齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系

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硕士学位论文Master’sThesis齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系作者姓名：潘姝花指导教师：许传莲教授学科专业：生物化学与分子生物学所在学院：生命科学学院提交日期：二零一四年三月中国杭州 ZHEJIANGSCI-TECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATIONOleanolicacidderivativesmediatedtheapoptosisinK562leukemiacellsandtherelationshipwiththeAktsignalingpathwaysShuhuaPanDirectedbyProfessorChuanlianXuCollegeofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversityHANGZHOU,CHINA 分类号：密级：UDC：齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系论文答辩日期2014.3.6答辩委员会主席刘新垣论文评阅人俞永平、于威、徐涛答辩委员会成员阎辉、吴炯、于威、蒋彩英 课题来源浙江省自然科学基金[NSF(Y4110320),NSFC(Nos.20972086,21172130)]. 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系摘要随着恶性肿瘤的发病率和死亡率的不断增加，抗肿瘤药物的研发成为当今生物医学界面临的重大课题。由于天然抗肿瘤药物具有高效、低毒等优点，所以从天然产物中筛选出有效的抗肿瘤药物是药物研发的重要手段。五环三萜类化合物在抗肿瘤药物的发展中起到不可忽视的作用。齐墩果酸（Oleanolicacid，OA）是天然的五环三萜类化合物之一，已经用作抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗炎制剂等。最近，许多齐墩果酸衍生物主要是针对齐墩果酸C3、13位双键、A环和C28等官能团的结构修饰，以提高齐墩果酸衍生物的抗肿瘤活性和降低其对正常细胞的毒害作用。本研究对已合成的2-氨基嘧啶齐墩果酸（化合物4）和1，2-噁唑齐墩果酸（化合物5）的抗肿瘤作用机制研究如下：1）利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测化合物4、5对K562细胞的细胞毒性作用。化合物4采用10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM，化合物5采用20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM6个浓度，以紫杉醇为阳性对照。K562细胞在不同浓度化合物下孵育72h后检测在490nm吸收值。结果显示化合物4、5显著抑制K562细胞的增殖，并呈浓度依赖的方式，IC50值分别为32.686μM和39.252μM。2）检测化合物对K562细胞形态学的影响。化合物4、5（20μM、40μM）处理K562细胞24h后，用Hoechst33342工作液染色30min，于荧光显微镜下看肿瘤细胞形态。结果显示化合物处理后，出现凋亡小体、核固缩、核裂解等细胞凋亡的典型特征。由此初步推测目的化合物通过凋亡途径抑制了K562细胞的增殖。3）采用流式细胞术检测化合物对K562细胞周期的影响。化合物4、5（40μM）处理细胞24h后，细胞用PI（50μg/mL）避光染色30min。流式细胞术检测结果显示化合物4、5处理细胞后，G1期细胞从29.89%（对照）分别增加41.65%和42.15%，初步推断化合物抑制细胞增殖与细胞周期阻滞在G1期有关。4）利用Westernblot的方法检测化合物对Bcl-2、Bax和聚ADP核糖聚合酶（PARP蛋白）、pAkt1表达的影响。化合物4、5以20μM、40μM、60μM的浓度处理K562细胞36h后，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，裂解PARP蛋白，抑制pAkt1蛋白的表达。5）通过Incellanalyzer1000分析稳转表达Akt1-EGFP的CHO细胞中Akt1在细胞内的分布情况。化合物4、5处理细胞1h后，加入16.7nM胰岛素，处理10min。利用InCellAnalyzer1000平台，高通量的捕捉并统计荧光标记的蛋白的数量及位置变化。发现化合物4、5以浓I 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系度依赖的方式抑制胰岛素刺激Akt1转移到膜上，从而影响Akt1在膜上磷酸化。6）构建重组载体pLJM1/Akt1，用嘌呤霉素筛选稳定过表达Akt1的K562细胞和Bel-7404细胞，利用MTT比色法检测目的化合物对其细胞毒性作用。结果显示化合物4、5通过浓度依赖的方式抑制细胞的增殖，IC50值分别为41.629μM和43.735μM。初步实验结果阐明该化合物具有一定逆转肿瘤细胞耐药性的潜在作用。本论文为齐墩果酸衍生物的结构优化提供了先导化合物和实验依据，为深入研究抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子作用机制提供了理论依据，为下一步新药的开发奠定基础。关键词：齐墩果酸衍生物；抗肿瘤活性；细胞凋亡；Akt1；InCellAnalyzerII 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系AbstractThedevelopmentofanticancerdrugshasbecomeamajorissueduetothecancermorbidityandmortalitycontinuestoincrease.Screeningeffectiveantitumordrugsfromnaturalproductsisanimportantmeansofdrugdevelopmentbecausethenaturalantineoplasticdrugshavetheadvantagesofhighefficiency,lowtoxicity.Pentacyclictriterpeneshavecontributedtothedevelopmentofmoderntherapeuticdrugs.Oleanolicacid(OA)isanaturalpentacyclictriterpenoidthathasbeenusedasantibacterial,antifungal,anticancer,andanti-inflammatoryagent.Recently,variousOAderivativeshavebeensynthesizedfocusingontheC-3,double-bond-13,A-ringandC-28toenhancetheeffectofanti-proliferativeeffectsandreducetoxicitytonormalcells.Thepresentstudyaimedtofurtherinvestigatethemolecularmechanismsof2-amiopyrimidineOA(compound4)and1,2-oxazoleOA(compound5)inducedapoptosis:1)Theeffectsofcompound4andcompound5oncellproliferationinK562cellsweredeterminedbytheMTTassay.Compound4dilutedinto10μM,20μM,40μM,60μM,80μM,100μM,compound5dilutedinto20μM,40μM,60μM,80μM,100μM,120μM,andpaclitaxelaspositivecontrol.K562cellsweretreatedwithvariousdosesofcompoundsfor72handthentheabsorbancedeterminedatwavelengthof490nm.ThecompoundsshowedstronginhibitoryeffectsonK562cellviabilityinadose-dependentmanner,theIC50werevalued32.686μMand39.252μM,respectively.2)TheeffectsofcompoundsonK562cellmorphology.K562cellsstainedwithHoechst33342aftertreatedwithcompound4andcompound5（20μM,40μM）for24h.Theirnuclearmorphologywasobservedbyfluorescentmicroscopy.Theresultsshowedthatthetypicalmorphologicalcharacteristicofapoptosissuchaskaryopyknosisandconglomeration,apoptosisbody,nuclearcrackingwereobservedaftertreatedwithcompounds.Thus,itimpliedthatcompound4andcompound5possessedantitumoractivitythroughinducingcellapoptosis.3)TheeffectsofcompoundsoncellcycleanalysisweredeterminedbyFlowCytometry.AfterK562cellswereexposedtocompound4andcompound5（40μM）for24h,thecellswereincubatedwithPI(50μg/mL)for30mininthedark.Theresultsshowedthatcompound4andcompound5treatmentsofthecellsincreasedinthepercentageofcellsinthesub-G1phasefrom29.89%(control)to41.65%and42.15%respectively.FlowCytometryanalysissuggestedthatIII 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系compoundsinhibitedofK562cellproliferationassociatedwithG1phasearrest.4）Theeffectsofcompounds4andcompounds5ontheexpressionofBcl-2,Bax,PARP,pAkt1weredeterminedbywesternbloting.K562cellsweretreatedwithcompound4andcompound5indosesof20μM,40μM,60μMfor36h.Theresultsshowedthatthecompound4andcompound5wereabletodown-regulatethelevelofBcl-2andup-regulatethelevelofBax.TheyalsoresultedininactivationofPARPandAkt1.5）UsingIncellanalyzer1000analysedthedistributionofAkt1inCHOcellswhichexpressedAkt1-EGFPsteadily.CellstreatedwithOA,compound4,compound5indosesof1,10,20μMfor1hfollowedbystimulationwithinsulinfor10min.Incellanalyzerplatformcancaptureofhighfluxandstatisticsthenumberoffluorescentmarkerproteinandpositionchanges.Theresultsshowedcompound4andcompound5caninhibitinsulin-stimulatedtranslocationofAkt1totheplasmamembraneinadose-dependentmanner,andtheninfluencephosphorylationofAkt1onthemembrane.6)WeconstructedpLJM1/Akt1recombinantplasmidandusedpuromycintoselectthestableclonesandgotthehighexpressionofAkt1stablecelllinesK562andBel-7404.Theeffectsofcompound4andcompound5oncellproliferationinK562/Akt1cellsweredeterminedbytheMTTassay.TheresultsshowedthatcompoundshavestronginhibitoryeffectsonK562cellviabilityinadose-dependentmanner,theIC50werevalued41.629μMand43.735μM,respectively.Thepreliminaryexperimentalresultsillustratedthatthecompoundshavecertainpotentialreversaleffectsofdrugresistance.Theworksaboveprovidedleadcompoundsandexperimentalbasisforthestructureoptimizationofoleanolicacidderivatives.Italsoprovidedthetheoreticalbasisforfurtherresearchonmolecularmechanismofapoptosisinducedbyantitumordrugsandlaidafoundationforthedevelopmentofnewdrugsinthenextstep.KeyWords：OAderivatives;antitumoractivity;apoptosis;IncellanalyzerIV 