耐多药结核病快速诊断及治疗效果的评估

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分类号：R392学校代码：10062密级：学号：2014702120硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：耐多药结核病快速诊断及治疗效果的评估TITLE：Evaluationofrapiddiagnosisandtreatmentofmultidrug-resistanttuberculosis一级学科：基础医学二级学科：免疫学论文作者：孙海柏导师：白虹教授天津医科大学研究生院二〇一八年五月 分类号：R392学校代码：10062密级：学号：2014702120学位类别：科学学位□√专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：耐多药结核病快速诊断及治疗效果的评估TITLEEvaluationofrapiddiagnosisandtreatmentofmultidrug-resistanttuberculosis一级学科：基础医学二级学科：免疫学论文作者：孙海柏导师：白虹教授天津医科大学研究生院二〇一八年五月 中文摘要目的耐多药结核的实验室诊断目前采用的金标准是全自动分枝杆菌检测系统（BACTECMGIT960)液体培养以及比例药敏法，准确率较高，但检测过程耗时较长，容易耽误患者最佳诊疗时间，从而延误病情，本文采用细菌学、免疫学、分子生物学的快速检测技术与金标准进行比较，筛选出及时、准确的实验室快速鉴定及药敏检测方法，为临床及早诊断提供参考依据。通过分析机体内T细胞及其相关细胞因子变化规律，评估体内的免疫功能的恢复情况从而推断诊疗的效果，同时也为耐多药结核的患者基因多态性的研究以及该病种进行基因免疫制剂治疗开拓了新的思路和方向。方法耐多药结核组是选自2016年3月至2017年3月在天津市结核病定点医院就诊的结核科确诊的73例耐多药结核患者且实验室诊断中MGIT960液体培养法均为阳性、药敏检测利福平以及异烟肼均为耐药，对照组为排除肺结核病组共计73例，第一部分同阶段进行结核分枝杆菌的鉴定采用PCR－线性探针杂交酶显色法（Polymerasechainreactionlinearprobemethod）、痰涂片荧光染色法、结核感染T细胞检测-免疫斑点法(T.SPOT-TB)、抗结核分枝杆菌抗体（AntituberculosisantibodyTB-Ab）四种方法同时进行检测，并与金标准进行比较，筛选出特异性和灵敏性均较高的快速鉴定方法，同时采用PCR－线性探针杂交酶显色法（线性探针法）进行药敏检测与MGIT960比例药敏检测法的结果进行对比分析。第二部分：运用BD流式细胞仪动态检测T细胞变化情况，分析CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与正常对照组进行比较分析；采用流式微球技术（CytometricbeadarrayCBA）检测不同组血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17水平变化，同时依据治疗效果分为培养转阴组及培养未转阴组在治疗周期中的变化规律，各组间分别将检测结果进行统计学分析比较研究其变化规律。结果73例确诊耐多药结核病人以MGIT960培养及药敏检测结果做为金标准，采用四种快速检查方法进行检测及分析，所得结果：四种鉴定的快速实验室方法线性探针法、结核抗体、T-SPOT.TB、痰涂片的检测的灵敏度分别为82.19%，95%CI(77.7%，86.6%)、56.16%,95%CI(50.4%,61.9%)、43.84%，95%CI(38.1%，49.6%)、23.29%，95%CI(18.3%，28.2%)，差异具有统计学意义，检测的特异性分别为95.89%，95%CI(93.6%，98.2%)、61.64%，95%CI(55.9%，67.3%)、60.27%，95%CI(54.5%，65.9%)、97.26%，95%CI(95.3%，99.2%)，线性探针法与结核抗体以及与1 T-SPOT.TB存在差异有统计学意义，与结核涂片法无显著差异。对四种方法的操作时间进行比较分析得出的结果为：抗酸染色痰涂片需要2小时，线性探针技术需要2小时，结核分枝杆菌抗体检测需要3个小时，T.SPOT-TB需要24小时，相比金标准均缩短了检测时限。所以在快速诊断方法中综合比较线性探针技术作为新近发展起来的检测项目无论从灵敏度和特异性都相比之下都较高，检测时限也相对较短，推荐线性探针法作为首选的快速鉴定方法。同时在结核菌耐药性检测中以MGIT960比例法药敏检测利福平耐药性为标准，线性探针法利福平耐药率为82.19%，对照组敏感率为100%，Kappa值为0.701，两种方法在检测利福平耐药性上具有较高的一致性，线性探针法异烟肼耐药率为83.56%，对照组敏感率为100%，Kappa值为0.722，两种方法在检测异烟肼耐药性上具有较高的一致性，因此线性探针法作为耐药性结核快速诊断的首选筛选方法，并进行临床推广。耐多药结核患者用药前T细胞亚群与正常对照组进行比较分析，+总T细胞检测两组无统计学差异P>0.05，CD4T细胞较对照组P>0.05无统计学+++差异，CD8T细胞较对照组有所增高P<0.05，有统计学差异，CD4/CD8发生变化P>0.05无统计学差异，初治患者：患者临床症状较重，免疫反应性较强所以随病情变化的IL-17及IFN-γ含量较高；复治组：记忆型T细胞释放大量细胞因子，以IL-2、IL-4变化为主含量较高。培养转阴组：IL-6、TNF-α、IL-17、IL-10、IFN-γ、IL-2各阶段呈现规律性变化，且逐渐恢复到正常水平，视为治疗有效，可持续原治疗方案，说明免疫系统逐渐恢复；培养未转阴组患者：用药前、用药后2个月、6个月7种细胞因子均无出现规律性变化，用药2月、6月较用药前呈现相反的变化趋势提示可能治疗未成功，机体内的结核菌仍未减少，免疫功能仍未彻底恢复。结论在快速诊断耐多药结核的结核菌鉴定中，几种快速检测方法比较线性探针法的准确率灵敏度、特异性均最高，药敏检测线性探针法与金标准的比较具有较高的一致性，所以线性探针法作为检测耐药性结核快速准确的首选实验室筛选方法，值得进一步推广。耐多药结核患者机体免疫细胞较紊乱，抑制性T细胞增加，且T细胞释放出大量的细胞因子参与免疫调节及免疫病理反应中初治患者：患者临床症状较重，免疫反应性较强所以随病情变化的IL-17及IFN-γ含量较高；复治组：记忆型T细胞释放大量细胞因子，以IL-2、IL-4、IL-6变化为主含量较高；培养转阴组：相关细胞因子各阶段呈现规律性变化，且逐渐恢复到正常水平，视为治疗有效免疫系统逐渐恢复，2 可持续原治疗方案；培养未转阴组患者：用药前、用药后2个月、6个月7种细胞因子均无出现规律性变化，用药2月、6月较用药前呈现相反的变化趋势提示可能治疗未成功，机体内的结核菌仍未减少，免疫功能仍未彻底恢复，因此随着病程发展根据细胞因子变化的规律从而推断临床用药的效果，为临床医生提供是否需要更改治疗方案的指导意见。关键词：耐多药结核；线性探针法；T细胞；细胞因子；快速诊断；评估3 AbstractObjectivethegoldstandardofmultidrugresistanttuberculosisinlaboratorydiagnosisistheliquidcultureofBACTECMGIT960andtheproportionaldrugsensitivitymethod.Theaccuracyrateishigh,butittakesalongtimetodelaythepatient'sbestdiagnosisandtreatmenttime,thusdelaythecondition.Inthispaper,therapiddetectiontechniqueofBacteriology,immunologyandmolecularbiologywascomparedwiththegoldstandard.Therapidandaccuratemethodoflaboratoryidentificationanddrugsensitivitydetectionwasselectedtoprovidereferenceforearlydiagnosis.Thenthroughthestandardizeddiagnosisandtreatmentofthepatientswithmultidrugresistanttuberculosis,thechangesofTcellsandrelatedcytokinesinthebodyareanalyzed,thetrendofthechangesofcytokines,theevaluationoftherecoveryofimmunefunctioninthebodyandtheeffectofdiagnosisandtreatmentareevaluated,andthegenesofpatientswithmultidrugresistanttuberculosisarealsoanalyzed.Theresearchofpolymorphismandthetreatmentofgeneimmunizationhaveopenedupnewideasanddirections.MethodsThemultidrugresistanttuberculosisgroupwasselectedfromMarch2016toMarch2017inthetuberculosisDepartmentofthedesignatedhospitalofTianjincity.73casesofmultidrugresistanttuberculosiswerediagnosed.Inthelaboratorydiagnosis,960liquidculturemethodswereallpositive,YaoMindetectedrifampicinandisoniazidwereallresistant,andthecontrolgroupwas73casesofpulmonarytuberculosis.ThefirstpartistheidentificationofMycobacteriumtuberculosisinthesamestageusingPCRlinearprobehybrids(Polymerasechainreactionlinearprobemethod),sputumsmearfluorescentstaining,tuberculosisinfectionTcelldetection-immunedotmethod(T.SPOT-TB),antituberculosismycobacteriumantibody(Antituberculosisantibody).Thefourmethodsweretestedatthesametime,andcomparedwiththegoldstandard,therapididentificationmethodwithhighspecificityandsensitivitywasscreened.Theresultsofdrugsensitivitytestand960proportiondrugsensitivitytestwerecomparedandanalyzedbyPCRlinearprobehybrids(linearprobemethod).Thesecondpart:throughthesystematicdiagnosisandtreatment,throughtheuseofBDflowcytometrydynamicdetectionofTcellchanges,theanalysisofCD4+,CD8+,4 