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1、结直肠腺癌BRAF基因突变对临床治疗和预后的意义［摘要］目的研究结直肠腺癌BRAF基因突变对临床治疗和预后的意义。方法整群收集该院2009年1-12月经病理科诊断手术的166例癌组织标本及61例癌旁正常组织。用PCR-DNA测序法测BRAF突变情况，对病理资料统计和随访60个月生存情况。结果①癌组织中BRAF突变率9.04%,常见类型BRAF-V600E,癌旁正常组织无突变。②癌组织分级低突变率较组织分级高的患者高，有淋巴转移突变率较无转移患者的高，差异有统计学意义(P0.05)o③癌组织为BRAF突变型的患者生存率较野生型
2、的低，两条生存曲线明显分开差异有统计学意义(P〈0.05)。结论结直肠癌患者屮,癌组织BRAF基因突变率明显高于癌旁正常组织与分化程度、淋巴转移有相关性，与患者生存率成负相关提示预后不良。［关键词］结直肠癌：BRAF基因：生存率［屮图分类号］R4［文献标识码］A［文章编号11674-0742(2015)07(c)-0055-02我国CRC发病率以每年3.9%速度递增占恶性肿瘤的第3位，病死率第5位。患者确诊后5年存活率仅为55%左右。随着对CRC发病分子机制和信号传导通路的深入研究，证明RAS-BRAF-MAPK细胞信号转导
3、通路激活与恶性肿瘤的发病、进展和恶性程度密切相关。原癌皋因BRAF作为一种基因编码的丝/苏氨酸特异性激酚，是该通路重要的细胞内信号转导因子,使凋亡诱导因子失活减少细胞凋亡促进肿瘤细胞增殖、组织分化、血管生成和侵袭转移筹。随肴靶向药物临床应用，有效降低了患者死亡率提高生存质量，同时出现了临床耐药。临床证实KRAS、BRAF基因突变患者在抗EGFR靶向治疗中无效，预后生存差，只有野生型患者才能从抗EGFR单克隆抗体治疗屮获益。BRAF基因与临床耐药及不良预后的关系尚有争议圈，该研究旨在探讨其对临床治疗和预后的影响。1资料与方法1
4、.1一般资料收集该院2009年1-12月经病理科诊断手术166例原发结直肠癌腺癌组织标本及其癌旁正常组织61例作为对照组。年龄19-76岁，平均年龄(49.9±10.1)岁。患者术前均未行放、化疗。统计病理资料和随访60个月生存情况，有5人失访。1.2实验方法1.2.1组织DNA分子提取采用徳国Qiagen公司的DNA提取试剂盒。对组织蜡块切8um厚10张水展后用膜片捞出，切取厚1张HE染色镜下观察肿瘤集中区域。用激光共聚焦切割仪选取切片上对应肿瘤组织归入EP管中脱蜡醇化，加入裂解液55°C水浴过夜，蛋白酶K消化，沉淀洗盐，
5、取样本行纯度测定，一20°C冰箱保存备用。1.2.2下游引物5PCR扩增纯化由上海碧云天生物技术有限公司利用软件Premier5.0设计PCR引物序列如下BRAF基因第15号外显子上游引物5'-CTCTTCCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3-GTGAGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3J扩增片段长度为318bp0卩CR反应体系50口1,反应条件为95°C预变性5min；94°C变性30s：60°C退火30s,72°C延伸60s,共30个循环；最后72°C延伸lOmin；降至4°C结束反应。于美国BT
6、0-RAD580BR卩CR仪器上进行基因扩增。用纯化试剂盒将卩CR产物纯化。取5P/PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，混化乙噪染色，紫外灯下检测观察，照相存盘。1.2.3DNA分子直接测序将检测有单一条带的样本送公司测序，经人工校对记录后用DNAMAN6.0软件与基因库BRAF基因序列比较结果。1.3统计方法应用SPSS19.0软件对数据进行分析，计数资料采用X2检验，采用log-Rank检验彳亍生存分析。2结果2.1癌组织中BRAF基因突变情况癌组织屮BRAF基因突变率为(15/166)9.04%。癌旁正常肠组织无基因突变。
7、15外显子上突变类型有5种V600E(T1799A,GTOGAG)11例，V600G(T1799G,GTG>GGG)2例，V600S(G1798T、T1799C,GTOTCG)1例，T5981(C1793T,ACOATC)2例，L594P(T1781CC1782A,CTOCCA)1例。常见突变类型为BRAF-V600E(11/15),有1例第014号标本是多位点串联突变。2.2癌组织BRAF基因突变与临床病理无相关性分析癌组织BRAF基因突变组织分级低12.09%(11/91)的患者较组织分级高5.33%(4/75)患者突变
8、率高，差异有统计学意义(X2二6.79,P<0.05)。有淋巴转移患者12.37%(13/97)突变率较无转移2.90%(2/69)患者突变率高，差异有统计学意义(X2二5.85,P<0.05)o癌组织中患者浸润深度(X2二1.94,卩>0.05)及远处转移(x刁二1.74,卩>0.05)