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系缩略表缩略语英文全称中文全称AcrAcrylamide丙烯酰胺Akt/PKBProteinkinaseB蛋白激酶BAPAmmoniumPersulfate过硫酸胺Bel-7404HumanlivercancerBel-7404cell人肝癌细胞Bel-7404细胞BisN,N’-methylenabisacrylamide甲叉双丙烯酰胺DMEMDulbecco'sModifiedEagleMedium改良的Eagle培养基DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇HEK293THumanembryonickidneycells293T293T细胞E.coliEscherichiaColi大肠杆菌EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸FBSFetalbovineserum胎牛血清IC50Halfmaximalinhibitoryconcentration半数抑制浓度K562HumanleukemiaK562cellK562细胞LBLysogenyBroth营养肉汤MEMMinimumEssentialMedium低限基本培养基MTT3-[4,5-dimehyl-2-thiazolyl]-2,5-3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide二苯基溴化四唑ODOpticaldensity光密度PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液pHHydrogenIonConcentration酸碱度PIPropidiumIodide碘化丙啶PI3KPhosphoinositide3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶PVDFPolvinylidinedifluoride聚偏二氟乙烯RPMI-1640RoswellParkMemorialInstitute-16401640培养基SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基磺酸钠SDS-PAGESodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGel十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶Electropheresis电泳V 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系TBSTTris-BufferedSalineTween-20Tris缓冲盐吐温-20TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TRISTris-(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷VI 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系目录摘要........................................................................................................................................IAbstract.........................................................................................................................................III缩略表............................................................................................................................................V第一章绪论...................................................................................................................................11.1天然抗肿瘤药物概述.......................................................................................................11.2五环三萜类衍生物的结构类型.......................................................................................21.2.1齐墩果烷型.............................................................................................................21.2.2乌苏烷型.................................................................................................................31.2.3羽扇豆烷型.............................................................................................................31.2.4木栓烷型.................................................................................................................41.3五环三萜类衍生物的研究现状.......................................................................................51.4五环三萜类化合物抗肿瘤作用机制的研究进展...........................................................61.4.1诱导细胞凋亡.........................................................................................................61.4.2阻遏细胞周期.........................................................................................................61.4.3抗肿瘤细胞侵袭.....................................................................................................61.5Akt1与肿瘤的研究现状...................................................................................................71.6研究内容及目的意义.......................................................................................................7第二章齐墩果酸衍生物体外抗肿瘤实验...................................................................................92.1引言...................................................................................................................................92.2材料、试剂和仪器...........................................................................................................92.2.1细胞株.....................................................................................................................92.2.2材料.........................................................................................................................92.2.3试剂..........................................................................................................................92.2.4仪器........................................................................................................................102.3实验方法.........................................................................................................................102.3.1样品的配制...........................................................................................................102.3.2细胞培养................................................................................................................112.3.3化合物4、5对K562细胞毒作用.......................................................................112.3.4Hoechst33342荧光染色.......................................................................................11VII 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系2.3.5流式细胞术分析化合物4、5对K562细胞周期的影响..................................112.3.6提取细胞总蛋白...................................................................................................122.3.7细胞总蛋白定量（BCA蛋白浓度测定试剂盒）..............................................122.3.8WesternBlot检测方法..........................................................................................122.3.9INCellAnalyzor分析方法..................................................................................132.4实验结果..........................................................................................................................132.4.1化合物4、5对K562细胞毒作用......................................................................132.4.2Hoechst33342荧光染色结果...............................................................................142.4.3流式细胞术检测细胞周期实验结果...................................................................152.4.4蛋白定量结果分析...............................................................................................162.4.5WesternBlot实验结果..........................................................................................172.4.6Incellanalyzer.......................................................................................................182.5讨论.................................................................................................................................20第三章过表达Akt1细胞株K562、Bel-7404细胞的构建及鉴定.........................................233.1引言.................................................................................................................................233.2实验材料、试剂和仪器.................................................................................................233.2.1实验材料...............................................................................................................243.2.2实验试剂...............................................................................................................243.2.3实验仪器...............................................................................