CD4+/CD8+andnormalcontrolgroupwerecomparedandanalyzed,usingCytometricbeadarrayCBATechnology(CytometricbeadarrayCBA)technologytodetectIL-2,IL-4,IL-6,IL-6,alpha,alphaindifferentgroupsofserum.ThechangesofIFN-gammaandIL-17levelweredividedintotwogroupsaccordingtothetherapeuticeffect,whichweredividedintotwogroups.Results73casesofmultidrugresistanttuberculosiswerediagnosedasgoldstandardbyMGIT960cultureanddrugsensitivitytest.Fourrapidexaminationmethodswereusedtodetectandanalyze.Theresultsshowedthatthesensitivityoffourkindsofrapidlaboratorymethodlinearprobemethod,tuberculosisantibody,T-SPOT.TB,sputumsmeardetectionwas82.19%,95%CI(77)..7%,86.6%,56.16%,95%CI(50.4%,61.9%),43.84%,95%CI(38.1%,49.6%),23.29%,95%CI(18.3%,28.2%),thedifferenceisstatisticallysignificant,thespecificityofthedetectionis95.89%,95%CI(93.6%,98.2%),95%CI,95%CI,95%CI(95%CI),linearprobeThedifferencebetweenthemethodandTBantibodyandT-SPOT.TBwasstatisticallysignificant,andtherewasnosignificantdifferencebetweenthetwomethods.Theoperationtimeofthefourmethodswascomparedandanalyzed.Theresultswereasfollows:2hoursforacidresistantsputumsmear,2hoursforlinearprobetechnique,3hoursfordetectionofMycobacteriumtuberculosisand24hoursforT.SPOT-TB,soitwasrecentlydevelopedintherapiddiagnosismethodascomparedwithlinearprobe.Thedetectionprojectisrelativelyhighinbothsensitivityandspecificity,andthedetectiontimeisrelativelyshort.Thelinearprobemethodisrecommendedasthefirstchoiceforrapididentification.Atthesametime,thedrugresistanceofMycobacteriumtuberculosiswasmeasuredbytheMGIT960ratiomethod.Thelinearproberifampinresistanceratewas82.19%,thecontrolgroupwas100%andtheKappavaluewas0.701.Thetwomethodshadhighconsistencyinthedetectionofrifampicinresistance,andthelinearprobemethodofisoniazidresistancewas83.56.Thesensitivityofthecontrolgroupwas100%andtheKappavaluewas0.722.Thetwomethodshadhighconsistencyinthedetectionofisoniazidresistance,sothelinearprobewasselectedasthefirstselectionmethodfortherapiddiagnosisofdrug-resistanttuberculosisandcarriedoutclinicalpromotion.TheTcellsubgroupofthepatientswithmultidrugresistanttuberculosiswas5 comparedwiththenormalcontrolgroup.TherewasnostatisticaldifferencebetweenthetwogroupsinthetotalTcelldetection.TherewasnostatisticaldifferencebetweenthetwogroupsandtheCD4+Tcellscomparedwiththecontrolgroup.TheCD8+Tcellswerehigherthanthecontrolgroup,andtheP<0.05washigherthanthecontrolgroup.Therewasastatisticaldifference.TherewasnostatisticaldifferenceintheoccurrenceofCD4+/CD8+,andtherewasnostatisticaldifferenceintheoccurrenceofCD4+/CD8+.IL-6,TNF-alpha,IL-17,IL-10,IFN-gamma,IL-2ineachstageshowedregularchanges,andgraduallyrecoveredtothenormallevel,whichwasregardedastheeffectivetreatmentandthesustainableoriginaltreatmentscheme,indicatingthegradualrecoveryoftheimmunesystem,andthetrainingofthepatientswith7kindsofcytokinesbefore,2monthsand6monthsafterdruguse.FromtwomonthstosixmonthsJune,thechangetrendofdruguseshowedtheoppositetrendFromtwomonthstosixmonthsJune,suggestingthatthepossibletreatmentwasnotsuccessful.TheMycobacteriumtuberculosisinthebodywasstillnotreduced,andtheimmunefunctionwasstillnotcompletelyrestored.Patientswithprimarytreatment:thepatients'clinicalsymptomswereheavierandtheimmuneresponsewasstronger,sothecontentofIL-17andIFN-gammawashigherwiththechangeofthecondition.Theretreatedgroup:thememorytypeTcellsreleasedalargenumberofcytokines,andthecontentofIL-2andIL-4washigher.ConclusionthereareseveralrapiddetectionmethodsforrapiddiagnosisofMycobacteriumtuberculosisinmultidrugresistanttuberculosis.Keywords:Multidrug-resistanttuberculosis;Linearprobe;Tcells;Cytokines；Rapiddiagnosis；Assessment6 目录中文摘要…………………………………………………………………………......1Abstract……………………………………………………………………………...4符号说明…………………………………………………………………………....9前言……………………………………………………………………………….....10研究现状、成果………………………………………………………….............10研究目的、方法……………………………………………………….................14一、PCR-线性探针杂交显色法诊断耐多药结核……………………………........161.1对象和方法……………………………………………………………….....161.1.1研究对象…………………………………………………………........161.1.2仪器与试剂………………………………………………………........161.1.3试验方法……………………………………………………………........191.1.4统计学方法…………………………………………………………........201.2结果……………………………………………………………………….....211.3讨论……………………………………………………………………….....231.4小结……………………………………………………………………….....25二、耐多药结核患者T细胞及细胞因子的变化对治疗疗效评估...