得出二者是两种性质截然不同的疾病，同时亦为两者的鉴别诊断提供了快捷、简便可靠的方法。绝大多数MDS患者以感染为首发症状，其中有4O%的MDS患者死于感染并发症，相关研究证明MDS患者的易感性不仅同粒细胞减少扥数目密切相关，而且同它的质[20]量也有密切相关。此外，MDS患者髓系细胞的CD15表达也减低，CD15主要在白细胞的渗出以及吞噬功能中起到重要作用，粒细胞与内皮细胞相互粘着是粒细胞游出的前提，主要是靠细胞表面的粘附分子相互作用以及相互识别来完成的，同时粒细胞表面的CD15也是内皮细胞的粘附分子以及选择蛋白的配体，调理素可以增强其吞噬细胞的吞噬功能，要是没有调理素来吞噬细胞是很难识别和吞噬细菌，有研究表明CD15与这过程密切相关。MDS患者髓系细胞CD10的表达也显著低于正常人，CD10有与膜相关的酶、以及中性肽链内切酶相同的氨基酸序列，CD10及中性肽链内切酶在中性粒细胞的炎症趋化作用及炎症应答作用中发挥重要作用。5.FCM在阵发性睡眠性血红蛋白尿方面的应用及研究进展阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种造血干细胞基因发生突变的克隆性疾病。[21]糖化磷脂酰肌醇锚连蛋白(GPI—AP)通过糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚连到细胞表，其中衰变加速因子(CD55，DAF)和反应性溶血的膜抑制物(CD59，MIRL)参与调节补体介[22]导的溶膜反应。传统诊断PNH的方法是用糖水试验、酸溶血等试验作为确诊的主要依据，两者对PNH的诊断特异性较高，其阳性率在8O%左右。但此试验是否阳性取决于患者对补体敏感的异常细胞的数量。急性溶血后立即检验，可能由于异常细胞已被破坏无遗而得出阴性结果，大量输血后正常细胞增多，异常细胞相对减少，也会影响[23]结果。而采用流式细胞仪和抗人CD55、CD59单克隆抗体直接检测和计数PNH患者41 综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义细胞膜有缺陷的异常细胞，可大大减少上述因素的影响，是目前诊断PNH最敏感，特异性最强，而且可以定量的最佳方法。CD55与CD59抗原缺失要是明显存在，说明体内异常克隆占主要优势，提示患者处于疾病的活动期，即血红蛋白尿期和临床危重期，反之，CD55与CD59抗原表达正常，提示患者异常细胞消失，临床处于恢复期。对PNH细胞锚连接蛋白的缺失程度进[24].行量化，有助于了解病情的进展情况，以及疗效的监测6.总结与展望很多研究中已证实某些抗原的种类和数量对疾病预测有一定可靠性，FMC是目前分子生物学广泛应用的一个重要检测手段，但是由于实验室应用抗体组合的不同和新试剂的投入运用，以及危险分层的标准不一样，临床及实验得出的结果不一致，故FCM检测结果在临床实践中其判断预后的作用尚有限，这将需要我们通过大量实验得出一套标准化供临床及实验需要。随着新的技术的不断开展，目前对分子生物学研究现已成为血液领域研究的热点。此外，大量研究发现了很多可能与预后相关的特异性抗原，这些特异性抗原可作为新的治疗靶点，为个体化治疗奠定基础，患者得到更大益处。42 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展参考文献1MyelomaTrialists’Collaborativegroup:Combinationchemotherapyversusmelphalanplusprednisoneastreatmentformultiplemyeloma:Anoverviewof6633patientsfrom27randomizedtrials.JClinOncol1998;16(12):3832-42.2AlegreADiaz-MediavillaJSanMiguelJetal.Autologousperipheralbloodstemcelltransplantationformultiplemyeloma.Areportof259casesfromthespanishregistryJ.BoneMarroWTransplant199821Suppl1113-140.3．AdnanAZDavidHV.MultiplemyelomaanolddiseaseWithnewhopeforthefutureJ.CanCancerJClin2001515273-285.4.BrunoP，Maria—BelenV，JorgeC，eta1．Mutiparameterflowcytometricisthemostrelevantprognosticfactorformultiplemyelomapatientwhoundergoautologousstemcelltransplantation．Blood，2008，112(10)：4017-4023．5.SanMiguelJF，VidrialesMB，Lopez—BergesC，eta1．Earlyimmu—nophenotypicalevaluationofminimalresidualdiseaseinacutemyeloidleukemiaidentifiesdifferentpatientriskgroupsandmaycontributetopostinductiontreatmentstratification[J]．Blood，2001，98(6)：1746-1751．6.VendittiA，BuccisanoF，DelPoetaG，eta1．