................................243.3实验方法.........................................................................................................................253.3.1引物设计...............................................................................................................253.3.2模板制备...............................................................................................................253.3.3RNA反转录成cDNA制备.................................................................................263.3.4目的片段Akt1的PCR扩增................................................................................263.3.5PCR产物回收.......................................................................................................273.3.6质粒pLJM1的提取.............................................................................................283.3.7双酶切...................................................................................................................283.3.8酶切产物回收.......................................................................................................293.3.9T4链接酶连接........................................................................................................293.3.10转化.....................................................................................................................29VIII 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.3.11质粒PCR鉴定...................................................................................................303.3.12双酶切鉴定.........................................................................................................303.3.13测序鉴定.............................................................................................................313.3.14pLJM1、pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G天根试剂盒质粒大抽.................313.3.15pLJM1、pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G质粒浓度浓缩.............................313.4过表达Akt1的K562、Bel-7404稳定细胞株的构建及筛选.....................................323.4.1293T、K562、Bel-7404细胞培养.......................................................................323.4.2慢病毒包装...........................................................................................................323.4.3病毒包装成功与否鉴定.......................................................................................323.4.4病毒侵染及稳定株的筛选...................................................................................333.4.5Westernblot检测方法..........................................................................................333.4.6化合物4、5对过表达Akt1的Bel-7404和K562细胞细胞毒作用...............333.5结果.................................................................................................................................333.5.1模板制备...............................................................................................................333.5.2目的产物扩增.......................................................................................................343.5.3目的片段Akt1和载体pLJM1双酶切................................................................343.5.4重组质粒pLJM1/Akt1的质粒PCR鉴定...........................................................353.5.5重组质粒pLJM1/Akt1的酶切鉴定结果.............................................................353.5.6测序鉴定结果.......................................................................................................363.5.7pLJM1与包装质粒共转染293T细胞.................................................................373.5.8Westernblot检测包装的慢病毒..........................................................................383.5.9Westernblot检测目的蛋白Akt1的表达............................................................383.5.10化合物4、5对过表达Akt1的K562细胞细胞毒作用..................................393.6讨论.................................................................................................................................39第四章结论与展望.....................................................................................................................414.1结论.................................................................................................................................414.2创新点.............................................................................................................................414.3展望.................................................................................................................................42参考文献.......................................................................................................................................43附录主要试剂配制.....................................................................................................................51IX 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系致谢.....................................................................................................................................54X 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系第一章绪论1.1天然抗肿瘤药物概述据有关报道，恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，全世界每年癌症新患者约[1]900万，超过一半被癌症夺去生命。由于城镇化、工业化和人口老龄化进程的加快，不良的生活方式以及环境污染等问题的存在，肿瘤面临的形势愈发严峻，癌症发病率继续在上[2-3]升。药物治疗是肿瘤治疗的重要治疗方式，具有对病人伤害相对较轻，危险性较小，且对于某些肿瘤已取得相当高的治愈率等优点。抗肿瘤药物按其来源可以分为天然产物、天然[4]产物衍生物、天然产物类似物、化学合成药物、疫苗、生物制剂等。抗肿瘤药物有62.9%[5]源于天然产物或其衍生物，可见天然产物在抗肿瘤药物的研究与开发中的重要地位。从天然药物中寻找有效的抗肿瘤活性药物及药物先导化合物的研究越来越受到人们的重视，[6]在合成的化学类抗癌药物中绝大多数都是以具有抗癌活性的天然产物为先导化合物。临床上抗肿瘤的天然产物主要有黄酮类、生物碱类、萜类、醌类、皂苷类等。（1）黄酮类化合物存在于多种植物中，是一类多酚化合物，具有许多潜在的药用价值。抗肿瘤作用是其一个研究热点，主要表现在抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、上调抑癌基因活性及下调癌基因表达、干预细胞信号转导等功效。黄酮类抗肿瘤代表性化合物包括木樨草素、[7-10]槲皮素、芹菜素等。（2）生物碱类多数具有复杂的含氮杂环，广泛存在于多种植物中，比如石蒜科植物、豆科植物等。其主要抗肿瘤代表性化合物包括喜树碱、长春碱、苦参碱[10-12]等。（3）萜类化合物是指分子式为异戊二烯的整数倍的烯烃类化合物及其含氧衍生物，主要分布在海洋生物、动植物、菌类以及蕨类中。在萜类化合物中，对抗肿瘤活性的研究主要围绕着五环三萜类化合物。许多五环三萜化合物都具有显著抗肿瘤活性，也是国内外研究天然抗肿瘤药物的焦点。五环三萜是植物的次级代谢产物，具有抗炎、降血压、[13-14]抗肿瘤、护肝等生物活性。其主要抗肿瘤代表性化合物包括齐墩果酸、甘草次酸等。（4）醌类是一类含有醌式结构的化合物，按其结构可以分为苯醌、萘醌、蒽醌、菲醌四[15-17]类结构，醌类抗肿瘤代表化合物有紫草素、大黄素。（5）皂苷类化合物在人参、桔梗、甘草和柴胡等均有分布，主要有效成分都含有皂苷。许多皂苷及其衍生物都具有显著的抗[18]肿瘤活性，如最具代表性的人参皂苷Rg3。Rg3通过抑制肿瘤细胞的增殖，阻遏细胞停[19]留在G2期，并且有抗肿瘤细胞侵袭和转移的作用。天然药物的抗肿瘤作用机制主要有以下几种：（1）破坏DNA并阻止其复制，使细胞[20-22]无法进行分裂来控制肿瘤的发生与发展。常用的药物有烷化剂、铂类、部分抗生素等。1 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系（2）干扰核酸生物合成，主要影响细胞内的酶系，使核酸的前体无法合成，最终导致肿[23-24]瘤细胞生长繁殖受到抑制，促使细胞凋亡。常用的药物有甲氨喋呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶等。（3）干扰核酸转录，可以选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖性RNA多聚[25]酶，影响RNA合成。常用的药物有放线菌素-D、阿克拉霉素等。（4）抑制微管蛋白合[26-27]成，细胞有丝分裂，阻止其增殖期的进程。常用的药物有紫杉醇、长春碱、鬼臼碱类。（5）其他类药物，可以增强宿主抗肿瘤反应，增强免疫原性，预防其细胞转化，如生物[28]反应调节剂。1.2五环三萜类衍生物的结构类型五环三萜类是萜类化合物中含量最多的一类，它们的抗肿瘤作用机制研究非常广泛[29]。目前已经报道出许多具有抗肿瘤活性的五环三萜类化合物，且其抗肿瘤作用呈现多部位、多靶点、多环节的特点，使其有望成为新一代的抗肿瘤药物。五环三萜按其结构可以分为四类，齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型。下面对各种类型进行详细介绍。