………..........262.1对象和方法…………………………………………………………….........262.1.1研究对象…………………………………………………………........272.1.2仪器与试剂………………………………………………………........272.1.3试验方法……………………………………………………………........272.1.4统计学方法…………………………………………………………........282.2结果……………………………………………………………………….....282.3讨论……………………………………………………………………….....332.4小结……………………………………………………………………….......37结论………………………………………………………………………...............38参考文献………………………………………………………………………….....39发表论文和参加科研情况说明……………………………………………….........44综述……………………………………………………………………………….....45T细胞相关细胞因子检测在结核诊疗中的研究.........……………………….....457 综述参考文献………………………………………………………………….....49致谢………………………………………………………………………………….52个人简历…………………………………………………………………………….538 符号说明英文缩写英文全称中文全称MTBmultidrugresistant耐多药结核tuberculosisZpyrazinamide吡嗪酰胺Kmkanamycin卡那霉素Lfxlevofloxacin左氧氟沙星Ptoprotionamide丙硫异烟胺PASp-aminosalicylic对氨基水杨酸CBAcytometricbeadarray流式微球技术ELISAenzymelinkedimmunosorbent酶联免疫吸附测定assayIL-2Interleukine-2白细胞介素-2TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子IFN-γinterferon-γγ-干扰素IL-17Interleukine-17白细胞介素-17IL-10Interleukine-10白细胞介素-10IL-6Interleukine-6白细胞介素-6IL-4Interleukine-4白细胞介素-4IL-12Interleukine-12白细胞介素-12FITCfluoresceinIsothiocyanate异硫氰酸荧光素PEphycoerythrin藻红蛋白PerCPperidinin-chlorophyll-protein多甲藻素叶绿素蛋白APCallophycocyanin别藻蓝蛋白NTMNontuberculousmycobacteria非结核分枝杆菌TB-AbAntituberculosisantibody抗结核分枝杆菌抗体PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应T-SPOT.TB-T结核感染T细胞检测BPBMCperipheralbloodmononuclearcell单个核细胞BACTEC全自动分枝杆菌检测MGIT960系统9 前言研究现状、成果［1］WHO显示调查数据：在中国每年因死于结核病的人数多达13万，且耐多［2］药较多耐多药结核的发病率我国位列榜首。其严重威胁了患者的生命健康，不仅成为我国的严重公共卫生问题之一，还成为阻碍我国结核病防治工作向前推进的重要障碍[3]之一。耐多药结核（MultidrugresistanttuberculosisMDR-TB）是指人体感染的结核菌后经检测后证实至少同时对利福平、异烟肼同时耐受的一种结核类型，据研究最主要的发病原因：抗结核药物治疗不当导致耐药性的产生有很明显的关系[4-6]有报道称耐多药结核与年龄、性别、职业、文化、吸烟史等因素有直接相关性关系。耐多药结核患者中复治患者较多，治愈率较低，初治病人的治愈率往往显著高于复治病人，对于初治耐多药肺结核患者偶会出现血供不丰富，所以容易引起液化性的坏死、干酪样坏死、肉芽组织纤维化，所以同样不能轻视。目前对耐多药结核的报道较多其中包括治疗该方法包括常规的一二线抗结核用药以及中医药治疗上的研究、影响因素、风险评估等等[7-8]。MDR-TB发病特别容易反复，常规诊治时间较长，临床治疗难度较大，传染性非常强，治疗费昂贵、治愈率较低、死亡率高其发病，造成上述原因主要是因为临床诊断及药敏试验的延迟从而不能及时隔离，因而导致大范围的感染被视为最大的隐形传染源，而且耐多药结核病日益呈现出多发态势，所以对于实验室诊断能够提供早发现、快速鉴定、及早进行治疗是关键点。传统的结核分枝杆菌培养及药敏检测结果敏感性以及特异性都非常高，且作为临床诊断的主要依据，但是结核分枝杆菌生长环境要求很严格，实验室的要求非常高，很容易出现污染，且繁殖速度慢，所以其检测时间很长，临床上应用的结核菌培养虽作为金标准但需要4周～8周的时间才能得到检测结果，不能及时为临床提供快速诊断依据以及治疗方案的建议，目前常用的快速检测方法由痰荧光染色涂片法，此方法对样本的含菌量要求非常高而且标本类型不同对检测结果也有一定的影响，受操作者人为判断误差较大，因此敏感性不高，而且在肺结核痰培养阳性标本由于菌量捕获的不足所以其阳性率仅为45%-48%10 ［9-10］因此经常会造成漏诊、误诊等。部分临床科室还采用T-SPOT.TB免疫斑点法，对病人单个核细胞进行γ-干扰素释放的实验，评估体内是否存在致病的结核分枝杆菌存在，灵敏度以及特异性尚属一般且试剂成本高，费用昂贵等缺点。结核分枝杆菌抗体检测，实验所用时间较短，假阴性、假阳性标本较多，卡介苗接种的影响较大无法排除现症还是既往感染，仅作为参考。目前，国内外已［11］经开始运用基因芯片技术对结核分枝杆菌的耐药性进行检测价格较昂贵不能广泛应用于临床。线性探针法方法是对纯培养物或病人肺部涂片阳性标本的结核分枝杆菌复合群及其耐利福平或异烟肼耐药基因进行分子生物学检测,通过检测因位点进行［13］检测，如katG、inhA和rpoB等，评价线性探针技术对利福平和异烟肼药敏检测的可信性以及准确性。由美国公司研发的HAIN-GT-Blot48杂交仪.是利用全自动荧光实时定量结核菌鉴定检测以及结核菌的药敏检测试剂盒。其检测方法主要是以全自动半巢式实时分子生物技术原理，主要是利用结核分枝杆菌的DNA检测来进行鉴定的，试验中是通过检测rpoB基因含利福平耐药决定区，以此原理进行引物探针的设计从而阻断该决定区。rpoB基因突变致利福平耐药后导致［14］异烟肼出现耐药的可能性也随之越来越明显整个实验共2个小时出结果，即可得到诊断以及耐药性的结果，适用于多种标本类型，常见的有血、痰、胸腹水、组织、脓液、肺泡灌洗液等，直接检出DNA并且快速鉴定其耐药性的实验方法已经作为世界卫生组织推荐的检验结核病方法，检测原理依据利福平耐药［15］性遗传学机理，从而确定标本是否含有结核菌复合群以及是否对利福平耐药。本文选用此种方法与金标准液体培养进行耐多药结核患者实验室诊断的比较，具有较高的准确性，快速及时的检测方法，值得推广。本文选取了四种快速鉴定的方法对结核患者进行检测。MGIT960液体培养法及药敏试验目前做为结核病实验室诊断的金标准，比较固体法所用时间稍短，但是检测结果最快也要延续到两周的时间，从而使部分耐多药结核患者延误了最佳治疗时间，延误了病情，最终导致病情恶化，加大治疗转归的难度。已经有部分文献对实验室的快速方法与传统的金标准进行［16］比较分析，Boehme等在进行试验操作过程中以MGIT960液体培养为标准，线性探针法检测结果对比分析准确率高，与本文献中报道的较为一致，但也有［17］一些研究中显示的结果不一致如陈海强等，所以进行大量数据的研究以及对11 比试验的展开有利于确定分子生物法在诊断耐药结核中的意义及作用，同样的检测组中发现对肺泡灌洗液结核菌的检出率略高于痰标本[18]，从而说明原发部位的所含的菌量会很高，选取原发部位的标本进行实验室诊断阳性率会的到很［19］大的增加，Boehme等评价了线性探针法在结核高发地区的医院实验室进行检测的存在的可能性很高，而且在能提供快速准确的结果的同时对耐药性同时进行了监控。有研究显示，线性探针法实验在检测儿童肺结核方面也具有较高的准确率[20]。目前临床对涂阴肺结核患者的诊断也存在很大困难，因为没有细菌学的诊断依据，同时也视为实验室技术的难点，涂阴肺结核是指痰抗酸染色［21］涂片抗酸染色3次以上为阴性的肺结核患者。临床数据显示大约在肺结核中有50%~70%的患者属于涂阴结核菌（MTB），单纯的痰抗酸染色涂片抗酸染色［22］阳性率较低仅为19.9%~35%，至此临床上难免有误诊现象，本文针对Xpert的检测的文献进行综述发现痰结核菌快速培养对涂阴肺结核诊断的敏感性和特异性分别25.6%、95.0%，采用线性探针法对涂阴肺结核的灵敏度和特异度为80.0%、97.5%；涂阴肺结核在鉴别诊断中确实是一大难题，而借鉴抗结核分枝杆菌抗体对涂阴肺结核诊断的敏感性和特异性分别为45.6%、25%[23]，所以目前线性探针法可作为诊断涂阴肺结核患者的主要实验室方法之一，检测时间也有很大的提升由患者诊断的平均时间56天缩短到2小时[24]。对于大部分非结核分枝杆菌（NTM），正常情况下也存在于大自然中，正常健康人群也有可能携带，做为条件致病菌，其病发率也非常高。