急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究

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1、急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究作者:任海全，唐天华，毕可红，张玉昆，赵良玉，郭桂月，刘秀兰，姜枫勤，刘传芳，彭军，田志刚［摘要］目的检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(MRD)，同时分析其对预后判断的指导价值。方法建立逆转录PCR(RT/PCR)用以检测APL患者PML/RARα。结果RT-PCR方法敏感而可重复。治疗前APL患者的RT-PCR阳性率为92.8%(39/42)，而维甲酸或化疗诱导完全缓解后MRD阳性率为56.7%(21/37)。另外，MRD阳性与缓解后APL患

2、者的复发有关，并可以作为缓解后预测APL患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论RT-PCR能够检测APL患者的MRD和作为预测复发的指标。［关键词］急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；RT/PCR白血病患者完全缓解（CR）后的微小残留病（MRD）已被证实与复发有关［1］。MRD的检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标［2］。在目前血液病的应用实践中，MRD检测的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法检测慢性粒细胞白血病（CML）的BCR-ABL融合基因［3］。急性早幼粒细胞性白血病（APL）以

3、特异的染色体t（15;17）（q22;q21）易位为特征［4］。最近，许多实验室发现t（15;17）易位后，通过15染色体上的PML基因和17染色体上的RARα基因并列而导致融合基因PML/RARα形成［5］。根据PML断裂点的位置不同，可以产生2个主要的PML/RARα异构体。断裂点位于PML内含子3或4（bcr3），则PML外显子3（P3）和RARα外显子3（r3）之间形成短（S）型融合mRNA产物，而断裂点位于PML内含子6（bcr1）或下游，PML内含子6（P6）和RARα外显子（r3）形成长（L）型融合体

4、［6，7］。RT-PCR法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增PML/RARαmRNA异构体［8］。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的检测成为可能，并可在APL患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。1资料与方法1.1病例选择本研究中的42例患者均为1993～2000年发病，男26例，女16例，年龄12～72岁，根据FAB标准［9］诊断为APL。全部病例均经全反式维甲酸（ATRA）治疗［30～60mg/（m2·d）］诱导缓解。巩固化疗方案为标准的HOAP或DA方案。巩固治疗后处于缓解期

5、的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的ATRA与化疗联合治疗方案维持治疗［10］。骨髓单个核细胞用Ficoll分离并保存于液氮中。1.2RNA提取10ml淋巴细胞分离液加于试管中，然后2ml骨髓细胞缓慢加入试管中，离心4000r/min20min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs［11］。提取时注意避免样品间的交叉污染。1.3筑巢式RT-PCR检测APL的PML/RARα检测方法：8个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。逆转录引物：A5-TGGATGCTGCGG

6、CGGAAGAAGCCCTTGCAG-3PML/RARα引物：B5-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3正常RARα转录引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3J5-AAAGCAAGG

7、CTTGTAGATGC-3K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3RT-PCR方法与步骤按照早期报道的方法进行［12］。1.4PCR产物分析取10μl第2轮PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭1μg/ml染色，照相。并移至尼龙膜上，用5末端寡核苷酸探针（H）杂交，放射自显影30min，拍片。1.5统计学方法采用t检验。2结果2.1PCR产物的结果及其敏感度PML/RARα的L、S异构型（见图1）。RT-PCR的敏感度为2.5×10-6。图1

8、PML/RARα类型2.2RT-PCR阳性百分率用全反式维甲酸治疗前APL患者PML/RARα的检测，34例为L型阳性，5例为S型阳性。L型、S型或2型的总阳性百分率分别为80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和92.8%（39/42）。APL患者CR后的MRD阳性率是56.7%（21/37）。见表1。表1APL患者RT—PCR检测阳性率的变化注：