1.2.1齐墩果烷型齐墩果烷型的代表化合物有齐墩果酸（Oleanolicacid，OA）、甘草酸（glycyrrhizicacid，GA），其中OA广泛存在于白花蛇舌草、大枣、枇杷叶、山楂、夏枯草、丁香、女贞子、橡木等植物中，以游离或结合成苷的形式存在，用于急慢性肝炎的治疗，可提高人体免疫[30]功能；GA主要存在于豆科植物甘草中，诸多研究表明甘草酸及其衍生物具有抗肿瘤活性。齐墩果烷型结构见图1.1。有研究报道，OA具有抗肿瘤作用，其作用几乎贯穿了肿瘤发展的各个阶段，包括抑制肿瘤的增殖、诱导细胞的分化，抑制肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的侵袭和转移，可明显抑[31-32]制阿霉素所致微核率升高。OA通过裂解多聚ADP核糖聚合酶（PolyADP-ribose[33]polymerase，PARP），激活Caspase-3和Caspase-9诱导HL-60凋亡。另有研究发现OA能增加NO和TNF-α释放，并且通过细胞核因子NF-κB的转录活性上调iNOS和TNF-α的基因表[34-35]达，从而发挥其抗癌作用。[36]GAO等发现甘草次酸衍生物可以抑制K562细胞的增殖，并具有显著的剂量和时间依赖性。同时，可以诱导K562细胞的凋亡，凋亡的机理可能与凋亡蛋白caspase-3的激活，[14]Bcl-2表达下调和Bax表达上调有关。Sharma等发现18β-glycyrrhetinic能有效的抑制MCF-7细胞增殖，并呈明显的剂量和时间依赖。化合物通过线粒体途径诱导细胞凋亡，引起细胞色素C的释放和caspase-9的激活。2 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图1.1齐墩果烷型结构Fig.1.1ChemicalstructureofOleanane1.2.2乌苏烷型乌苏烷型的代表化合物有熊果酸（Ursolicacid，UA），又名乌苏酸、乌索酸是分布广泛的α-香树脂醇型五环三萜类化合物，一般以游离或与糖结合成苷的形式存在，分布于自[37]然界中约7个科46个属62种植物中。诸多实验证明UA具有广泛的生物学活性，UA是脂[38-41]溶性物质，可穿过细胞膜起效，包括抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化保肝等作用。目[42]前，UA抗肿瘤机制已成为当今研究的热点。Zhang等发现一种新型的乌苏烷型五环三萜化合物，并且能在体外诱导多种肿瘤细胞株凋亡如Hela、Bcap37、HepG2、K562、HO-8910细胞等。综上所述，进一步深入研究乌苏烷型衍生物抗肿瘤作用的机制，可能为临床提供高效、低毒、经济的抗肿瘤的药物。乌苏烷型的结构如图1.2。图1.2乌苏烷型结构Fig.1.2ChemicalstructureofUrsane1.2.3羽扇豆烷型白桦酸（Betulinicacid，BA）是典型的羽扇豆烷型五环三萜类化合物，主要存在于白3 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系桦树皮、夹竹桃、牡丹等，具有抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗炎和体外抗疟病等多种生物活性，尤其对于恶性皮肤黑痣瘤有很好的效果，并进一步证明其毒性，是最有前途的抗癌药[43]物前体。有研究表明白桦酸可以通过线粒体途径介导细胞凋亡，它诱导线粒体膜电势的变化，影响细胞膜通透性，从而引起细胞色素C的释放到胞浆，激活Caspases，以及产生[44]DNA片断，但并不依赖p53和Bax/Bak。羽扇豆烷型的结构如图1.3。图1.3羽扇豆烷型结构Fig.1.3ChemicalstructureofLupinane1.2.4木栓烷型木栓烷型三萜对皮肤病、白血病和风湿都有疗效，是一类较有研究和开发价值的药用资源，在卫矛科植物中含量丰富，其木栓烷型结构如图1.4。雷公藤红素（Celastro1），又名南蛇藤素，是存在于南蛇藤、雷公藤等植物中的一种木栓烷型三萜类化合物，它将成为[45-46]继紫杉醇之后又一高效低毒的抗肿瘤植物药。有研究发现雷公藤红素可以通过激活Caspases信号通路来诱导前列腺癌细胞凋亡，并[47][46]且能有效抑制裸鼠前列腺癌的增生，有效率达到65-93%。Sha等发现雷公藤红素以浓度依赖的方式抑制胃癌细胞的增殖，上调miR-146a基因的表达可以抑制NF-κB的活性和下[48]调IκB的磷酸化来诱导细胞凋亡。Zhang等发现雷公藤红素可以抑制热休克蛋白90（HSP90）的功能，诱导HSP90底物蛋白如Akt和Cdk4的降解来诱导胰腺癌细胞凋亡，抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长。总之，以上实验证明雷公藤红素对多种肿瘤表现出显著的抗癌活性，是一种潜在抗肿瘤植物药。4 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图1.4木栓烷型结构Fig.1.4ChemicalstructureofFriedelanes1.3五环三萜类衍生物的研究现状从自然界寻找有活性的先导化合物进行结构修饰，是目前寻找创新药物的重要途径。五环三萜类化合物具有多种生物活性，且来源丰富，可进一步进行结构修饰和改造，以此提高其抗肿瘤活性和降低毒副作用。五环三萜类化合物在抗肿瘤、抗HIV、抗菌、护肝和抗炎等方面具有显著的药理作用，已被大量进行动物试验和临床预试研究，并且运用于肿[49]瘤的治疗。目前对五环三萜类修饰主要集中在以下三方面：A环的官能团化修饰，如：2位取代，3位羟基修饰及氧化、糖苷化、酯化，A环中加入双键，A环的开环等；针对13位双键进[50]行的修饰；28位羧基的修饰，例如：酰胺化，酯化，糖苷化等。国内外许多对五环三萜类化合物的结构修饰研究如下：1）以齐墩果酸为母核进行结构改造。有研究以齐墩果酸为母核，通过3位氧化、成肟、乙酰化及28位酯化反应，并以3-氧代齐墩果酸为母核，通过2位甲酰化、环合等反应，合了一系列化合物，筛选出多种具有显著抗肿瘤活性衍生物。2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oicacid(CDDO)为齐墩果酸衍生物，能抑[51-52]制多种肿瘤增殖且其抑制肿瘤细胞增殖的活性高于齐墩果酸。2）以桦木酸为母核进行结构改造。桦木酸还原所得的二氢桦木酸；桦木酸及二氢桦木酸的C3位轻基进行结构改造，得到一系列桦木酸衍生物，这些化合物都有显著[53]的抗HIV活性。3）以18β甘草次酸为母核的结构改造。当对其C3烷氧化亚基取代且C30有游离的羧基时，[54]可以提高其抑制肿瘤细胞增殖的活性。4）以熊果酸为母核的结构改造。保留12位双键不变，当3位为羰基、28位与苄胺形成5 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系[55]的酰胺化合物对HeLa、SKOV3细胞的抑制活性较熊果酸显著提高。1.4五环三萜类化合物抗肿瘤作用机制的研究进展1.4.1诱导细胞凋亡[56]细胞凋亡由基因控制的细胞自主的有序的死亡，受细胞内外多种因素的影响。细胞[57]凋亡是一个主动过程，涉及一系列基因的表达、激活以及调控等的作用。[33]Zhang等利用CCK-8法检测齐墩果酸对细胞增殖抑制率，用Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态，用AnnexinV/PI双染色后流式细胞仪检测细胞凋亡，并应用实时荧光定量RT-PCR和Westernblot方法分别检测相关蛋白表达水平。[58]Zheng等用齐墩果酸衍生物3β羟基12齐墩果酸27乌苏酸（ATA）诱导HeLa细胞凋亡。ATA处理HeLa细胞的线粒体跨膜电位明显下降，可引起凋亡介质如凋亡因子和细胞色素C释放到细胞质，直接或间接激活Caspase家族成员，最终导致细胞凋亡。[59]Shyu等研究OA和UA是通过激活Caspase-3和-9活性而诱导细胞凋亡。激活的激活caspase-3可以裂解PARP，导致PARP失活，阻碍DNA修复和诱导细胞凋亡。OA和UA还通过降低NF-κB亚基（pp65）的磷酸化，降低NF-κB的活性，抑制下游Bcl-2和IAP蛋白表达而诱导HuH-7细胞凋亡。1.4.2阻遏细胞周期通常将从细胞分裂产生的新细胞生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束所经历[60]的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞受到细胞内多种因子调控。齐墩果酸衍生物2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oicacid（CDDO）在中等浓度（0.02-2μM）时，可以影响细胞周期调控相关蛋白cyclins、MYC、p21、p27的表达，阻断[61][62]DNA合成和细胞周期进程，从而抑制增殖、诱导分化。Hsu等发现乌苏酸可以通过激活CDK2、4、6，降低cyclinD1、cyclinD2和cyclinE的表达，从而阻遏A549细胞于G0/G1期。1.4.3抗肿瘤细胞侵袭肿瘤细胞由其原发部位侵袭另一部位或器官，并在转移处繁殖生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤，这一过程即为转移。侵袭是肿瘤转移的前奏，转移是侵袭的继续和结果。转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是影响肿瘤治疗的主要因素，所以抑制肿瘤迁移也[63]是治疗肿瘤的重要途径。[64]马洋等发现不同浓度齐墩果酸作用下，HeLa细胞的MMP-2和MMP-9的表达均有所下降，且呈一定的剂量依赖性，抑制HeLa细胞的侵袭。另有研究发现熊果酸、甘草次酸、[65]18β-甘草次酸、乌苏酸和齐墩果酸等多种五环三萜类化合物都有阻遏肿瘤细胞侵袭作用。6 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系1.5Akt1与肿瘤的研究现状Akt已被定义为癌基因，是存在于人类染色体中的鼠类胸腺瘤病毒(Akt8)致癌基因的同[66]源物。Akt基因有Akt1/PKBα，Akt2/PKBβ，Akt3/PKBγ3种亚型，分别由3种不同的基因[67]编码。它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，处于PI3K/Akt信号转导通路的核心部位。Akt由C端调节结构越，N端PH结构域和中间催化结构域三部分组成。C端调节域有Akt活化所必需的Ser473位点；N端PH结构域可以介导Akt活化后的质膜转位过程；中间催化结构域有Akt活化所必需的Thr308位点。Akt激酶在促进细胞增殖、生长，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移、[68]侵袭，促进血管生成，抵抗化疗和放疗等方面起重要作用。PI3K/Akt通路(又称Akt或PKB通路)是一条酪氨酸激酶级联信号传导通路，是细胞生存通路之一。在多种肿瘤组织如卵巢癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺[69]癌、子宫内膜癌等中都有Akt异常表达和活化。目前国内外关于PI3K/Akt信号通路与[70]药物耐药性关系的研究越来越多，并且被认为是化疗耐药治疗的新靶点。许多研究表明化疗药物可增加Akt活化水平，使肿瘤细胞产生药物化疗耐受，深入研究Akt作用机制，可为肿瘤基因治疗、抗肿瘤药物开发提供新靶点。1.6研究内容及目的意义我国的恶性肿瘤发病率日趋增高，严重威胁着人类健康，药物治疗在恶性肿瘤的三疗法中占有重要地位，所以抗肿瘤药物的研发迫在眉睫，寻找新型有效的抗肿瘤药物成为目前国内外关注的热点。五环三萜类具有显著的抗肿瘤活性，抑制癌细胞增殖和生长，诱导分化和细胞凋亡等作用。其具有复杂的化学结构，以其为母核进行修饰和改造，获得创新或更强抗肿瘤活性的先导化合物是国内外抗肿瘤药物研究的焦点。Akt1是Akt家族成员之一，处于PI3K/Akt信号转导通路的核心部位。激活的Akt1可以磷酸化多种蛋白如BAD、MDM2、GSK3β和促凋亡蛋白FOXOs蛋白质来调节细胞的生长、代谢、生存和肿瘤发生。临床上的许多药物以Akt1为靶点，可以抑制多种肿瘤生长。获得PI3K/Akt通路抑制剂是目前研究的热点之一，并被认为是癌症治疗的极有效途径之一。本课题组前期对40种18β-甘草次酸和齐墩果酸衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选，比较不同取代位置及官能团结构与抗肿瘤细胞增殖作用的关系，筛选出活性显著化合物4和5，初步阐明化合物通过caspase途径诱导人肝癌细胞Bel-7404细胞凋亡。本课题在此基础上，进一步探明其抗肿瘤作用的分子机制，从而达到优化分子结构、探明药物作用的信号通路、寻找潜在的药物靶分子的目标，为开发研制新型五环三萜抗肿瘤药物奠定物质基础，提供7 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系理论依据。本课题研究内容包括以下方面：1）化合物4、5对K562细胞增殖、细胞形态学、细胞周期的影响；2）利用Westernblot方法检测化合物4、5对Bcl-2、Bax和PARP蛋白影响。利用Incellanalyzer实验和Westernblot实验，检测Akt1从细胞质中转到细胞膜上效率和pAkt1蛋白的表达。深入研究化合物4、5抗肿瘤药物的作用机制和作用靶点提供实验依据。3）构建重组载体pLJM1-Akt1，用0.6μg/mL的嘌呤霉素进行筛选出Akt1高表达株；利用MTT比色法检测目的化合物其细胞毒性作用，研究蛋白激酶B（Akt1）与目的化合物诱导肿瘤细胞凋亡的相关性，为将来肿瘤治疗提供新的作用靶点。8 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系第二章齐墩果酸衍生物体外抗肿瘤实验2.1引言前期工作利用MTT法对40种齐墩果酸及18β-甘草次酸衍生物经体外抗肿瘤活性筛选后，筛选出了活性显著化合物4、5并初步进行了诱导细胞凋亡的信号通路的研究，本研究进一步研究化合物抗肿瘤细胞增殖机制，阐明化合物作用的信号通路，增加与Akt1的作用机制，以及与细胞凋亡的关系，发现药物的靶位点，为下一步抗肿瘤新药的研究奠定理论基础。2.2材料、试剂和仪器2.2.1细胞株K562细胞人红白血病细胞（humanleukemiaK562cell），来源于慢性粒细胞白血病病人的细胞系，悬浮生长，由本实验保存。2.2.2材料2-氨基嘧啶齐墩果酸（化合物4）和1，2-噁唑齐墩果酸（化合物5）结构如图2.1。图2.1化合物4、5的化学结构A：化合物4的化学结构；B：化合物5的化学结构Fig.2.1Chemicalstructureofcompound4andcompound5A:Chemicalstructureofcompound4;B:Chemicalstructureofcompound52.2.3试剂试剂名称公司Akt1抗体CellSignaling公司Bcl-2抗体Epitomics公司Bax抗体Epitomics公司FBSThermo公司Hoechst33342碧云天生物技术研究所9 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系MTTSigma公司pAkt1抗体Abcam公司PARP抗体CellSignaling公司PI碧云天生物技术研究所RPMI-1640Gibco公司2.2.4仪器仪器名称公司纯水系统Millipore公司荧光倒置显微镜日本奥林巴斯倒置显微镜重庆光仪CO2恒温培养箱Thermo公司紫外分光光度仪日本Hitachi凝胶成像仪GeneGenius酶标仪TECAN高速冷冻离心机日本Hitachi流式细胞仪BectonDickinson公司蛋白电泳仪Bio-Rad公司转膜仪Bio-Rad公司红外荧光扫描成像仪LI-COR公司台式低温离心机贺利氏超净台Boxun公司二氧化碳培养箱德国Heraeus公司超低温冰箱NUAIRE电子天平赛多利斯公司InCellAnalyzer1000美国GEHealthcar2.3实验方法2.3.1样品的配制用乙醇和DMSO配制化合物4、5母液，并控制化合物实验时溶剂浓度不大于1%。