NTM肺病患者与肺结核患者临床表现非常相似，所以根据临床症状进行鉴别难度很大[25]，有关报道上显示XpertMTB/RIF检测鉴肺结核和NTM肺病的鉴别诊断中敏感度为95.97%(119/124)，特异度为91.67%(33/36)[26]线性探针法检测在结核和非结核分歧杆菌（NTM）肺病中的鉴别诊断也具有非常重要的意义。［27,28］结核胸膜炎作为最常见的肺外结核，其发病率持续增加的状态以往的研究大多基于肺结核呼吸道标本或组织的的诊断研究，对于胸腔积液患者研究［29,30］并不是很多，近年来逐渐引起重视，有部分研究显示，结核性胸膜炎线性探针法检出率（60.5%、70%），比较之下较TBDNA检测和罗氏培养法在胸腔积液的结核菌鉴定的阳性检出率同样非常高，而且与ADA联合诊断检测胸水其的灵敏度和特异性均有很大提升[31,32]，收集足量的结核胸膜炎患者标本中胸腔12 积液检线性探针法检测对进行胸膜炎的鉴别诊断中首先要结合其他检测项目以及临床表现进行明确的诊断。淋巴结结核目前辅助诊断主要以病理学诊断为主，传统的涂片方法也是常用的检测方法，该方法耗时较短，但检测的阳性率低，标本主要以淋巴结穿刺液为主进行线性探针法检测的结果与国外文献中在淋巴结穿刺穿刺液进行线性［33］探针法检测的阳性率(60.1%)，有一些文献报道，以常规的培养方法检测的特异性达100%，灵敏性78.1%[34]，因此说明线性探针法测定在在应用于淋巴结核标本的诊断中同样较传统的方法更具有价值，适用于广泛推广和研究。骨关节结核属于肺外结核，临床症状不是很明显，一般病灶中的结核杆菌含量较少[35]而且很难获取，所以加大了骨结核的快速诊断的难度，现有检测方法中涂片法敏感度<15%，传统培养敏感度<20%且耗时长，传统PCR方法污染率较高[36]，采用线性探针法在骨结核提取出的脓液标本中检测的敏感性、特异性均较高，利福平的耐药基因突变率为21.73%[37]，而且所用时间短，因此对骨结核的鉴定以及耐药性的诊断提供了重要依据。结核性脑膜炎的诊断，采用线性探针法进行检测，由于病人所获取的脑脊液含量较少而且珍贵，结核菌含量不够密集，用常规的抗酸染色法假阴性率较高，线性探针法对脑脊液中结核分枝杆菌的检测敏感性为18.33%较低，所以综合考虑采用常规的检测方法相结合，培养法、涂片、线性探针法三种方法相联合诊断从而提高结核性脑膜炎的诊断准确率。肠结核选用肠镜检查时所取肠茹膜组织为标本，传统的培养法阳性率较低与传统方法法进行了比较，文献中指出线性探针法的敏感性明显高于抗酸染色以及液体培养法，特异度100%[38]，同时在检测的时间上的快速也具有明显的优势，因此线性探针法在肠结核快速诊断中起重要作用，可以更好地协助临床医生进行对肠结核鉴诊做到早发现、早治疗。线性探针法在诊断结核菌的药敏的的敏感性大80-95%，特异性98-100%[39-41]，在耐药性监测上，也较常规960耐药性评估上有一定的优势，检测时间短，准确率也有较高的一致性，因此检测方法也被临床医师所认可，作为常规的临床应用来讲，适合于全面推广使用提高检测结果的快速准确。本文中对耐多药结核淋巴细胞相关细胞及细胞因子的检测采用常规的流式细胞仪法流式细胞术（FCM)检测细胞亚群的相对计数，以及流式微球分析法13 （CytometricBeadArrayCBA)对血清中细胞因子含量进行测定，本质是通过将不同亮度的微球作为载体，将荧光素标记的针对同一待测抗原的抗体作为探针通过物理吸附等方法与抗体相结合特异性识别待测抗原，形成免疫复合物，最后通过流式细胞仪的激光对其进行分类检测，以获得被固定的待测抗原的种类和数量信息[42]，是液相多重蛋白定量检测方法，集微球、荧光、激光、流体学、数据分析一体，通过微球表面的荧光信号进行定量分析。其技术原理为:CBA可以同时检测多种蛋白组合，不同的微球对种抗体进行化学编码，将微球混合在同一系统内再进行多重复合测定。CBA法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、Luminex液相悬浮芯片技术都能够对细胞因子进行定量检测，但与其他检测技术相比较分析，此类方法具有其独有的特点[43]，占据绝对优势，所用标本量较少。而且具有有较高的灵敏度、较好的密封性对于高度传染性的病人标本能有效降低交叉感染的几率[44]、有很宽的检测范围和更好的重复性，检测的过程可以做到6到7种细胞因子的同时段进行测量。目前研究的进展中不仅可用于各种炎性疾病的鉴别诊断在过敏性哮喘、系统性红斑狼疮及糖尿病等慢性病也被广泛应用[45]。在结核分枝杆菌侵入人体后，活化后的CD4+T细胞（Th）产生特异性细胞免疫应答能有效抵抗结核菌感染，随着体内结核菌含量的多少从而观察CD4+T细胞变化的规律，通过规律性的观察了解治疗疗效的评估于体内辅助性T细胞以及相关细胞因子之间变化的规律，并将其可分化为包括Thelper(Th)1细胞、Th2细胞及调节性T细胞(regulatoryTcellTreg)亚群，最近研究较多的细胞亚群Th17，主要经过白介素17主要作用是作为激活相关炎症反应和其他效应性T细胞结合发挥作用。而且在耐多药结核病患者中常出现合并存在免疫功能减弱[46]的特点。在患者体内，体液免疫和细胞免疫同时介入肺结核患者的免疫应答反应过程[47]。造成耐多药的原因之一是因为免疫功能紊乱造成的，细胞免疫中主要有很多细胞因子参与反应，而且变化规律与病情的严重程度以及诊疗效果有一定的相关性。研究目的、方法研究目的耐多药肺结核的诊断目前采用的金标准BACTECMGIT960液体培养以及比例药敏，检测过程耗时较长，容易耽误患者最佳诊疗时间，从而延误病情。本文选取实验室常用的快速实验室结核诊断方法与金标准进行比较分析，14 采用PCR的技术与金标准结核菌鉴定进行比较，选取及时、准确的实验室快速鉴定及药敏检测方法，为临床提供及时准确的耐多药肺结核的诊断依据。对确诊后的耐多药结核患者进行规范的诊疗，分析T细胞的变化以及其相关细胞因子的表达情况，分组进行分析变化趋势，从而推断诊疗的成功与否。本文中对耐多药结核的患者的快速鉴定、诊断以及对体内的免疫状况的分析从而对疗效评估、转归给出快速的判断和依据，同时也为将来进行耐多药结核患者的基因多态性的研究以及该病种进行基因免疫制剂治疗开拓了新的思路和方向。研究方法耐多药结核组是选自2016年3月至2017年3月在天津市结核病定点医院就诊于结核科的73例确诊耐多药结核患者且实验室诊断中960液体培养法均为阳性、药敏检测利福平以及异烟肼均为耐药，对照组为排除肺结核的健康体检人员共计73例，第一阶段同阶段进行结核分枝杆菌的鉴定通过基因探针技术、痰涂片荧光染色法、结核感染T细胞检测、抗结核分枝杆菌抗体IgG检测的方法进行检测，并与经典的液体培养结果进行比较，筛选出特异性和灵敏性均较高的快速鉴定方法，同时采用PCR－线性探针杂交酶显色法进行药敏的鉴定与960药敏检测结果，进行对比分析第二阶段按照诊疗规程进行耐多药肺结核的诊治，通过采用BD流式细胞仪动态检测按照治疗效果进行耐多药组与正常对照组T细胞亚群相对分布情况进行对比分析，采用流式微球技术（CytometricbeadarrayCBA）法对患者血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17水平进行跟踪测定，同时将73例实验组进行分组包括：初治组43例、复治组30例；依据确诊耐多药结核后经过治疗到第6个月末或疗程结束后，痰培养检查结果仍然为阳性的病人定为培养未转阴组5例;治疗过程中痰培养检查转阴的患者为培养转阴组68例，分别将检测结果最后根据统计学方法对所检测的结果进行比较性分析，选择最佳的适合耐多药结核患者的快速联合检测方法，观察细胞以及细胞因子间的变化规律，从而为耐多药结核患者的发病、诊治以及疗效观察提供参考依据。15 一、PCR-线性探针杂交显色法诊断耐多药结核1.1对象和方法1.1.1研究对象耐多药结核组选自从2016年3月至2017年3月在天津海河医院就诊依据《结核诊断和治疗指南》标准诊断的73例耐多药结核患者符合以下要求：临床症状：偶有发烧、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛/闷、盗汗、呼吸音重、频率快等体征。部分病人可无临床症状、轻者可无体征。影像学检查：提示结核病影像学变化特征痰液检查：结核菌液体培养结果阳性，耐药菌检测结果至少对利福平、异烟肼同时耐药，年龄在16-78岁之间，男性55例；女性18例。对照组为73例排除结核病组，包括18例社区获得性肺炎，40例支气管肺炎患者，15例支气管炎患者，年龄在18-82之间，其中女：28例、男：45例。25例活动性结核患者利福平、异烟肼菌均敏感的患者进行回顾性分析。1.1.2仪器与试剂(1)PCR-线性探针杂交酶显色法诊断试剂盒(GenoTypeMTBDRpIus，德国HainLife-science公司)(2)线性探针法试剂盒及SR标本处理液（美国Cepheid公司）(3)HotstarTaq酶(Qiagen)(4)MGIT960液体培养基及药敏管(美国碧迪公司)(5)HainGTBlot-48全自动杂交仪(德国HainLifescience公司)(6)PCR分析仪(德国HainLifescience公司)(7)Eppen-dorf5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)(8)生物安全柜(山东海尔)(9)白洋品牌离心机(10)移液器德国eppendorf公司(11)显微镜IMT-2日本OLYMPUS公司(12)HYC-326A冰箱（青岛海尔电器有限公司）(13)三洋牌二氧化碳培养箱；(14)BD肝素纳采血管、离心管16 (15)结核感染T细胞检测诊断试剂盒（上海复星）(16)ESAT-6抗原(17)CFP-10抗原(18)植物血凝素(PHA)(19)BCIP/NBT和conjugatereagent购于英国OxfordImmunotec公司(20)AIM-V培养液（天津太平洋美德公司）(21)RPMI1640培养液（天津太平洋美德科技）(22)Ficoll淋巴细胞分离液（天津太平洋美德科技公司）(23)磷酸盐缓冲溶液(PBS)自配:在800m1蒸馏水中溶解7.9gNaCI,0.2g(24)KCI,1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L(25)英国OMEGA抗结核抗体检测试剂盒（北京华医杏林医疗技术有限公司）(26)TECAN酶标仪1.1.3试验方法1.1.3.1PCR-线性探针杂交显色法诊断耐多药结核（线性探针法）(1)用无菌滴管取1ml标本置放前处理管中(2)加入等同于2mlSR处理液(3)置于振荡器上充分震荡15-30S，室温放置15分钟，使标本充分液化。