齐墩果酸对k562细胞bax、bclxl mrna表达的影响

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1、齐墩果酸对K562细胞bax、bclxLmRNA表达的影响：张鹏霞薛芳喜王迪迪【摘要】目的探讨齐墩果酸（OA）对人慢性粒细胞白血病K562细胞bclxL和bax基因表达的影响。方法采用光学显微镜观察OA对体外培养K562细胞的增殖抑制情况；并用RTPCR法检测bclxL和baxmRNA的表达。结果与空白组和DMSO对照组比较，80μmol/LOA处理细胞后，细胞增殖受抑制；OA用药组baxmRNA含量增加，bclxLmRNA含量减少。结论OA可以诱导K562细胞凋亡，其机制可能通过上调bax基因表达及下调bclxL基因表达有关。【关键词】齐墩果酸；K562细

2、胞；bcl2家族；基因表达近年来国内外研究表明，齐墩果酸（OleanolicAcid，OA）具有抑制HL60细胞凋亡作用〔1〕，但有关OA对慢性粒细胞白血病细胞作用及其确切机制尚不清楚。本实验通过观察OA对慢性粒细胞白血病K562细胞bclxL和bax基因表达的影响，初步探讨OA诱导K562细胞凋亡的机制。　　1材料与方法　　1.1药品与主要试剂　　K562细胞株购自中国科学院上海细胞所；RPMI1640、胎牛血清均为Hyclone公司产品；OA对照品购自中国药品生物制品检定所，分子式C30H48O3，分子量456.71；二甲基亚砜（DMSO）为中科院生物医学工

3、程所产品；DEPC、DNAMarker及RTPCR试剂盒为大连宝生物产品,青霉素和链霉素购于北京索莱宝科技有限公司。　　1.2方法　　1.2.1药物配制　　OA对照品溶于DMSO中，配制成80mmol/L的储备液,-20℃储存，使用时用含10%胎牛血清的1640培养液配制成终浓度为800μmol/L的工作液。　　1.2.2细胞培养及分组　　K562细胞常规培养于含10%小牛血清，青霉素、链霉素各100U/ml的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱传代培养。根据培养时间的不同分为48h和72h处理组，每组又设空白对照组（RPMI1640培养基）

4、，DMSO溶媒对照组，根据本课题组前期实验结果〔3〕选择OA处理组浓度为80μmol/L。每次实验重复3次。　　1.2.3细胞形态学观察　　倒置显微镜下观察OA作用不同时间段时K562细胞的生长变化，观察细胞染色质和胞浆的变化。　　1.2.4RTPCR反应　　采用PrimerPremier5.0软件设计bax、bclxL及内参βactin基因PCR引物，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列及扩增片段大小如下：bax上游5′GGATGCGTCCACCAAGAA3′，下游5′CACTGTGACCTGCTCCAGAA3′，扩增序列长度为438bp；b

5、clxL上游5′CTGAATCGGAGATGGAGACC3′，下游5′AGTGAGCCCAGCAGAACC3′，扩增序列长度为376bp；内参βactin基因上游5′CGGGAAATCGTGCGTGACAT3′，下游5′GAACTTTGGGGGATGCTGCTCGC3′，扩增序列长度为712bp。取对数生长期细胞，培养48、72h后，分别收集对照组和实验组细胞，采用Trizol试剂提取样本总RNA，紫外分光光度计测OD260/OD280，计算RNA浓度及纯度。RNA的反转录操作步骤按试剂盒说明进行。将反转录产物cDNA于94℃预变性4min，94℃变

6、性30s，退火30s，（bax和bclxL的退火温度分别为57.2℃、56.3℃），72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸10min。PCR反应后取10μl产物加样，在1.5%琼脂糖凝胶上80～120V电泳，EB溶液中染色，紫外透射凝胶图像分析仪上观察电泳结果并照相，计算目的基因与βactin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。　　1.3统计学处理　　实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，所有数据采用SPSS11.5医学统计学软件处理。　　2结果　　2.1细胞形态学改变　　随着处理时间的增加细胞增殖明显受抑制，有明显的时间依赖性，细胞形状不规则，部分出

7、现膜皱缩、凋亡小体等凋亡标志。而对照组细胞大小均一，无明显的增殖抑制和形态学改变。见图1。　　3讨论目前研究表明，药物治疗肿瘤主要是引起肿瘤细胞凋亡。本研究发现，OA作用K562细胞48h后，细胞数量减少，并出现凋亡小体等凋亡现象，表明OA可以诱导K562细胞凋亡。细胞凋亡的调控机制十分复杂，一般认为细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡caspase；一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。bax基因在线粒体依赖性凋亡途径中,通过其在线粒体外膜聚合形成离子通道的方式促进cytc等蛋白分子释放以促进细胞