将10 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系配制好的样品用培养基稀释，浓度设置为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、-4120μM。阳性对照药物紫杉醇用DMSO溶解后再用培养基稀释，浓度分别为3.2×10μM、-3-2-13.2×10μM、3.2×10μM、3.2×10μM、3.2μM和32.0μM。2.3.2细胞培养将K562细胞培养于含10%FBS的RPMI-1640培养基中（谷氨酰胺、1.0mmol丙酮酸钠、10mmolHEPES（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonicacid）），于37℃、5%CO2饱和湿度的状态下培养。2.3.3化合物4、5对K562细胞毒作用1）用含10%FBS的RPMI-1640培养液培养K562细胞，37℃，5%CO2条件下常规传代培养；42）取对数增殖期的细胞，用滴管轻轻吹起，计数后用培养液稀释成1.5×10/mL细胞悬液。取190μL接种于96孔板，后加入各浓度梯度的目标化合物4、5各10μL，每孔培养液总体积为200μL。溶剂对照组每孔加入10µL1%DMSO，空白对照组加200µL培养液；3）药物处理72h后，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。待针状结晶形成后，3000rpm离心10min后弃上清，每孔加入150µLDMSO，慢摇10min，使结晶充分溶解。用酶标仪测定波长490nm处吸光度，以空白对照组调零。实验平行重复三次。按下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=1-[(OD实验组-OD空白对照组)/（OD细胞对照组-OD空白对照组）]×100%2.3.4Hoechst33342荧光染色Hoechst33342荧光染色步骤按碧云天生物技术研究所试剂盒说明书进行；1）细胞接种于96孔板，用20µM、40µM化合物4、5处理K562细胞24h；2）在细胞上滴加0.5-10μg/mLHoechst33342工作液，37℃培养30min；3）以紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察。2.3.5流式细胞术分析化合物4、5对K562细胞周期的影响51）取对数生长期的K562细胞，轻轻吹起，计数后铺5×10细胞于6cm培养皿，加40µM的化合物4、5，一瓶作为阴性对照。37℃、5%CO2饱和湿度状态下培养24h；2）收集细胞：用滴管把K562细胞轻轻吹起，转移至15mL离心管中，1000rpm离心11 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3min，用PBS洗涤细胞两次；3）用150µLPBS重悬细胞，用枪头轻轻吹匀后加入350µL无水乙醇溶液（-20℃预冷），使无水乙醇终浓度为70%，混匀后放置-20℃过夜；4）细胞1000rpm离心5min后弃乙醇，用500µLPBS洗涤细胞一次；5）加入500µLPBS重悬细胞，加入RNaseA，使其终浓度为0.25mg/mL，37℃，反应30min；后加入10µLPI染色液，室温避光染色30min；6）混匀细胞，200目筛过滤细胞后上流式仪分析。2.3.6提取细胞总蛋白51）取对数生长期的K562细胞，轻轻吹起，计数后铺5×10细胞于6cm细胞培养皿，加入0µM、20µM、40µM、60µM的化合物4、5，37℃、5%CO2饱和湿度状态下培养36h；2）1000rpm，5min收集细胞，加入1mLPBS洗涤2次，加入100µL细胞裂解液，冰上裂解30min；3）4℃，12000rpm离心30min，取上清。2.3.7细胞总蛋白定量（BCA蛋白浓度测定试剂盒）1）取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL；2）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液；3）将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20μL；4）用标准品稀释液适当稀释样品，取20μL加到96孔板中；5）各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min；6）测定595nm的吸光度。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。2.3.8WesternBlot检测方法1）将提取的蛋白样品与5×SDS上样缓冲液混合后，沸水煮8min；2）12000rpm离心3min。配制12%SDS-PAGE凝胶，按蛋白定量结果加样。浓缩胶80V，分离胶120V进行电泳；3）电泳结束后，根据预染Marker判断目的蛋白所在位置，裁取适当大小的凝胶并且按照凝胶大小剪PVDF膜和6层滤纸；4）转膜时从负极到正极依次是经转膜液浸湿的三层滤纸、凝胶、甲醇预先活化好的12 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系PVDF膜、转膜液浸湿的三层滤纸，放置过程无气泡，放入转膜仪槽中，4℃，100V转移2h；5）提前配制好5%牛奶封闭液，转膜结束后取出PVDF膜，放入封闭液中，室温封闭1h；6）用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，洗涤3次，每次10min，去除多余的封闭液，加入5mL经TBST稀释的一抗，4℃孵育过夜；7）回收一抗，用TBST洗涤膜3次，每次10min。加入5mL经TBST稀释的二抗，室温摇动孵育2h；8）回收二抗，再用TBST洗涤膜3次，每次10min。然后用LI-COROdyssey红外荧光扫描成像，实验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参并在相同条件下重复三次。2.3.9INCellAnalyzor分析方法利用Incellanalyzer膜点分析模块，监控Akt1从细胞质到细胞膜的迁移情况。膜点分析模块可以识别细胞膜，在细胞周围的EGFP荧光强度累积可以用分析参数识别。1）稳定表达Akt1-EGFP的CHO细胞（中国仓鼠细胞）种植于96孔板；2）培养24h后，加入化合物4、5使其终浓度为1µM、10µM、20µM继续培养1h；3）然后加入16.7nM胰岛素，处理10min，固定后Akt1膜易位通过荧光显微镜观察并进行INCellanalyzer分析。2.4实验结果2.4.1化合物4、5对K562细胞毒作用采用MTT法分析化合物4、5对K562细胞增殖的影响，结果见图2.2。实验结果显示化合物4、5对K562细胞具有显著的抑制作用并呈剂量依赖性。13 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.2紫杉醇、化合物4、5对K562细胞浓度依赖性抑制的作用A：紫杉醇处理K562细胞72h；B：化合物4、5处理K562细胞72hFig.2.2EffectsofPaclitaxel,compound4andcompound5onthegrowthofK562cellsinadose-dependentmannerA:K562celltreatedwithpaclitaxelfor72h;B:K562celltreatedwithcompound4andcompound5for72h2.4.2Hoechst33342荧光染色结果为了进一步研究化合物对K562细胞形态的影响，本论文采用了Hoechst33342荧光染色的方法。实验结果显示，化合物处理后细胞出现了典型的凋亡现象，如箭头所指，可以观察到凋亡小体和染色质的固缩，结果见图2.3。14 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.3化合物4、5处理24h后K562细胞后形态学变化（200×）A：未经处理的K562细胞；B：化合物4（20μM）处理K562细胞；C：化合物4（40μM）处理K562细胞；D：化合物5（20μM）处理K562细胞；E：化合物5（40μM）处理K562细胞。凋亡小体如红色箭头所示Fig.2.3MorphologicalchangesofK562cellfollowingtreatedwithcompound4andcompound5for24h(200×)A:Controlcells;B:cellstreatedwithcompound4(20μM);C:cellstreatedwithcompound4(40μM);D:cellstreatedwithcompound5(20μM);E:cellstreatedwithcompound5(40μM).Apoptoticbodiesareindicatedbyredarrows2.4.3流式细胞术检测细胞周期实验结果很多研究表明抑制细胞增殖往往伴随着细胞周期的阻滞，采用流式细胞术检测化合物对细胞周期的影响。化合物4、5分别以40µM作用于K562细胞24h后，检测对其细胞周期的影响，结果显示化合物处理后G1期的细胞明显增加，而S期的细胞比例减少，G1期细胞数量由29.89%分别增加到41.65%和42.15%，由此推断化合物使细胞周期阻滞在了G1期，实验结果如图2.4。15 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.4化合物4、5对细胞周期影响A：未处理的K562细胞；B：化合物4（40μM）处理K562细胞；C：化合物5（40μM）处理K562细胞Fig.2.4Effectsofcompound4andcompound5oncellcycleA:Controlcells;B:cellstreatedwithcompound4(40μM);C:cellstreatedwithcompound5(40μM)2.4.4蛋白定量结果分析用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），对提取的化合物4、5不同浓度处理的K562细胞总蛋白含量进行测定。根据蛋白标准品的已知浓度与其测定的吸光值做2标准曲线，其中R代表两者相关系数，R值越接近1则代表可靠性越高，根据标准曲线算出待测样品浓度。图2.5是一次具有代表性的BCA法测定蛋白浓度时绘制的标准曲线，结果得2出本次实验测得R为0.995，结果可靠。根据所得线性函数计算得出蛋白浓度，乘以测定时稀释的倍数即为样品总蛋白浓度。16 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.5蛋白浓度测定标准曲线Fig.2.5Thestandardcurveofdeterminationofproteinconcentration2.4.5WesternBlot实验结果本文利用WesternBlot的方法，检测了化合物4、5以20、40、60μM处理K562细胞36h后Bcl-2、Bax、PARP、Akt1等蛋白的变化情况，结果如图2.6、图2.7及图2.8。图2.6WesternBlot检测化合物4处理K562细胞对Bcl-2、Bax、PARP蛋白的表达影响Fig.2.6TheproteinexpressionofBcl-2,Bax,PARPaftertreatedwithcompounds4detectedbyWesternBlot17 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.7WesternBlot检测化合物5处理K562细胞后对Bcl-2、Bax、PARP蛋白的表达影响Fig.2.7TheproteinexpressionofBcl-2,Bax,PARPaftertreatedwithcompounds5detectedbyWesternBlot图2.8WesternBlot检测化合物4、5处理K562细胞36h后对pAkt1蛋白的表达影响Fig.2.8TheproteinexpressionofpAkt1aftertreatedwithcompounds4,5detectedbyWesternBlot2.4.6Incellanalyzer在PI3K/Akt信号通路中，除了PI3K之外，Akt也是一个抗肿瘤药筛选的重要靶标。CHO中的Akt1-EGFP在未受到刺激时，绿色荧光呈胞膜上形成高亮度的荧光颗粒，通过统计这种荧光颗粒的数量及面积就可以表征Akt的活化水平。本文利用了Incellanalyzer分析了化合物4、5处理CHO后Akt1-EGFP细胞内分布情况，结果如图2.9及图2.10。18 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.9OA、化合物4、5对CHO细胞Akt1-EGFP易位的影响A：未经处理CHO细胞(DMSOcontrol)；B：Insulin(16.7nM)处理CHO细胞；C：wortmannin(1μM)处理的CHO细胞；D-L：化合物4、5、OA分别以1、10、20μM处理细胞1h后用insulin(16.7nM)刺激10minFig.2.9EffectsofOA,compound4andcompound5onthetranslocationofAkt1A:cellstreatedwithDMSO;B:cellstreatedwithInsulin(16.7nM)only;C:cellstreatedwithwortmannin(1μM);D-L:cellstreatedwithOA,compound4,compound5in1,10,20μMfor1hfollowedbystimulationwithinsulinfor10min19 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图2.10OA、化合物4、5处理CHO细胞后膜上荧光颗粒的数量变化情况Fig.2.10TheamountofEGFPfluorescenceafterCHOcellstreatedwithOA,compounds4andcompound5atcellmembrane2.5讨论前期通过对齐墩果酸的体外抗肿瘤活性实验，筛选出活性显著的齐墩果酸氮杂环衍生物4、5。目前国内外对齐墩果酸氮杂环衍生物的合成以及抑制肿瘤细胞增殖机制研究的较少，其中化合物4是未见文献报道的新化合物，因此本论文选择齐墩果酸氮杂环衍生物4、5，进一步研究抑制人慢性髓性白血病K562细胞增殖的机制。