(4)提取2ml液化后样品用无菌滴管加入到反应盒(5)将反应盒放置GeneXpert仪器中(6)按试剂说明操作(7)反应2个小时即可判读结果(8)结果判断：按照探针的循环阈值（Ct值）进行检测结果的判读(9)对照探针Ct值≤38时为阳性，反之则为无效提示检测标本的中DNA提取不或存在PCR抑制物(10)5个探针中至少2个探针Ct值≤38即为检测到结核分枝杆菌，可进一步按照Ct值对其进行半定量(11)Ct值大于16为高含量；Ct值为16~22为中含量，Ct值为22~28为低含量，Ct值>28为极低含量17 (12)检验利福平耐药性的依据分枝杆菌特异性分子显示的早期Ct值和晚期Ct值之差。即△Ct值(13)结果判定：△Ct>3.5提示对利福平耐药，△Ct<3.5提示对利福平敏感(14)实验终止循环数为38个循环，因此当早期探针Ct值>34.5或晚期探针Ct值>38时，利福平耐药性为不确定(15)研究显示95%的利福平耐药菌株的rpoB基因81bp区域（RRDR）存在基因突变。1.1.3.2结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）1.1.3.2.1单个核细胞(PBNC)分离:(1)采集所有受试组人员空腹外周血4ml于肝素锂抗凝的真空采血管内(2)混匀后常温的条件下于4小时内运送至检验科避免细胞破裂(3)外周血内加入等比例RPMI1640培养液进行混和摇均(4)按体积2-3:1的比例将混匀后的轻轻加到Ficoll淋巴细胞分离液的最上层(5)18-25℃在1000g离心力下，离心22分钟，尽量保持平稳(6)提取离好的中间层内的单个核细胞（白膜层）到一个新的15ml无菌尖底离心管内，获取到外周血中的单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)(7)重新加入培养液至l0ml，进行洗涤(8)在18℃条件下，离心力600g，离心7min，弃去上清(9)使用1mlAIM-V培养液将细胞沉淀轻轻的进行重悬，继续加入AIM-V培养至10ml,混匀后18℃，350g离心7min，弃上清(10)提取10ul制备好的细胞悬液于无菌试管内(11)加入40u10.4%的台酚蓝将死细胞染成蓝色，利用计数板中计数活的细胞数量。(12)换算出每毫升细胞悬液中活的细胞量(13)用AIM-V培养液将细胞工作液稀释成终浓度为250,000/100u1的工作液。1.1.3.2.2T-SPOT.TB检测(1)将反应版做好标记，将50u1AIM-V加入到阴性孔，将50u1抗原A(ESAT-6)至A孔，50u1抗原B(CFP-10)至B孔，终浓度均为l0ug/ml,50u1植物血凝素作为阳性对照加入到阳性孔中;18 (2)以上四个孔分别加入100u1(含250,000细胞)已制备好的工作液，置于37℃，5%C02培养箱温育20h;(3)用无菌PBS将酶标抗体制备成1:200(碱性磷酸酶标记的二抗)，原则是现用现配;(4)从培养箱中取出培养板，将反应液甩出，用200u1PBS洗涤4遍(5)将50ul配制后的酶标抗体工作液加入到反应孔中，置于4℃冰柜中，1h。(6)按上述方法进行洗涤，将50ul底物加入到反应孔，室温避光放置7min，用去离子水进行冲洗，干燥后进行斑点计数;(7)计数，T-SPOT.TB的实验结果用每250000PBMCs/PEMCs中斑点形成细胞(SpotFormingCells,SFCs)的数目来描述。1.1.3.2.3判定标准总阳性判定标准:(1)阴性孔小于6个斑点时，任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数后≥6;(2)阴性孔大于6个斑点时，任一实验孔数大于阴性孔斑点数的两倍单个抗原阳性判定标准:(3)阴性孔小于6时，相对应的抗原实验孔减去空白孔斑点数后≥6(4)阴性孔大于6时，相对应的抗原实验孔大于阴性孔斑点数的两倍。(5)阴性判定标准任一实验孔数中的斑点数均达不到阳性诊断标准。1.1.3.4痰涂片荧光染色法:将两组痰样本进行抗酸杆菌涂片（荧光法）、镜检标准按照标准化操作流程进行实验(1)准备脱脂、洁净的新玻片,在左侧端1/3处注明实验室序号及标本序号。(2)在生物安全柜内,小心打开标本容器,使用折断的竹签茬端,挑取痰标本中干酪样、脓样部分(3)在玻片右侧23处均匀涂抹约10mm×20mm大小的卵圆形痰膜。(4)待涂片自然干燥后,放置在染色架上火焰固定(5秒钟内火焰于玻片下通(5)玻片间距应在10mm以上。(6)火焰固定（5S内火焰于玻片下通过）(7)滴加0.1%金胺0染液,盖满玻片。19 (8)保持15分钟。染色期间应始终保持痰流水自玻片一端轻缓冲洗。膜被染色液覆盖,必要时可续加染色液。(9)流水自玻片一端轻缓冲洗(10)倾斜玻片,沥去玻片上的水。(11)滴加3%盐酸乙醇,脱色3分钟或至流水自玻片一端轻缓冲洗,如脱色不彻无色。(12)流水自玻片一端轻缓冲洗,如脱色不彻底,重复步骤10。(13)沥去玻片上的水。(14)滴加0.5%高锰酸钾复染液,染色1分钟(15)流水自玻片一端轻缓冲洗,洗去复染分钟液,沥去玻片上的水(16)将染色后的涂片置于玻片架上,自然(17)使用汞灯光源或LED光源的荧光显进行镜检,发现疑似AFB杆状物,以40×物镜确认。在暗背景下,AFB发黄色荧光,杆状略弯曲(18)按《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》所规定的标准报告结果。①3-9条/100个视野为1+②1-9条/10个视野为2+③1-9条/视野为3+④≥10条/视野为4+⑤未见抗酸分枝杆菌则为阴性⑥本文所涉及到的阳性结果均镜下能读到结核菌即为阳性。1.1.3.5检测抗结核分枝杆菌抗体实验（TB-AB):（1）操作步骤依说明书要求操作（2）判读结果用TECAN酶标仪进行吸光度值的读取（3）根据标准液制作标准曲线，对所得结果进行半定量检测（4）在标准滴度曲线表中查找,判读标准为：标本滴度400-900u/ml为弱阳性2.>900u/ml为阳性（3）本文涉及到阳性标本滴度均>400u/ml1.1.4统计学方法:（1）数据处理采用SPSS17.0统计软件20 （2）计量资料应用t检验：均数±标准差（x±s）（3）计数资料以率（%）表示用χ2检验，P＜0.05，差异具有统计学意义（4）Excel制作统计表格（5）Kappa一致性分析1.2结果1.2.1结核分枝杆菌的鉴定对73例耐多药肺结核患者进行结核菌的鉴定以及73例对照组作为筛查患者最终排除结核病的病人进行检测结果显示：线性探针法、结核抗体、T-SPOT.TB、痰涂片的检测的灵敏度分别为82.19%，95%CI(77.7%，86.6%)、56.16%,95%CI(50.4%,61.9%)、43.84%，95%CI(38.1%，49.6%)、23.29%，95%CI(18.3%，28.2%)，差异具有统计学意义，检测的特异性分别为95.89%，95%CI(93.6%，98.2%)、61.64%，95%CI(55.9%，67.3%)、60.27%，95%CI(54.5%，65.9%)、97.26%，95%CI(95.3%，99.2%)，线性探针法与结核抗体以及与T-SPOT.TB存在差异有统计学意义，与痰涂片法无显著差异。图1四种检测方法灵敏性与特异性比较1.2.2线性探针的方法检测利福平耐药性73例耐多药结核患者以及25例活动性结核利福平异烟肼均敏感的患者作为对照组：以MGIT960比例法药敏检测利福平耐药性为标准，线性探针法利福平21 耐药率为82.19%，对照组敏感率为100%，Kappa值为0.701，两种方法在检测利福平耐药性上具有较高的一致性表1.利福平耐药性检测结果线性探针比例法药敏试验合计耐药敏感耐药601373敏感02525合计6038981.2.3线性探针的方法检测异烟肼耐药性73例耐多药结核患者以及25例活动性结核利福平异烟肼均敏感的患者作为对照组：以MGIT960比例法药敏检测异烟肼耐药性为标准，线性探针法异烟肼耐药率为83.56%，对照组敏感率为100%，Kappa值为0.722，两种方法在检测异烟肼耐药性上具有较高的一致性表2.异烟肼的药敏检测结果线性探针比例法药敏试验合计耐药敏感耐药611273敏感02525合计6137981.2.4线性探针法的耐药基因突变位点组成比对通过线性探针法检测异烟肼KatG基因突变相关的高水平耐药共计35株包括WT缺失/MUT1出现构成比37.7%；WT缺失/MUT2出现构成比为19.67%；26株为inhA基因突变相关的低水平耐药包括WT1缺失/MUT3A出现构成毕伟26.23%，WT1缺失/MUT1出现构成比为16.39%；rpoB基因突变共计25株耐药基因突变，WT8缺失一MUT3出现位点构成比41.67%占比较高。22 表3：线性探针法利福平、异烟肼耐药基因突变位点分析及构成比表4：线性探针法异烟肼耐药基因突变位点分析及构成比1.3讨论目前全球耐多药结核病患者约50万例，中国所占比例达1/4－1/5，分为复诊耐多药肺结核和初治耐多药肺结核，复治性肺结核患者发病的主要原因大多数是因为在首诊时医务人员对抗结核药物使用和方案的制定尚不是很熟悉，从而导致在用药方面规律性差、疗程不够等现象。初治性耐多药结核的研究已经【48】作为国内外研究重心，极大部分原发耐药是继发耐药传播而来正确快速的诊断耐多药结核患者及时进行隔离减少人员的交叉感染非常重要，从而控制原发性耐多药结核的传播，占耐多药结核病中很大的比例，本此研究中出现初治耐多药患者的比例较复治患者的比例还要高，并且处于上升的趋势，本文研究快速准确的诊断方法，从而减少因延误病情而导致的交叉感染的出现，从而减少耐多药结核病的发病率。本研究对73例临床诊断耐多药结核患者组，已经通过结核菌培养以及结核菌药敏试验进行检测，结果为结核菌阳性，药敏培养为利福平、异烟肼均耐药，23 以及排除结核病的73例对照组，选取四种快速实验室中结核菌的诊断方法，进行同步实验，检测的结果进行分析：线性探针法、结核抗体、T-SPOT.TB、痰抗酸染色涂片的检测的灵敏度分别为82.19%，95%CI(77.7%，86.6%)、56.16%,95%CI(50.4%,61.9%)、43.84%，95%CI(38.1%，49.6%)、23.29%，95%CI(18.3%，28.2%)；P<0.01，线性探针法的灵敏度较高，差异具有统计学意义，检测的特异性分别为95.89%，95%CI(93.6%，98.2%)、61.64%，95%CI(55.9%，67.3%)、60.27%，95%CI(54.5%，65.9%)、97.26%，95%CI(95.3%，99.2%)线性探针的特异性较高，P<0.01，差异有统计学意义。