Levelofminimalresidualdiseaseafterconsolidationtherapypredictsoutcomeinacutemyeloidleukemia[J]．Blood，2000，96(12)：3948—39527.KapoorP，GreippPT，MofieeWG，eta1．Anti—CD20monoclonalantibodytherapyinmultiplemydloma[J]．BritishJournalofHaaematology，2008，141(2)：135～148．8.HayashiT，TreonSP，HideshimaT，eta1．Recombinanthumanizedanti——CD40monoelonalantibodytriggersautotogousantibody—。dependentcell——mediatedcytotoxicityagainstmultiplemyelomacels[J]．BritishJournalofHaematology，2003，121(4)；592～5969.SchnittgerS，KernW，TschulikC，eta1．MinimalresidualdiseaselevelsassessedbyNPM1mutationspecificRQ—PCRprovideimportantprognosticinformationinAML[J]．Blood，2009，114(11)：22202231．10.CampanaD．Determinationofminimalresidualdiseaseinleukaemiapatients[J]J．BrJ43 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微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义综述流式细胞术在血液病检测中应用及研究进展216patientsstudiedbythecancerandleukemiagroupB[J]．LeukemiaResearch，1997，21(9)：801—805．21.Tomita肌Biochemicalbackgroundofparoxysmalnocturnalhemoglobinufi[J]．BiochimBiophysActa，1999，1455：269-286．22.Rostiv．Themolecularbasisofparoxysmalnocturnalhemoglobinufia[J]．Hmatologica，2000，85：82-87．23.AlfinitoF，delVecchiol，RoecoS，eya1．B1oodCellflowcytometryinparoxysmnocturnalhemoglobinufia：atoolformeasuringtheextentoftheclone[J]．Leukemia，1996，10(8)：l326—1330．24MadkaikarM，GuptaM，JijinaF，etn．Paroxysmalnocturnalhaemoglobinuria：diagnostictests，advantages，&limitations[J]．EurJHaematol，2009，83(6)：50-51145 中英文缩略词汇表微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义中英文缩略词汇表MM多发性骨髓瘤ASCT自体造血干细胞移植Allo-HSCT异基因造血干细胞移植HDT大剂量化疗CR完全缓解VGPR很好的部分缓解PR部分缓解SD疾病稳定期PD疾病进展nCR接近完全缓解OS总生存期Thal沙利度胺Dex地塞米松Rev雷那度胺Vel硼替佐米BPs双磷酸盐MP马法兰、泼尼松PD/PAD硼替佐米、地塞米松VAD长春新碱、阿霉素、地塞米松46 微小残留病灶检测对多发性骨髓瘤临床治疗及预后的意义致谢致谢韶华易逝，转眼三载。回首往昔，快乐而艰辛。值此毕业论文完成之际，我满怀感恩，谨向所有关心、爱护、帮助过我的老师、同学和家人表示最诚挚的谢意和最美好的祝愿。衷心感谢导师傅琤琤教授，是您引领我走进血液病学的知识殿堂！您博学精深的专业知识、严谨干练的工作作风、创新求精的治学精神、无私仁爱的医者之心，令我十分敬佩、影响深远。三年来，您不仅在学业上为我指点迷津，还在生活上给予我无私的帮助，教会我宽容真诚的处世原则，赋予我终生受益无穷之道。这份师生情谊我将永远铭记！衷心感谢朱明清老师给予我的悉心指导和谆谆教诲。您在论文的选题设计、实验方法、数据整理直至撰写、修改和定稿的每一个环节都投入了大量的时间和精力，帮助我克服困难，引导我不断开阔思路，为我答疑解惑，使我的课题研究得以顺利完成。您严谨求实的科研作风、废寝忘食的工作态度以及睿智机敏的个人魅力感染着我，激励着我，永远是我学习和工作的楷模。衷心感谢阮长耿院士、吴德沛教授、陈子兴教授、王兆钺教授、孙爱宁教授、陈苏宁教授的关心、指导和教诲，你们严谨的学术态度与渊博的知识将一直是我学习、工作的榜样。衷心感谢实验室岑建农、朱明清、沈文红、常惠荣、朱子玲、恭斐然、丁子轩、刘红等老师的大力支持；衷心感谢血液科薛胜利、金松、顾斌、吴小津、李渭阳、戴海萍、颜灵芝、徐杨、吴倩等老师的热情指导；衷心感谢于葛华、沈宇老师的无私帮助，使我能够顺利完成本论文。感谢同窗王婧、杨永、周华、杨贞、葛玲、欧阳皖雁、陆婷、余晓、程珍、秦莉莉、陈梦醒、吴义存等，感谢师兄师姐师妹师弟汪涓、辛雪、李正、路玉夏、尹佳、马玲、郑慧菲、颜霜、王攀峰等，谢谢你们的帮助，因为你们，我又多了很多温馨而美好的回忆。最后要特别感谢我的父母及家人，你们的理解、支持、包容和鼓励支撑着我前行。47