本论文利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测化合物4、5对K562细胞的细胞毒性作用，图2.2结果显示化合物4、5对K562通过浓度依赖的方式抑制K562的增殖；IC50值分别为32.686μM和39.252μM。细胞凋亡过程中会出现许多典型的形态学特征，如凋亡小体，染色质固缩以及核断裂[56]等。Hoechst33342染料可以很明显的区分凋亡细胞和正常的细胞。凋亡细胞的细胞膜对Hoechst33342摄取量增高，又由于染色体高度浓缩，Hoechst33342与之结合增强，因此20 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系染色呈强蓝色荧光，正常细胞只呈微弱荧光。化合物4、5处理K562细胞24h后，用Hoechst33342工作液染30min，于荧光显微镜下观察细胞形态的变化。图2.3结果显示为化合物处理的细胞明显区别于未处理细胞，出现凋亡小体、核固缩、核裂解等。初步推测目的化合物通过凋亡途径抑制K562细胞增殖。[71-72]很多研究表明抑制细胞增殖往往伴随着细胞周期的阻滞，采用流式细胞术检测化合物对细胞周期的影响。图2.4实验结果显示化合物4、5以40μM处理K562细胞24h后，G1期细胞数量由29.89%分别增加到41.65%和42.15%。由此可见，化合物4、5抑制K562细胞增殖与细胞周期阻滞于G1期有关。本研究进一步对其作用的分子机制进行研究，寻找其作用的信号通路及作用靶点。细胞凋亡过程中，除有细胞形态学变化外，细胞内的多种调控基因也被激活从而发挥生物学[73]活性。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡途径中发挥作用中重要作用，根据其在细胞凋亡中的作用，分为抗凋亡蛋白（如Bcl-2和Bcl-xL）和促凋亡蛋白（如Bax，Bad和Bid）。Bax是Bcl-2蛋白的同源物，大多数在细胞质中与Bcl-2形成异源物质，使Bcl-2失活，有效的抑制Bcl-2[74-75]抗凋亡功能。当Bax的表达量增加，生成同二聚体时，可以加速细胞凋亡。PARP是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，具有保持染色体结构完整、参与DNA复[76]制和转录的功能,在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发挥作用。PARP在DNA损伤断裂时被激活，识别并结合到DNA断裂部位，从而保护裸露的DNA末端免遭核酸酶的分解，[77]在许多细胞凋亡（生存）或死亡过程中发挥重要作用。本研究中，证明Bcl-2的表达下降，Bax的表达增加，与化合物4、5诱导细胞凋亡密切相关。PARP蛋白（116kD）可被caspase3剪切成羧基端的催化结构域(89kD)和氨基端的DNA结合结构域（24kD），从而使PARP失[59]去其酶活力。本研究前期工作发现化合物4、5处理Bel-7404细胞后，诱导细胞procaspase-3蛋白裂解，提高caspase3活性。本研究发现中化合物4、5处理K562细胞后，PARP蛋白（116kD）被剪切生成89kD、24kD（未显示）如图2.6及2.7，初步推测与caspase3活性提高有关。Akt1是Akt家族成员之一，Aktl不但影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。磷酸化的Aktl促进纤维肉瘤细胞、成纤维细胞等多种癌细胞的侵袭能[78-80]力。有研究发现在乳腺癌中也发现Aktl异常表达，并且在乳腺癌的迁移和侵袭中发挥[81]重要作用。有研究报道活化Akt1需要两个条件，首先招募胞浆中Akt向细胞膜转位，继而促使胞膜上的PI3K依赖性激酶-1（PKD1）磷酸化Akt的Thr308位点，同时促使PI3K依赖[82]性激酶-2(PDK2)磷酸化Akt的Thr308位点Ser473位点。本研究发现中化合物4、5处理细胞后，通过westernblot分析发现化合物可以显著抑制K562细胞的pAkt1表达，如图2.8。IN21 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系cellanalyzer实验中使用稳转表达Akt1-EGFP的CHO细胞中来定位Akt1在细胞内的分布情况，化合物4、5处理细胞1h后，加入16.7nM胰岛素，处理10min。利用InCellAnalyzer1000平台，高通量的捕捉并统计荧光标记的蛋白的数量及位置变化，结果如图2.9及图2.10所示。实验结果表明OA、化合物4、5以浓度依赖的方式抑制胰岛素刺激Akt1转移到膜上。综上所述，化合物4、5对人慢性髓性白血病K562细胞有较强的抑制作用，并呈浓度依赖性。实验结果显示，化合物4、5诱导细胞凋亡可能与线粒体途径以及PI3K/Akt途径有关，并可以使K562细胞的周期阻滞在G1期，但是其更深入的分子机制，仍需要进一步的探究。22 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系第三章过表达Akt1细胞株K562、Bel-7404细胞的构建及鉴定3.1引言本部分选用pLJM1慢病毒载体（结构如图3.1）构建重组载体pLJM1-Akt1，再与两种包装载体psPAX2和pMD2.G（结构如图3.2）共转染至HEK293T细胞，得到慢病毒颗粒，再将得到的慢病毒感染K562、BEL7404细胞中。本部分实验旨在运用慢病毒载体的优势构建Akt1高表达细胞株K562/Akt1、Bel-7404/Akt1，为寻找和筛选更加高效、低毒、特异性强的Akt1抑制剂和逆转多药耐药癌细胞凋亡的后续研究提供模型。图3.1pLJM1载体结构示意图Fig.3.1StructureofpLJM1plasmid图3.2包装载体（psPAX2、pMD2.G）结构示意图Fig.3.2StructureofpsPAX2,pMD2.G23 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.2实验材料、试剂和仪器3.2.1实验材料pLJM1及其包装质粒psPAX2、pMD2.G，人肾上皮细胞293T细胞、K562细胞和Bel-7404细胞，大肠杆菌stbl3、DH5α菌株均为本实验室保存。3.2.2实验试剂试剂名称公司限制性内切酶Takara公司PCR引物上海英骏公司KOD-plus-neo高保真PCR酶Toyobo公司T4DNA连接酶Takara公司胶回收试剂盒捷瑞生物工程有限公司质粒抽提试剂盒捷瑞生物工程有限公司核酸电泳级琼脂糖Biowest公司酵母抽提物（YeastExtract）Oxoid公司蛋白胨（Tryptone）Oxoid公司氨苄青霉素(氨苄青霉素ampicillin)华东医药股份有限公司MEM培养基Gbico公司二甲基亚砜(DMSO)Sigma-Aldrich公司十二烷基磺酸钠（SDS）Thermo公司考马斯亮蓝(G-250)Sigma-Aldrich公司考马斯亮蓝(R-250)Amresco公司甲醛Sigma-Aldrich公司蛋白预染MarkerFermentas公司TEMED华东医药有限公司AP华东医药有限公司胰蛋白质酶Promega公司吐温20(Tween-20)江苏碧云天公司进口分装TrizolInvitrogen公司24 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.2.3实验仪器仪器名称公司CO2恒温培养箱Thermo公司PCR仪Eppendorf公司核酸电泳仪Bio-Rad公司凝胶图像处理系统(Fine-doX3)上海天能科技有限公司台式离心机(AllegraX-22R)Eppendorf公司紫外分光光度计Beckman公司蛋白电泳仪Bio-Rad公司转膜仪Bio-Rad公司光学显微镜Nikon公司超低温冰箱(Forma-86C)Thermo公司细菌培养摇床(THZ-C)上海智城分析仪器制造有限公司制冰机(XB70)SCOTSMAN公司超净工作台苏州净化设备厂离心机BECKMAN公司超纯水系统Milli-Q公司DU800紫外分光光度计Beckman公司移液器Eppendorf电热式全自动高压蒸汽灭菌锅上海医用电子仪器厂3.3实验方法3.3.1引物设计利用VectorNTI8.0软件设计Akt1基因序列扩增引物，在引物前分别加AgeI、EcoRI酶切位点，引物序列见表3.1。表3.1Akt1引物引物名称序列（5’-3’）Akt1-FormerprimerCGCACCGGTATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAAkt1-ReverseprimerCCGGAATTCTCAGGCCGTGCCGCTGG3.3.2模板制备1）当Bel-7404细胞密度达90%时，弃培养基，用1mLPBS清洗细胞两次；25 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系2）根据细胞量确定Trizol试剂的量，加入1mL的Trizol试剂，培养皿放在冰上裂解10min，用移液枪将液体吸至RNasefree的1.5mL离心管中，（加入Trizol后可放置-80℃长期保存）；3）12000rpm，4℃离心10min，弃沉淀。加入0.2倍体积（200μL）的氯仿，剧烈颠倒晃动15s，静置3min（禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂）；4）12000rpm，4℃离心15min，离心后溶液分三层。小心吸取上层溶液，勿吸入中间白色沉淀。加等体积（500μL）异丙醇，混匀后-20℃沉淀过夜；5）12000rpm，4℃离心15min，去除上清液。加入1mL预冷的75%乙醇悬浮沉淀，洗涤2遍；6）8000rpm，4℃离心5min，去除上清液，室温干燥沉淀5min（RNA样品不能过于干燥，否则很难溶解）。加入20μLDEPC水溶解，短暂离心，-80℃保存备用；7）取2μL产物进行RNA电泳，并测定样品浓度。3.3.3RNA反转录成cDNA制备总RNA用TOYOBO试剂盒转录试剂盒合成第一链cDNA。具体操作步骤如下：取2μg总RNA于无核酸酶的离心管，65℃变性，5min，反应后立即放冰上冷却。反应体系如下：溶液体积5×RTbuffer4μLRTEnzymeMix1μLPrimermix1μLTotalRNA2μgRNase-freeddH2OUpto20μL1）逆转录条件：37℃，进行15min的逆转录反应；2）酶失活条件：98℃，酶失活反应5min，反应结束后放-20℃保存。3.3.4目的片段Akt1的PCR扩增根据设计的引物PCR扩增Akt1基因序列，PCR体系和PCR反应程序见表3.2、3.3，反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳。26 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系表3.2PCR体系（25μL）溶液体积10×KODBuffer2.5μLdNTPs（2mM）2.5μLAkt1-Formerprimer（10μM）0.75μLAkt1-Reverseprimer（10μM）0.75μLMgSO4（25mM）1.5μLddH2O15.5μLcDNA1μLDNA合成酶（KOD-plus-neo）0.5μL表3.3PCR反应条件步骤温度，时间预变性94ºC5min变性98ºC10s30×退火60ºC30s延伸68ºC1min延伸68ºC5min3.3.5PCR产物回收对进行1%琼脂糖凝胶电泳的PCR产物割胶回收（天根试剂盒），具体操作步骤如下：1）柱平衡：向离心柱中加250μLBufferBL，12000rpm离心30s，倒掉废液，离心柱放回收集管中；2）100μgPCR产物中加入300μL的BufferQG-A，65℃熔化；熔化后加入150μLBufferQG-B，溶液转移至离心柱，12000rpm离心3min，倒掉废液，离心柱放回收集管中；3）加入500μLBufferW2，12000rpm离心1min，倒掉废液，离心柱放回收集管中；4）加入700μLBufferW2，12000rpm离心1min，倒掉废液，将离心柱放回收集管中；5）空管，12000rpm离心2min，去尽BufferW2；6）加入40μLBufferTB，静置3-5min，12000rpm离心2min；27 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系7）取2μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。3.3.6质粒pLJM1的提取取5μL菌液接种于5mLLB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素），于37℃，220rpm摇床培养12h，用试剂盒提取pLJM1质粒（天根试剂盒）。1）柱平衡：吸附柱CP3中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心30s，倒掉废液，离心柱放回收集管中；2）取3-5mL菌液加入离心管，12000rpm离心3min，去上清；3）加入250μL溶液Ⅰ，使用移液器或涡旋振荡彻底悬浮细菌沉淀；4）加入250μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次，充分裂解（此时的菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应该超过5min）；5）加入350μL溶液Ⅲ，立即温和地混匀后会出现白色絮状沉淀。然后12000rpm离心10min；6）用移液器将上清液转移至吸附柱CP3中（注意尽量不吸出白色沉淀），12000rpm离心3min，倒去废液，并将吸附柱CP3放回收集管中；7）加入600μL的漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒去废液，将吸附柱CP3放回收集管中；8）重复操作步骤7；9）空管，12000rpm离心2min；10）加入20μL的EB洗脱缓冲液，静置2min，12000rpm离心3min。3.3.7双酶切用限制性内切酶AgeI和EcoRI双酶切目的片段Akt1和载体pLJM1，37ºC水浴反应2.5h，反应后各取10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，反应体系见表3.4。表3.4酶切反应体系(40μL)溶液体积pLJM1或(Akt1PCR片段）30μLAgeI1.2μLEcoRI1.2μL10×OBuffer4μLddH2O3.6μL28 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.3.8酶切产物回收按照DNA凝胶回收试剂盒（捷瑞生物工程有限公司）操作说明对酶切产物进行割胶回收。1）切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，加入3倍凝胶体积的BufferDE-A于EP管，75℃加热10min直至凝胶块完全熔化；2）加入0.5倍体积BufferDE-A的BufferDE-B，混匀；3）将混合液转移到离心柱中，12000rpm离心30s，倒掉滤液，将离心柱重新放回2mL离心管；4）加500μLBufferW1，12000rpm离心30s，倒掉废液，将离心柱重新放回2mL离心管；5）加入700μLBufferW2后，12000rpm离心30s，弃废液；6）重复操作步骤5；7）将离心柱重新放回2mL离心管中，12000rpm离心2min。