而从检测时间的角度分析：线性探针检测需要两个小时检测，痰抗酸染色涂片需要120分钟左右，T-SPOT.TB：24小时，结核抗体检测2小时，从时间角度比较几种方法比较常规的培养在快速出具结果中具有很大的优势。灵敏度及特异性来看，线性探针法检测作为新型分子生物学的检测方法无论从灵敏度82.19%，特异性为95.89%也非常高，所以本文推荐线性探针法作为结核病的快速筛选的主要方法进行临床推广。在耐药性检测中，73例耐多药结核患者以及25例活动性结核利福平、异烟肼均敏感的患者作为对照组：以MGIT960比例法药敏检测利福平耐药性为标准，线性探针法利福平耐药率为82.19%，对照组敏感率为100%，Kappa值为0.701，两种方法在检测利福平耐药性上具有较高的一致性；线性探针法异烟肼耐药率为83.56%，对照组敏感率为100%，Kappa值为0.722，两种方法在检测异烟肼耐药性上具有较高的一致性，本文采用线性探针法对其突变基因检测：对通过线性探针法检测异烟肼KatG基因突变相关的高水平耐药共计35株包括WT缺失/MUT1出现构成比37.7%；WT缺失/MUT2出现构成比为19.67%；26株为inhA基因突变相关的低水平耐药包括WT1缺失/MUT3A出现构成比为26.23%，WT1缺失/MUT1出现构成比为16.39%；rpoB基因突变共计25株耐药基因突变，WT8缺失一MUT3出现位点构成比41.67%占比较高。可能因为1、表型耐药检测(细菌培养)和基因耐药检测(线性探针法)的差异性[49]2、本文运用探针技术进行了基因突变位点的分析：如果样本中出现几种结核菌混合培养或污染时，若有一种含有突变探针不包含的突变，将可能出现野生型带型[50]，及也作为不能明确原因。24 本研究中又针对所有检测样本标本类型包括直接从人体获取的体液标本以及经过培养的培养物的进行总结分析发现：培养物检测的鉴定及药敏与金标准检测结果完全一致。标本结果存在差异考虑可能因为标本中所含有的结核分枝杆菌的菌量非常有限。虽然实验室快速诊断的方法中线性探针法相对灵敏度及特异性均较高，但是也只能作为初筛，建议如果检测的阴性结果一定要进行结核菌培养作为金标准做最终的诊断。耐多药肺结核患者的快速确诊方式建议采用常规的经典培养方法MGIT960与线性探针法耐药性检测相结合进行实验，对于初治的耐多药患者由于尚未确诊故采用MGIT960液体培养法需要2周左右的时间获取到培养物，将培养物进行线性探针法耐药性检测共计2个小时，鉴定及药敏实验总计不到15天的时间就能对初治的耐多药结核患者进行明确的诊断，同时在明确了检测样本中是否含有结核菌的同时也对标本中DNA进行检测，有助于对于患者的传染性进行评估。比较以往的常规培养加药敏共计需要消耗时长一个月省去了半个月的时间，对于患者来讲也是提供了很大的便捷。本次进行了25例耐多药结核患者体内耐药基因突变位点检测及结构比的研究和总结发现，WT缺失/MUT1、WT1缺失/MUT3A、WT8缺失一MUT3出现突变位点比率较高，但是由于标本量较少，不能完全作为主要的指标，有待于增加标本量，寻找共性因素，进行大数据分析，对耐药性肺结核患者基因多态性的研究奠定基础。1.4小结MDR-PTB患者目前诊断以及治疗难度较大，诊断不及时往往容易造成大范围传染，以至于导致初治耐多药肺结核发病人数的增加，本文重点研究了关于耐多药结核病的快速诊断方法，四种快速检测方法进行了比较分析发现线性探针法检测作为新型分子生物学的检测方法无论从灵敏度、特异性均较高，所以本文推荐线性探针法作为结核病的快速筛选的主要方法进行临床推广，而对于耐药性检测中将目前的检测标本类型分类后发现培养物的检测与金标准完全一致，所以本文推荐采用MGIT960液体培养的方法，并将培养出的培养物进行线性探针的药敏检测所用可缩短成为15天左右的时间，比以往常规方法的检测方法所用的至少减少了将近两周的时间，大大提高了辅助诊断的效率。减少了因为诊断时间长而带来的延误病情，选取快速的诊断方法与常规的金标准相结合25 进行分析为辅助临床医生及时准确的对耐多药结核病作出诊断，即快速有准确，且同时采用线性探针法还能对耐多药结核患者基因突变位点进行检测，为其基因多态性的研究奠定了基础。26 二、耐多药结核患者T细胞及细胞因子的变化对治疗疗效评估2.1对象和方法2.1.1研究对象与第一部分中的耐多药结核组一致，且将耐多药结核组分成（1）初治组43例，复治组30例（2）培养未转阴组15例:确诊耐多药结核治疗过程中第6个月末或疗程结束后，痰结核菌培养检查结果仍然为阳性以及痰培养未转阴组;培养转阴组58例：疗程内经过周期性的痰检，连续两次痰培养转阴的患者。健康对照组为体检中心筛查除外结核病史且体健的人员共计56人，男性34人，女性22人，年龄在25-55之间2.1.2治疗方案诊疗规范中提出的标准治疗方案进行治疗：包括吡嗪酰胺(Z)、左氧氟沙星(Lfx)、卡那霉素(Km)、对氨基水杨酸（PAS)、丙硫异烟胺(Pto)5种统一采购的进口的抗结核药物2.1.3仪器FACSCantoⅡ型流式细胞仪(FCM)2.1.4试剂（1）BD公司诊断试剂：标记个:MultiTESTCD3-异硫氰酸荧光素(fluoresceinIsothiocyanate）FITC/CD8-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)/CD45-多甲藻素叶绿素蛋白(peridinin-chlorophyll-proteinPerCP)/CD4-别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)，FACS溶血剂，BDFACS七色校准微球，以及相关配套质控物，标准品（2）BDCBA法人Thl、Th2、Th17试剂盒(BDCBAHumanThl、Th2、Thl7CytokincKit，BDBioscicnccs，USA)。试剂盒主要包含IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A捕获微球各0.8ml,人Thl、Th2、Th17藻红蛋白检测试剂1ml.人Thl、Th2、Th17细胞因子标准品(冻干粉)0.2ml，荧光素的质控液包括：异硫氰酸阳性质控品0.5ml，藻红蛋白的质控品4ml，专用洗液130ml.，试验稀释液30ml的CBAFlexSet检测试剂盒，均为美国BD(BectonDickinson)公司产品。2.1.5方法27 2.1.5.1标本准备选取实验组用药前以及正常对照组枸橼酸钠充分抗凝抽取的4ml空腹静脉血;根据药敏试验和指南接受正规化疗，通过制定表格形式统计总结其治疗过程及转归情况，所有耐多药结核患者组都分别在治疗前及治疗后2个月、6个月取血检测各组人群血清中上述细胞因子水平。样品制备：各组均采集的空腹静脉血4mL，进行离心(4000r/min)后，提取血清进行分装，置-80°C冰箱进行备用，待标本收集完成统一实验。2.1.5.2检测步骤（1）流式细胞仪相对计数T细胞亚群①提取100ul全血加入到流式专用管②各管移入10ul荧光抗体试剂，避光30min③加入溶血剂1ml，避光10min④上机检测，为使其分辨率达到仪器的最佳实验状态使用荧光微球7-colour进行仪器光路的校准⑤采用Canto软件获取与分析数据⑥调整仪器状态，细胞在图中合适的位置上。⑦在FSC/SSC上圈出淋巴细胞群为（RI）⑧SSC/CD3上圈出CD3+T细胞群(R2)⑨形成CD4/CD3，CD8/CD3散点图并设置为显示G3=Rl*R2的细胞⑩一共需要获取10000个细胞，分析Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)细胞的相对计数情况（2）CBA法检测血清细胞因子①准备检测试剂：将试剂盒及缓冲液取出后，置于室温平衡1小时②制备标准品：使用专用稀释液把7种标准品按1：2、1：4、1：8梯度依次稀释到1：256后，充分混匀③阴性对照为专用稀释液④将微球制成混悬液⑤用微球稀释液稀释混合捕获微球达50I/测试的标准，室温15分钟。⑥制备PE标记的信号试剂⑦实验组血清、7种标准品、捕获微球各50vl置于流氏管中，室温避光1h⑧各加入50ul的PE信号抗体，室温避光2h28 ⑨1ml洗液置于试管内，离心5min，离心力为200g，反复清洗2次，倒去上清液后，加入300ml专用洗液，4个小时内进行完成检测。2.1.6统计方法利用SPSS17.0统计分析软件处理；Excel2007建立所需数据库；采用T检验。2.2结果2.2.1T细胞亚群的检测结果耐多药结核患者用药前T细胞亚群与正常对照组进行比较分析，总T细胞+检测两组无统计学差异P>0.05，CD4T细胞较对照组有所减少P<0.05有统计学+++差异，CD8T细胞较对照组有所增高P<0.05，有统计学差异，CD4/CD8发生变化P>0.05无统计学差异。图1.两组T细胞亚群检测结果比较分析2.2.2CellQuest软件获取点图血清中7种CK的CBA法检测用CellQuest软件获取每个样本的点图，依次为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17群微球阴性结果与IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17阳性结果的散点图进行比较29 图2：CBA检测法显示微球获取的散点图图谱30 2.2.3耐多药结核组与对照组中细胞因子含量对比分析耐多药结核患者在用药前检测的结果与健康对照组检测结果比较IL-17、IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量存在显著性差异均较正常对照组有所升高，IL-2结果间也存在统计学差异，较正常对照组低。表1.两组中7种CK表达的对比分析耐多药健康对照t值P值(n=73)(n=56)IL-17344.7（89）121（65）18.33<0.001IL-6231.2（58）200（54）3.11<0.01IL-2110（29）120（23.4）2.106<0.05IL-102.08（0.68）1.98（0.73）0.8010.424IFN-γ2.4（0.67）0.56（0.67）3.394<0.001TNF-α7.06（2.01）5.02（2.03）32.36<0.001IL-47.02（0.35）7.01（2.56）0.1650.8692.2.4耐多药患者中初治组、复治组用药前细胞因子的变化规律IL-17、IFN-γ初治组较复治组含量高具有统计学意义，IL-2、IL-4、IL-6复治组较初治组含量高具有统计学意义图3.初治组、复治组细胞因子表达31 2.2.5耐多药患者中培养转阴组用药前、后细胞因子的变化规律对于58例培养转阴组IL-6、TNF-α、IL-17、IL-10、IFN-γ用药周期内呈现逐渐下降的趋势；IL-2呈现逐渐升高的趋势且均有统计学意义，逐渐恢复到正常水平，IL-4用药前后无显著统计学差异。32 图5.培养转阴组中细胞因子周期性表达*代表P<0.05,**代表P<0.01***代表P<0.0012.2.6耐多药患者中培养未转阴组用药前、后细胞因子的变化规律15例培养未转阴组中IL-17、IL-6、TNF-α、IL-4五种细胞因子在初治患者治疗前后随着疗程的进展呈现显著性差异，IL-2、IL-10、IFN-γ周期性治疗过程中无显著性差异。图6.培养未转阴组细胞因子周期性表达33 2.3讨论结核病的发病机制相当复杂，在免疫功能缺陷或低下人群中发病率相比之下较高[51]，耐多药结核患者用药前T细胞亚群与健康对照组进行比较分析，总T细胞、CD4+T细胞、CD4+/CD8+检测两组无统计学差异，CD8+T细胞较对照组有所增高P<0.01，有统计学差异。说明患者体内免疫系统发生了变化，结核分枝[52]杆菌感染人体后，体内的免疫系统功能紊乱，CD8+T细胞数量升高，可能是因为结核菌引起机体内限制性粘附细胞及抑制性T细胞出现的原故，结核菌细胞壁内物质可以导致携带抗原的巨噬细胞与抗原特异性淋巴细胞的相互间的作用，同时产生活性物质使免疫调节机制中的抑制作用增强之外，而对机体内的免疫活性细胞产生直接抑制，从而使患者体内的免疫细胞数量减少，因此总的T细胞较正常对照变化不大。在耐多药结核患者发病后机体内的免疫系统释放大量的免疫细胞发挥免疫活性作用。机体受到结核分枝杆菌感染以后，免疫状态发生变化，致使一部分T细胞激活同时释放出细胞因子，刺激NK细胞的固有免疫体系形成，消除感染因子，未消除的部分被感染因子进入体内引导产生特异性T细胞免疫应答，对于耐多药结核患者的病情变化以及治疗效果与体内的细胞免疫以及细胞因子的参与同样发挥着主要的作用。［53］试验中采取的检测方法为流式微球技术（CBA）是通过激光束激发荧光编码微球，通过流式细胞仪分析微球表面所带有的信息量完成部分数据信息的收集和换算分析。通过软件中的内容设置，可以自动统计分析得出各个微球复合物上的平均荧光强度，从而对待测样品中目标物质进行定量分析。目前，基于“双抗体夹心式”反应模式，流式微球技术在细胞因子、生长因子等大分子物质检测中得到较多应用。此方法优于以往的流式细胞检测，标本分离出血清-80度冷冻储存后进行统一同批次检测，从而也避免了因为批次、环境因素等不同而导致的结果差异，操作非常简单。与酶联免疫法（EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA）相比较，CBA可以同时分析多种细胞因子，所需样本量较少，实验时间比单次ELISA法大大缩短[54]，所以在检测方法上较以往得到了很大的改进。本文研究七种细胞因子在耐多药结核患者体内发生变化：耐多药结核患者在用药前检测的结果与健康对照组检测结果比较IL-17、IL-6、IFN-γ、TNF-34 α的含量存在显著性差异均较正常对照组有所升高，IL-2结果间也存在统计学差异，较正常对照组低。显示机体感染耐多药结核后启动了人体的免疫系统包括细胞和体液免疫两种，造成免疫系统的功能紊乱释放出大量的细胞因子参与到免疫调节，从而杀死结核菌。43例初治组与30例复治组治疗前细胞因子的比较IL-17、IFN-γ初治组较复治组含量高具有统计学意义，IL-2、IL-4、IL-6复治组较初治组含量高具有统计学意义。初治患者的主要发病原因是因为呼吸道在人群中的传播，进而感染，机体接触到结核菌后激活效应细胞启动免疫机制，释放出大量的细胞因子，IL-17也随着体内致炎作用的逐渐减少，含量也随之减少。IFN-γ增强辅助T的作用，对于机体杀灭病原菌具有一定的作用，对于初治患者来讲，用药前机体会释放大量的IFN-γ，随着诊疗活动的开展体内的细菌含量逐渐减少。由于大部分患者身体抵抗力较弱所以发生的免疫反应存在个体差异。对于30例耐多药结核复治组，由于既往感染过结核菌，体内记忆型T细胞迅速被激活释放出大量与记忆性T细胞相关的细胞因子包括IL-2、IL-4等等所以在用药前较初治组呈现升高趋势，可能与机体内的免疫防御机制也有一定关系。耐药性结核病的诊治与人体所含细菌量的多少，机体免疫状态等因素使的免疫反应的强弱，在整个治疗疗程中是否成功与人体内的免疫保护功能是否得到恢复有密切的关系。本文将实验组分成培养转阴组和培养未转阴组，58例培养转阴组IL-6、TNF-α、IL-17、IL-10、IFN-γ用药周期内呈现逐渐下降的趋势；IL-2呈现逐渐升高的趋势且均有统计学意义，各项菌逐渐恢复到正常水平，IL-4用药前后无显著统计学差异。提示在进行有效的治疗后患者体内的免疫细胞以及细胞因子免疫功能的恢复，IFN-γ变化随结核菌量复制成正比，进而起到免疫保护作用[56]IL-17的逐渐减少说明体内的免疫监视以及免疫调控作用已经初步形成，配合药物治疗将体内的结核菌消灭掉，最终治疗成功，在培养转阴组以及培养未转阴组中细胞释放的细胞因子表现各不相同，在培养未转阴组IFN-γ周期性变化存在差异但免疫保护功能没有完全建立免疫系统，故含量随治疗周期的变化逐渐减少，TNF-α直接参与巨噬细胞拮抗结核杆菌感染当机体内痰液中结核杆菌的检出量增加而升高。发挥免疫保护作用，但过度升高会加重肺结核，形成免疫损害，TNF-α在培养转阴组中用药前水平较高，用药后两个月时略有下降，用药六个月与用药前下降幅度较大，可能与耐多药结核发病机制以35 及耐多药患者的用药机理有关。IL-4、IL-6、IL-10主要介导的是体液免疫，协助B细胞激活生成抗体，具有清除寄生虫感染的作用[57]15例培养未转阴组中IL-17、IL-6、TNF-α、IL-4在治疗前后呈现显著性差异，TNF-α用药后开始升高，IL-17、IL-6、IL-4用药前较高两个月后降低，六个月后呈现升高趋势，IL-2、IL-10、IFN-γ周期性治疗过程中无显著性差异，用药后两个月到用药后六个月细胞因子的变较用药前是相反趋势的现象，提示有可能出现治疗失败，与机体内菌量是否得到控制，机体免疫功能是否恢复具有相关性。从因子的基本功能[65]的角度理解，更加提醒人们细胞因子在抗结核免疫过程中的复杂性，体液免疫以及细胞免疫都有参与结核病发生发展过程。结核分枝杆菌可以引起人体产生［58-63］[64]细胞免疫产生IL-17促炎因子的作用，大量免疫细胞因血清中存在大量的IL-17而延迟凋亡，会对人体造成非常大的危害，因为其最终引发机体发生免疫病理反应，炎症部位召集了大量的效应细胞，进而迅速聚集到一起，集中消灭了结核分支杆菌，进而是否在正常情况下能杀死体内的结核分枝杆菌可能还取决于机体的免疫系统的状态以及菌量的多少、个体间存在差异等因素造成［65-67］，IL-17在耐多药结核培养转阴组与初治组发展趋势较为一致，用药前以及用药后2、6个月数值持续下降恢复正常，在做治疗的过程中治疗有效，结核菌被消灭后逐渐减少的趋势。在耐多药结核患者的早期会出现的危害较小，通过聚集效应细胞、促进特殊的因子进行分泌，从而对感染者产生保护性免疫作用。最近研究比较多的一类最新的细胞因子，结核菌感染导致机体产生对保护性及损伤性免疫反应。耐多药结核患者机体免疫细胞较紊乱，抑制性T细胞增加，且T细胞释放出大量的细胞因子参与免疫调节及免疫病理反应中。初治患者：患者临床症状较重，免疫反应性较强所以随病情变化的IL-17及IFN-γ含量较高；复治组：记忆型T细胞释放大量细胞因子，以IL-2、IL-4变化为主含量较高。培养转阴组：IL-6、TNF-α、IL-17、IL-10、IFN-γ、IL-2各阶段呈现规律性变化，且逐渐恢复到正常水平，视为治疗有效，可持续原治疗方案，说明免疫系统逐渐恢复；培养未转阴组患者：用药前、用药后2个月、6个月7种细胞因子均无出现规律性变化，用药2月、6月较用药前呈现相反的变化趋势提示可能治疗未成功，机体内的结核菌仍为减少，免疫功能仍未彻底恢复。确定了机体在治疗耐多药结核患者用药前与用药后机体的免疫系统中的免疫保护功能、免疫抑制功能、免36 疫记忆功能发生了很大的变化，依据变化的指标对耐多药患者的治疗效果给予建议性评估。2.4小结综上所述，结果提示对于耐多药结核患者体内的辅助性T细胞以及抑制性T细胞较正常对照组有所增高并且存在统计学意义，实验又对研究数据进行了重新的分组，依据T细胞的相对值的变化的规律了解病人体内的免疫功能状况，通过细胞因子在不同分组不同周期变化的情况可以初步推断出患者经过周期性用药是否有效，而及时做出治疗方案的调整，同时使用免疫抑制剂治疗耐多药结核病提供指导意见。确诊耐多药结核病后进行抗结核治疗过程中体内发生的细胞免疫以及体液免疫依据T细胞变化规律初步推断推测病人免疫功能状态，及时做出治疗方案的调整。依据机体内细胞因子变化的规律了解初治、复治、培养转阴患者、培养未转阴患者体内免疫反应的状况、免疫保护功能恢复情况、细胞因子周期性表达进行评估，从而协助临床医生对临床用药是否有效性的预判及治疗效果的评估参考依据，以及该病种进行基因免疫制剂治疗开拓了新的思路和方向。37 结论MDR-PTB患者目前诊断以及治疗难度较大，诊断不及时往往容易造成大范围传染，以至于导致初治耐多药肺结核发病人数的增加，本文重点研究了关于耐多药结核病的快速诊断方法，依据本文的研究结果表明选取分子生物的实验室诊断方法线性探针法无论从灵敏度还是特异度上，以及对耐药性的评估与金标准的一致性上均存在较大一致性，所以建议目前采用线性探针法对耐多药结核病进行初筛诊断，同时采用常规的结核菌培养后将培养物进行线性探针法的药敏检测，较常规的检测方法节省了大概半个月的诊断时间，提高了诊治的时间，避免了因延误诊断而导致的人群间的传播。分子生物诊断方法作为世界卫生组织推荐的检验结核病方法作为诊断耐多药结核病的首选较以往传统的检测方法优势较为明显，同时也为将来进行耐多药结核患者的基因多态性的研究。确诊耐多药结核病后进行抗结核治疗过程中体内发生的细胞免疫以及体液免疫依据T细胞变化规律初步推断推测病人免疫功能状态，及时做出治疗方案的调整。