将离心柱置于干净1.5mL离心管中，往离心柱膜中央滴加20μL去离子水，静置5min。12000rpm离心30s，收集离心管液体。3.3.9T4链接酶连接将Akt1基因双酶切片段与载体pLJM1双酶切片段置于16℃进行连接重组，连接反应体系见表3.5。表3.5连接反应体系(20μL)溶液体积pLJM1片段6.4μLAkt1基因片段9.6μLT4DNAligase2μL10×T4DNAligaseBuffer2μL3.3.10转化1）将100μLE.colistbl3感受态细胞与连接产物混匀，冰上放置30min；2）42℃热激90s，立即放至冰上5min（切勿剧烈振荡）；3）于超净台加入1mL无抗性LB液体培养基，放37℃，220rpm摇床活化1h；29 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系4）3000rpm离心10min，弃上清留100μL左右菌液，用移液器轻轻吹打重悬菌体，并均匀涂布于LB（含100μg/mL的氨苄青霉素）平板上，于37℃培养箱中正面向上培养30min，然后倒置培养12-16h；5）培养12h后，挑取单克隆菌落，接种至5mLLB（含100μg/mL的氨苄青霉素)液体培养基中，于37℃，220rpm培养12h。3.3.11质粒PCR鉴定提取重组质粒，进行质粒PCR鉴定，PCR体系和反应程序见表3.6和表3.7。表3.6PCR体系（25μL）溶液体积10×PCRBuffer2.5μLdNTPs（10mM）0.5μLAkt1-Formerprimer（10μM）0.5μLAkt1-Reverseprimer（10μM）0.5μLddH2O19.5μL菌液1μLTaq酶0.5μL表3.7PCR反应条件步骤温度，时间预变性94ºC5min变性95ºC10s30×退火60ºC30s延伸72ºC1min延伸72ºC5min3.3.12双酶切鉴定提取重组质粒进行双酶切鉴定，操作步骤同3.3.7，酶切体系见表3.8。30 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系表3.8酶切反应体系(20μL)溶液溶液体积pLJM1/Akt12μLAgeI0.5μLEcoRI0.5μL10×OBuffer2μLddH2O15μL3.3.13测序鉴定提取重组质粒送至上海桑尼公司测序，测序引物为CMV。3.3.14pLJM1、pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G天根试剂盒质粒大抽1）柱平衡：取2.5mL的平衡液BL加入离心柱，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回收集管中；2）向离心管加入100mL菌液，8000rpm离心3min，尽量吸除上清，收集菌液；3）取8mL溶液P1（4℃预冷，预先加入RNaseA）加入到离心管中，悬浮菌液；4）取8mL溶液P2加入到离心管中，立即混匀，静置5min；5）取8mL溶液P4加入到离心管中，立即混匀，直至出现白色分散絮状沉淀。室温静置10min，8000rpm离心10min，使白色沉淀离至管底，取上清至过滤器CS1中，将滤液收集在干净的50mL的管中；6）取0.3倍滤液体积的异丙醇加入到滤液中，混匀后转移到离心柱CP6中；7）室温8000rpm离心2min，弃废液，将离心柱CP6重新放回收集管中；8）加入1mL漂洗液PW，静置3min，8000rpm离心2min，弃废液；9）重复操作步骤8；10）加入3mL无水乙醇，8000rpm离心2min，弃废液；空管，8000rpm离心2min；11）向离心柱的中央滴加1-2mL洗脱缓冲液，静置5min，8000rpm离心2min，收集滤液并置于-20℃保存；12）取2μL提取的质粒，进行1%琼脂糖凝胶电泳；取1μL提取的质粒，进行浓度测定。3.3.15pLJM1、pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G质粒浓度浓缩1）配制5MNacl和70%的乙醇；2）每1mL洗脱液加入0.42mL5MNacl以及1.42mL异丙醇混匀，室温静置5min，800031 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系rpm离心5min，小心吸取上清；3）用70%乙醇洗涤沉淀，室温8000rpm离心5min，小心弃乙醇；4）重复操作步骤3；5）室温干燥约10min，加入20μLTB缓冲液溶解沉淀；6）取1μL提取的质粒，进行浓度测定，其余放-80℃备用。3.4过表达Akt1的K562、Bel-7404稳定细胞株的构建及筛选3.4.1293T、K562、Bel-7404细胞培养人肝癌细胞Bel-7404细胞，属上皮细胞，贴壁生长，用含10%FBS的DMEM培养基培养。肾上皮细胞293T细胞是由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞，贴壁生长，用含10%FBS的DMEM培养基培养。人红白血病细胞K562细胞，来源于慢性粒细胞白血病病人的细胞系，悬浮生长，用用含10%FBS的RPMI-1640培养基培养。细胞每3-4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。3.4.2慢病毒包装1）293T用胰蛋白酶消化10s左右，用培养基终止消化，用滴管轻轻吹起，取适量体积细胞悬液进行细胞计数；52）取7.5×10个细胞接种10cm的培养皿中，当细胞长满50%左右，换无血清MEM培养基饥饿培养3h；3）取19μg质粒（10μgpLJM1/Akt1或10μgpLJM1、5.5μgpsPAX2、3.5μgpMD2.G）至500μL无血清MEM培养基中，混匀；取另一EP管中加入20μLTransfers至500μL无血清MEM培养基中，混匀，室温孵育5min。混合两EP管培养基（总体积1mL）混匀，室温孵育20min；4）将上述混合的培养基逐滴加入细胞中，轻轻混匀培养基。37℃，5%CO2培养箱中培养6h后换成10%FBS的DMEM培养基培养；5）24h后，观察293T细胞，约有30%左右的细胞死亡，此时收集培养基（已经有慢病毒产生）。继续加入6mL10%血清的DMEM培养基培养，24h后再收获一次病毒。将两次收获的病毒液合并，可用孔径为0.45μm的针头滤器过滤去除293T细胞，取上清感染K562、Bel-7404细胞或者-80ºC冻存。3.4.3病毒包装成功与否鉴定转染48h后，收集293T细胞蛋白，通过Westernblot检测是否包装成功pLJM1/Akt1慢病毒。32 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.4.4病毒侵染及稳定株的筛选1）取对数生长期的K562细胞、Bel-7404细胞，接种于10mL培养皿中；2）待细胞密度为50%左右，滴加4mL病毒液感染细胞；12h后第二次感染细胞，24h后换10%FBS的RPMI-1640和DMEM培养；3）感染后的K562细胞、Bel-7404细胞用0.6µg/mL的嘌呤霉素（puromycin）进行筛选。以未侵染K562细胞，Bel-7404细胞作为对照，使细胞3-5天内全部死亡的浓度为嘌呤霉素最佳用量。筛选的细胞每隔2天换含有嘌呤霉素RPMI-1640和DMEM培养基培养；4）转染48h后的293T细胞用1µg/mL的嘌呤霉素进行筛选。3.4.5Westernblot检测方法细胞筛选5-6次后，收集慢病毒感染的K562细胞、Bel-7404细胞及其未感染的K562细胞、Bel-7404细胞作为对照，进行Western-blot检测目的蛋白Akt1的表达情况。具体实验步骤如第二章2.3.8。3.4.6化合物4、5对过表达Akt1的Bel-7404和K562细胞细胞毒作用具体操作过程见第二章2.3.3。3.5结果3.5.1模板制备提取细胞Bel-7404细胞的总RNA，RNA电泳结果得到三条明显条带，分别代表28S、18S、5S大小的RNA，结果如图3.3。图3.3Bel-7404细胞中的总RNAFig.3.3ThetotalRNAintheBel-7404cell33 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.5.2目的产物扩增提取的RNA进行逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，取PCR产物2μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3.4图3.4目的片段Akt1的PCR扩增产物M：MarkerIII；泳道1、2：Akt1PCR扩增产物Fig.3.4TheamplificationproductsofAkt1M:MarkerIII;lane1,2:theamplificationproductsofAkt13.5.3目的片段Akt1和载体pLJM1双酶切目的片段Akt1和载体pLJM1经AgeI和EcoRI双酶切后，利用胶回收试剂盒回收，结果见图3.5。图3.5Akt1、pLJM1双酶切图M：DL15000；泳道1：pLJM1质粒；泳道2：Akt1片段Fig.3.5ThedoubledigestsproductofAkt1andpLJM1M:DL15000;lane1:pLJM1plasmid;lane2:Akt134 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系3.5.4重组质粒pLJM1/Akt1的质粒PCR鉴定目的片段Akt1和载体pLJM1双酶切后，经T4链接酶连接后，在无抗性的LB液体培养基中活化后涂至含有Amp抗性的LB固体培养基平板上，经12h左右挑取单克隆进行扩大培养，提取质粒进行质粒PCR鉴定。结果显示如图3.6，泳道1、2是阳性克隆，3为阴性克隆，阳性克隆经PCR后能扩增出片段，且片段大小在2000bp和1000bp中间，与预期目的片段Akt1的大小（1443bp左右）相符。图3.6重组质粒pLJM1-Akt1的菌落PCR鉴定图M：DL2000；泳道1、2：阳性克隆；泳道3：阴性克隆Fig.3.6TheverificationofmicrobialPCRofrecombinantvectorspLJM1-Akt1M:DL2000;lane1,2:positiveclone;lane3:negativeclone3.5.5重组质粒pLJM1/Akt1的酶切鉴定结果重组质粒pLJM1/Akt1经质粒试剂盒提取后，进行单酶切和双酶切鉴定，结果显示重组质粒经EcoRI酶切后得到一条条带，经AgeI和EcoRI双酶切后得到两条条带，且与目的片段Akt1大小（1443bp左右）以及pLJM1质粒大小（8083bp）相符，具体结果见图3.7。35 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图3.7重组质粒pLJM1-Akt1的酶切鉴定图M：DL15000；泳道1-3：AgeI和EcoRI双酶切产物；泳道4-6：EcoRI单酶切产物Fig.3.7ThedigestproductsofrecombinantntplasmidpLJM1-Akt1M:DL15000;lane1-3:AgeIandEcoRIdoubledigestsproductofrecombinantntplasmid;lane4-6:EcoRIdigestproductofrecombinantntplasmid3.5.6测序鉴定结果测序结果经NCBI比对显示重组质粒的目的片段Akt1碱基序列正确，结果见图3.8。36 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图3.8pLJM1/Akt1测序验证结果（NCBIBlast）Fig.3.8SequencingverificationofpLJM1/Akt1(NCBIBlast)3.5.7pLJM1与包装质粒共转染293T细胞经天根试剂盒大量抽提pLJM1以及pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G质粒后，按照一定的比例用脂质体法共转染至293T细胞进行病毒的包装。pLJM1质粒上带有EGFP荧光蛋白的标签，可产生绿色荧光蛋白，结果显示在荧光显微镜下能看到大量绿色荧光，结果见图3.9。37 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图3.9pJLM1质粒转染293T效率（100×）A：明场，B：EGFP荧光场Fig.3.9Theefficiencyof293TtransfectionwithpJLM1plasmidA:Brightfield;B:EmissionofEGFP3.5.8Westernblot检测包装的慢病毒收集转染48h后的293T细胞，加入细胞裂解液收集蛋白，通过Westernblot检测是否包装成功pLJM1/Akt1慢病毒，如图3.10中显示293T/Akt1细胞株中Akt1表达量明显高于野生型293T细胞，说明病毒包装成功。图3.10293T细胞中的Akt1表达量Fig.3.10TheexpressionofAkt1in293Tcell3.5.9Westernblot检测目的蛋白Akt1的表达经筛选得到稳定的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株后，收取Bel-7404/Akt1、Bel-7404细胞、K562/Akt1细胞和K562细胞，经细胞裂解液裂解、蛋白定量后，进行Westernblot检测目的蛋白Akt1的表达情况，Bel-7404/Akt1细胞株中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞，K562/Akt1细胞株中Akt1表达量明显高于野生型K562细胞结果见图3.11。38 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系图3.11Bel-7404和K562细胞中的Akt1表达量Fig.3.11TheexpressionofAkt1inBel-7404cellandK562cell3.5.10化合物4、5对过表达Akt1的K562细胞细胞毒作用利用MTT比色法检测目的化合物4、5对过表达K562细胞的细胞毒性作用。化合物4采用10-100μM，化合物5采用20-100μM的6个浓度。K562在不同浓度化合物下孵育72h后检测在490nm吸收值。结果显示化合物4、5对K562通过浓度依赖的方式抑制K562的增殖；IC50值分别为41.629μM和43.735μM。图3.12化合物4、5对过表达Akt1的K562细胞作用Fig.3.12Effectsofcompound4andcompound5onthegrowthofK562cellswhichoverexpressAkt1.3.6讨论PI3K/Akt通路(又称Akt或PKB通路)是一条酪氨酸激酶级联信号传导通路，是细胞生存通路之一。在多种肿瘤组织如卵巢癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、[69]子宫内膜癌等中都有Akt异常表达和活化。有研究发现胃癌AGS细胞中上调PI3K/Akt的表达可以导致P-gp相关及不相关药物耐药39 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系[83][84-85]。Simon等报道抑制Akt的活力可以促进多药耐药胃癌细胞凋亡，逆转耐药和增强胰[86]腺癌耐药株对吉西他滨的敏感性。Yuan等发现过度活化的Akt可以通过抑制凋亡信号激[87]酶(ASK)并且抑制ASK下游JNK和P38的活性，从而产生耐药性。Jin等发现乳腺癌细胞株MCF-7对紫杉醇、5-Fu以及阿霉素的耐药与PI3K/Akt的活性升高有关，而抑制PI3K/Akt可以逆转MCF-7的耐药性。本研究中过表达Akt1的K562细胞在不同浓度化合物下孵育72小时后检测在490nm吸收值。结果如图3.12显示化合物4、5也可以明显的抑制过表达Akt1的K562细胞的增殖，呈浓度依赖的方式，IC50值分别为41.629μM和43.735μM。初步阐明该化合物具有一定逆转肿瘤细胞耐药性的潜在作用。40 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系第四章结论与展望4.1结论为了进一步提高活性，降低对正常细胞的毒副作用，将齐墩果酸进行结构修饰后合成化合物4、5。本论文对化合物4、5进行体外抗肿瘤活性筛选，进行了初步的抑制肿瘤细胞增殖机制的研究，所得结论如下：1)利用MTT比色法检测化合物对K562细胞的细胞毒性作用。结果显示化合物4、5通过浓度依赖的方式抑制K562细胞的增殖，IC50值分别是32.686μM和39.252μM。2)Hoechst33342染料可以很明显的区分凋亡细胞和正常的细胞。化合物处理下，结果显示用化合物处理的K562细胞形态明显区别于对照组细胞，出现凋亡小体、核固缩、核裂解等。初步推测化合物4、5通过凋亡途径抑制细胞增殖。3)采用流式细胞术检测化合物对K562细胞周期的影响。结果显示化合物处理后G1期的细胞明显增加，而S期的细胞比例减少，推断化合物使细胞周期阻滞在了G1期。4）本论文利用Westernblot的方法和Incellanalyzer实验，发现化合物可以上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，裂解PARP蛋白，能抑制胰岛素刺激Akt1上膜磷酸化的功能，抑制pAkt1蛋白的表达。初步阐明了化合物诱导凋亡与线粒体细胞凋亡信号通路和和PI3K/Akt途径有关。5）筛选得到过表达Akt1的K562细胞、Bel-7404细胞，利用MTT比色法检测化合物对K562/Akt1细胞毒性作用。结果显示化合物4、5可以有效的抑制过表达Akt1的K562细胞的增殖，并呈浓度依赖的方式，IC50值分别为41.629μM和43.735μM。初步说明化合物4、5可能具有一定的抑制K562细胞过表达Akt1而产生的抗药性的作用。4.2创新点1）化合物4是新结构的齐墩果酸衍生物，本研究为该类型化合物的结构改造提供了方法学依据；活性筛选显示其具有显著的抑制肿瘤细胞增殖活性，并进行较深入的抗肿瘤作用机制研究，为抗肿瘤新药的研发提供了先导化合物和理论依据。2）本研究首次发现齐墩果酸衍生物化合物4具有抑制pAkt1表达的活性，从而诱导肿瘤细胞凋亡，并进一步阐明该化合物是通过抑制Akt1转运到细胞膜上而不能发挥其磷酸化来作用实现的。3）筛选出过表达Akt1稳转株，通过MTT实验结果初步阐明该化合物具有一定逆转肿瘤细胞耐药性的潜在作用。为寻找和筛选更加高效、低毒、特异性强的Akt1抑制剂和逆转多药耐药癌细胞凋亡的后续研究提供模型。41 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系4.3展望恶性肿瘤是危害健康的主要疾病之一，并且肿瘤发病率和死亡率在不断增加，抗肿瘤药物的研发成为当今研究热点之一。五环三萜类化合物具有复杂的化学结构，以其为母核进行结构修饰和改造，提高抗癌活性和生物利用度的研究，使其成为一类新型的天然抗癌新药受到越来越多的重视。PI3K/Akt信号通路与细胞药物耐药性息息相关，并且被认为是化疗耐药治疗的新靶点。许多研究表明化疗药物可增加Akt活化水平，使肿瘤细胞产生药物化疗耐受，深入研究Akt作用机制，可为肿瘤基因治疗、抗肿瘤药物开发提供新靶点。42 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系参考文献[1]P.HainautandA.Plymoth.Targetingthehallmarksofcancer:towardsarationalapproachtonext-generationcancertherapy[J].CurrOpinOncol,2013,25(1):50-51.[2]D.HanahanandR.A.Weinberg.Hallmarksofcancer:thenextgeneration[J].Cell,2011,144(5):646-674.[3]吴菲,林国桢,张晋昕.我国恶性肿瘤发病现状及趋势[J].中国肿瘤,2012,21(2):81-85.[4]D.J.NewmanandG.M.Cragg.Naturalproductsassourcesofnewdrugsoverthelast25years[J].JNatProd,2007,70(3):461-477.[5]G.M.Cragg,P.G.GrothausandD.J.Newman.Impactofnaturalproductsondevelopingnewanti-canceragents[J].ChemRev,2009,109(7):3012-3043.[6]Y.Kimura.Newanticanceragents:invitroandinvivoevaluationoftheantitumorandantimetastaticactionsofvariouscompoundsisolatedfrommedicinalplants[J].InVivo,2005,19(1):37-60.[7]D.Zhao,C.Qin,X.Fan,Y.Li,B.Gu.Inhibitoryeffectsofquercetinonangiogenesisinlarvalzebrafishandhumanumbilicalveinendothelialcells[J].EurJPharmacol,2013.[8]R.Liu,H.Zhang,M.Yuan,J.Zhou,Q.Tu,J.J.Liu,J.Wang.Synthesisandbiologicalevaluationofapigeninderivativesasantibacterialandantiproliferativeagents[J].Molecules,2013,18(9):11496-11511.[9]A.K.Pandurangan,P.Dharmalingam,S.K.Sadagopan,M.Ramar,A.Munusamy,S.Ganapasam.LuteolininducesgrowtharrestincoloncancercellsthroughinvolvementofWnt/beta-catenin/GSK-3betasignaling[J].JEnvironPatholToxicolOncol,2013,32(2):131-139.[10]C.Y.Acevedo-Morantes,M.T.Acevedo-Morantes,D.Suleiman-Rosado,J.E.Ramirez-Vick.EvaluationofthecytotoxiceffectofcamptothecinsolidlipidnanoparticlesonMCF7cells[J].DrugDeliv,2013,20(8):338-348.[11]D.Selimovic,H.E.Badura,A.El-Khattouti,M.Soell,B.B.Porzig,A.Spernger,F.Ghanjati,S.Santourlidis,Y.Haikel,M.Hassan.Vinblastine-inducedapoptosisofmelanomacellsismediatedbyRashomologousAprotein(RhoA)viamitochondrialandnon-mitochondrial-dependentmechanisms[J].Apoptosis,2013,18(8):980-997.[12]F.Yan,Y.LiuandW.Wang.MatrineinhibitedthegrowthofratosteosarcomaUMR-108cellsbyinducingapoptosisinamitochondrial-caspase-dependentpathway[J].TumourBiol,2013,34(4):2135-2140.43 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浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系附录主要试剂配制1）1MTris-HCl（pH6.8）取121.1gTris，加入约800mLddH2O，搅拌溶解；用浓盐酸调节至pH6.8，加ddH2O定容至1L；高温高压灭菌，室温保存。2）RNase-freewater(DEPC·H2O)以1:1000（v/v）比例在ddH2O中加入DEPC母液；避光静置24h，室温保存，使用前高温灭菌。3）PBSBuffer取0.20gKCl、8.00gNaCl、0.27gKH2PO4、1.42gNa2HPO4；加入800mLddH2O，搅拌溶解；用浓盐酸调节至pH7.4，定容至1L；高温高压灭菌，室温保存。4）1.5MTris-HCl（pH8.8）取181.7gTris，加入约800mLddH2O溶解；用浓盐酸调节至pH8.8，定容至1L；高温高压灭菌，室温保存。5）30%丙烯酰胺（W/V）取10gBIS、290.00g丙烯酰胺，加入约600mLddH2O溶解；定容至100mL，用0.45μm滤头滤去杂质，4℃避光保存。6）10%过硫酸铵（W/V）取0.10g过硫酸铵，加1mLddH2O，搅拌溶解，4℃储存。7）10%SDS（W/V）取10.00gSDS，加入约80mLddH2O，68℃加热溶解；用浓盐酸调节至pH7.2，定容至100mL，室温保存；8）50×TAEBuffer（pH8.5）取37.20gNa2EDTA·2H2O、24.20gTris，加入约800mLddH2O溶解；加入5.71mL醋酸，充分搅拌，定容至1L，室温保存。9）10×TBEBuffer（pH8.3）51 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系取108.00gTris、55.00g硼酸、7.44gNa2EDTA·2H2O；加入约800mLddH2O溶解，定容至1L，室温保存。10）5×SDS-PAGELoadingBuffer取0.50gSDS、25mgBPB，加入1MTris-HCl（pH6.8）1.25mL、甘油2.5mL；加ddH2O溶解并定容至5mL，室温保存，使用前加入250μl2-ME。11）5×Tris-GlycineBuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）取15.10gTris、、5.00gSDS94.00gGlycine，加入约800mLddH2O溶解，加ddH2O定容至1L，室温保存。12）RNALoadingBuffer取0.72mL去离子甲酰胺、0.26mL37%甲醛、0.16mL10×MOPS、40μl饱和溴酚兰、2μlEB母液（10mg/mL）、80μl灭菌甘油、303μlDEPC·H2O，混匀，4℃避光储存。13）5×TBSBuffer取12.11gTris、43.78gNaCl，加约800mLddH2O溶解；加ddH2O定容至1L，室温储存；14）10×MOPSBuffer（pH8.5）取4.18gMOPS，加约70mLDEPC·H2O溶解；用2NNaOH调节至pH7.0；加0.5MEDTA（pH8.0，DEPC·H2O配制）、1MNaOAc（DEPC·H2O配制）；加DEPC·H2O定容至100mL，用0.45μm滤头滤去杂质，4℃避光保存。15）LB液体培养基的配制取10.00gTryptone、10.00gNaCl、5.00gYeastExtract，加约800mLddH2O溶解；用2NNaOH调节pH至7.0并定容至1L，高温高压灭菌，4℃保存。（配制固体培养基，完成定容后，加入15g琼脂粉，高温高压灭菌，待冷却至60℃，以25mL培养基/90mm培养皿铺制平板，4℃保存；如需配制含抗生素固/液培养基，在灭菌完成后，待培养基冷却至60℃，加入抗生素至相应终浓度。）16）10×膜转移Buffer52 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系称取58.00gTris、3.70gSDS、29.00g甘氨酸，加约600mLddH2O溶解；定容至1L，室温储存；取100mL配制的10×膜转移缓冲液，加200mL甲醇，加700mLddH2O使用。17）氨苄青霉素（100mg/ml）取0.50gAmpicillin溶于4mL无菌ddH2O；溶解后定容至5ml，0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存。18）TBSTBuffer（0.05%）配制的5×TBSBuffer，用ddH2O稀释至1×；1L1×TBSBuffer加入0.5mLTween-20配制成0.05%TBSTBuffer，室温储存。19）封闭Buffer（5%）取0.50g脱脂牛奶，溶解至10mLTBSTBuffer，现配待用。其余试剂配制请参考《分子克隆实验指南》（第三版）53 浙江理工大学硕士学位论文齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系致谢两年半的研究生生活即将结束了，回顾在此期间我在学业、科研和生活得到了众多的老师、朋友和同学的热心帮助，我谨在此致以诚挚的谢意！首先感谢我的导师许传莲教授，在我做课题的每个阶段，都给予我悉心的指导和提供宝贵的意见，从设计、实验到毕业论文的撰写，都凝结了许老师的心血，硕士论文的全部工作都是在许老师的精心指导下完成的，许老师严谨的治学作风、渊博的知识、敏锐的学术思维、兢兢业业的工作精神和精益求精的科研素质深深地影响着我是使我受益终生。她给我提供了宝贵的学习机会，给予我们参加国际学术交流的机会扩充我的专业知识；在学习和生活上给予关爱，让我度过了美好而充实的研究生生活，值此论文完成之际，致以诚挚的谢意和无限的感激之情。同时还要感谢这一起生活和学习的老师和同学们，感谢刘新垣院士、王毅刚老师、李恭楚老师、贾晓渊老师、周秀梅老师等实验室各位老师的支持和帮助；感谢我的同学郑婷婷、黄涵年、卓玲燕、吴丽琴、杨新燕、赵瑞波、刘涛等在我生活和科研上的帮助和支持；感谢我的师弟师妹郑旭升、吴登伟、马步云等是你们共同营造了愉快的学习氛围和进取的工作气息伴随我度过了美好的研究生生活。同时，感谢浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所提供的硬件支持。此外，我要感谢我的家人，他们一直帮助、支持和鼓励我，在我遇到困难和挫折时，提供支持，给我勇气，使我有决心和信心完成学业。在大家的帮助、鼓励和关心下，经过自己的三载努力工作和专研，完成了论文，在此表示衷心感谢！潘姝花2013年12月54