依据机体内细胞因子变化的规律了解初治、复治、培养转阴患者、培养未转阴患者体内免疫反应的状况、免疫保护功能恢复情况、细胞因子周期性表达进行评估，从而协助临床医生对临床用药是否有效性的预判及治疗效果的评估参考依据，以及该病种进行基因免疫制剂治疗开拓了新的思路和方向。38 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综述T细胞相关细胞因子在结核诊疗中的研究结核菌(MycobacteriumtuberculosisMTB)侵入人体后，机体产生的免疫反应以T淋巴细胞介导细胞免疫及迟发性变态反应两种形式为主,在杀灭MTB中起到重要的作用,而且免疫过程中的抵抗病菌的活性受到多种激活的细胞因子的调节[1],本文通过对部分细胞因子在结核病诊治过程中含量、基因、以及联合检测中变化的规律进行综述。干扰素-γ在多种结核病的诊断中的检测的敏感性以及检测的特异性都很高,而且对发病部位标本的检测对诊断更有意义。白介素-2周期性检测可以提示结核病病人的治疗效果，而且与部分细胞因子相联合具有治疗耐多药结核的作用。肿瘤坏死因子-α为判断治疗效果的提供参考,在辅助诊断肺外结核患者有意义。白介素-4在结核中的作用还需进一步研究探讨。IL-17对潜伏性、活动结核病诊断特异性以及敏感性较高。IL-10在结核病人体内的周期性变化,对治疗过程及效果进行评估,但无法预测阳性患者预后。IL-15,IP-10,IL-8,IL-2,IL-2Ra,MIP-l0在潜伏性结核感染组与活动性感染组比较差异。细胞因子多态性的检测根据统计学要求的大样本量,相关影响因素必须相对一致才能得到相对较为精准的结果,为结核病的预判提供依据。细胞因子的含量、联合检测、多态性对结核预判、诊断、治疗、效果评估有至关重要的作用。近年来，活动性肺结核、耐药性肺结核、复发结核病、潜伏性肺结核的现象仍然作为结核病诊断和治疗的难点。耐多药结核有研究调查显示中国每年有新发病历约12万的快速增长速度，已经位于世界前列[2-3]，形势非常严峻，所以研究结核病机体内细胞因子免疫反应的变化规律进行分析,从而对结核病的预判、诊断、治疗、疗效评估提供有利指导意义。1、干扰素-γ(IFN-γ)IFN-γ是抗结核感染免疫中非常重要的细胞因子之一,现阶段最常用的实验室方法为IFN-γ释放试验(interferongammareleaseassayIGRA)[4-5],及结核感染T细胞实验（T-SPOT.TB）及当人体内的记忆性T细胞接触到特异抗原,释放出细胞因子γ-干扰素，通过免疫斑点法或酶联免疫发进行定量检测。T-SPOT.TB中采用特异性抗原是含有RD1基因,而RD1基因只在致病性的结核菌群存在,因此实验结果不会受接种卡介苗以及体内的非结核分枝杆菌感染的影响从而出现假46 阳性的现象。活动性肺结核IFN-γ-释放试验的灵敏度80%-90%[6-8]且在肺外结核骨结核的的灵敏度为94.2%[9],，对结核性胸膜炎患者胸腔积液进行结核感染T细胞检测，敏感性达90.1%,特异性达88.0%。[10],通过全血和胸腔积液共同T-SPOT.TB，两者结果进行综合分析更有助于结核性胸膜炎的诊治[10]。对于隐性肺结核抗原的免疫原性不相同,刺激细胞产生IFN-γ不一致,所以干扰素释放实验对诊断潜伏性肺结核或活动型肺结核准确率较高,但是两者之间的区分还是做不到的[12]。艾滋合并肺结核病人因为机体内存在免疫缺陷，所以实验室免疫学方法有一定的局限性,所以从快速检测的几种免疫学方法进行筛选T-SPOT.TB阳性率相对不低[11]。因为艾滋病人CD4+T细胞较低，很难捕获到到的T细胞较少，所以即便阴性结果不能完全排除活动性结核病，应综合性考虑。活动期肺结核，机体IFN-γ水平也会随着结核治疗疗效变化而发生变化。一般在抗结核用药前期产生很少的量,但有效用药后2个月则恢复正常,整个疗程结束后停止,在结核治疗效果评估上有一定意义,IFN-γ的检测是与结核病诊断和发病关系最紧密的一类细胞因子，有些研究发现IL-23能诱导分化特异性的CD4+T细胞产生IFN-γ,该细胞因子在肺结核组分泌水平均高于正常人群,与IFN-γ比较呈正相关性,猜测在控制结核反应中有一定意义[13],实验室诊断与临床表现相结合从而提高结核病诊断的准确率。2、白介素-2(Interleukin-2IL-2)在结核感染过程中，IL-2主要促进NK细胞的成熟,提高单核-巨噬细胞的细胞毒性以及杀菌力等[14],从而导致细胞内结核菌死亡。肺结核患者在治疗前以及治疗后两个月末患者体外血清中的IL-2水平降低[15],可以通过IL-2周期性变化规律来判断肺结核的治疗效果。同时在耐多药结核基础鼠模型中检测,IL-2和GM-CSF能增强抗结核药物的治疗疗效,而且使菌落数的显著减少[16],因此通过对IL-2及GM-CSF的联合免疫治疗耐多药结核病人起到较好的效果。3、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-αTNF-α)TNF-α使巨噬细胞产生抗结核免疫作用,有研究报道,肺结核初始诊断者未治疗组中血清TNF-α水平,有效治疗的患者中用药前与用药后TNF-α的水平比较呈逐步下降趋势[17],研究显示活动性结核体内TNF-α+CD4+T淋巴细胞数量比潜伏性肺结核数量要多[18],但是研究的标本量较小，有待于增加标本量试验数据进行分析及再次评估。TNF-α在肺外结核诊断也有研究,TNF-α在骨结核肉芽肿中47 呈不同程度的阳性表现[19];在结核性胸膜炎体内胸水及外周血检测的TNF-α的含量均呈明显增高趋势[20]。因此可通过不同部位的TNF-α的测定辅助结核性胸膜炎的诊断。4、白介素-4(Interleukin-4IL-4)IL-4在结核病人中的意义并不统一,首先Hanne等认为,处于结核分枝杆菌聚集地的健康人体内抗IL-4抗体比普通地区高[21],似乎证实了结核病人体内IL-4水平越高对机体的自我保护越强,但还有研究表明在肺结核患者中IL-4水平明显高于健康者[22],耐药结核患者血清IL-4及IL-5也较正常对照组增高[23],从而在结核细胞免疫反应的过程中主要起到负反馈调节。所以对于IL-4的含量在结核患者中的作用机制还需进一步研究和证实。5、细胞因子IL-17、IL-22研究IL-17在活动性结核病人体内主要是募集中性粒细胞到炎症部位引起急性结核感染时免疫保护的作用的生成[24]。IL-17在结核病早期以γδT细胞分泌为主,随着病情的发展TH17分泌的细胞因子含量逐渐增加，目前研究较多的是TH17细胞分泌白介素17在各类结核中的反应情况。Tan等发现在耐药性肺结核中IL-17水平较正常对照组增加的,治疗有效后IL-17水平减少,提示治疗后免疫力功能得以改善[25]。潜伏感染与结核菌素实验阳性的健康人群中IL-17表达也是增高的，而且与免疫病理损伤是同步的[26]。因此IL-17的检测能对活动性肺结核、耐多药结核、潜伏性肺结核的诊断提供一定的辅助诊断意义。中央记忆型CD4+T同时释放IL-17和IL-22[27]，IL-22偶尔可以在卡介苗阳性健康成人体能检测到，但在正常健康人群中外周血中央记忆型CD4+T细胞的数量较少,很难检测到，而当人体接触到活的结核分枝杆菌后,该类细胞明显升高[28]。因此周期性的检测中央记忆型CD4+T细胞对预判和诊治效果的评估具有非常重要的指导作用。6、其他IL-10的产生主要通过中性粒细胞以及巨噬细胞等分泌,对免疫细胞具有抑制作用,在免疫过程中起到的负反馈调节作用。治疗有效59例结核患者中治疗前显著低于治疗两个月,而在治疗六个月末又恢复到治疗前水平[29],提示治疗前期结核菌含量较高,抑制机体的免疫反应,当抗结核药使用后菌量减少,激活体内的免疫反应,后期结核菌消除后机体内的含量又恢复正常,其动态变化提示机体说明结核病人在治疗过程中机体抗结核免疫反应的快慢。IL-10在结核病人体内的48 周期性变化,对治疗过程及效果进行评估,但无法预测阳性患者预后。IL-15,IP-10,IL-8,IL-2,IL-2Ra,MIP-l0这6种细胞因子的表达在潜伏性感染组活动性感染组比较差异有统计学意义[30-32]。7、相关性细胞因子的基因多态性与结核易感性的相关性基因多态性是指启动子、编码区内的单核普酸多态性影响基因表达水平和生物学功能多态性变化,其可能与肺结核易感性特异的单倍型结构的变化而不动,从而有可能影响结核病发病、遗传的易感型。Wang等对487例结核病人以及1802例对照组通过metal分析IFNGRI-56C/T基因多态性与非洲人肺结核易感性可能相关,而与亚洲人及白种人肺结核易感性关系不大[33]。综合一部分文献显示IL-8+781C/T位点和CXCRl+2608G/C位点、TNF-α基因rs799724多态性、IFN-γ+874位点、IL-4T590C基因多态性可能与固定人群肺结核发生的易感性不存在显著相关性[34-36]。各25例青海藏族结核病人以及健康人群进行IL-4T590C和TNF-aG308A基因多态性检测，metal分析显示IL-4T590C和TNF-aG308A基因多态性与青海藏族结核病发病易感性无统计学意义[37]。IL-17的研究在炎症发病方面的作用研究较多,428例有吸烟习惯的结核病人以及428例正常对照组进行比较分析发现IL-17，rs763780基因多态性在结核患者的发病、转归等方面发挥至关重要的意义[38]。细胞因子基因多态性的检测对结核病的发病以及预测有很重要的意义,基因关联性的检测要求在大样本的基础上完成,相关影响因素相对一致,如生活环境、遗传、接触史、生活习惯等,才能得到相对较为精准的结果。综上所述,通过对结核感染病人体内细胞因子无论是从含量、相关受体的含量、多态性、联合检测等方面的综述,检测及联合检测可以大大提高活动性结核诊断的敏感性和特异性,而且对于诊疗效果的评估可以根据部分细胞因子周期性的变化判断,从而指导临床医生合理用药,细胞因子基因多态性的研究国外研究较多,在大样本,影响因素较多的基础上,可以提示患结核病的风险,从而起到早发现早治疗的效果。所以随着细胞因子的含量和种类繁多以及实验室技术的不断提高,有待于我们更进一步的研究和发现,从而为结核病人预测、发病、疗效观察、预后评估等方面提供更有力的支持。49 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个人简历姓名：孙海柏性别：女出生年月：1981年3月籍贯：天津主要学习和工作经历：（从本科开始）2003年9月-2006年9月天津市医科大学医学检验获学士学位2006年8月-2016年5月天津市海河医院检验科免疫室2016年5月-今天津市海河医院检验科副主任2014年7月-今天津医科大学免疫学专业攻读硕士学位55