游离氨基酸测定(完整版)

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1、总游离氨基酸测定（完整版）实验原理：游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物二酮茚－二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉.仪器与用具：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×1;沸水浴；具塞刻度试管20ml×10;分光光度计.一、试剂1.水合茚三铜：称重结晶的茚三铜0.6g,装入烧杯，加入正丙醇15ml，使其溶解加入正丁醇30ml、乙二醇60ml

2、、乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=5.4）9ml,混匀，棕色瓶冰箱保存，10天内有效。2.乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4g，加入无氨蒸馏水100ml，电炉加热至沸，使其体积减半，冷却后加冰乙酸30ml，加蒸馏水定容至100ml。3.氨基酸标准溶液：精确称取80℃烘干至恒重的亮氨酸0.0234g溶于10％异丙醇并定容至50ml。取此液5ml蒸馏水稀释到50ml，即为5μg/ml氨基酸标液。4.0.1%抗坏血酸：称取0.050g抗坏血酸，溶于50ml蒸馏水中，即配即用。5.10％乙酸二、标准曲线制备试剂管口123456

3、氨基酸标液5μg/ml00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水2.01.81.61.41.21.0水合茚三铜3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸0.10.10.10.10.10.1每管含氮量012345加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。以吸光度为纵坐标，氨基氮ug数为横坐标，绘标准曲线三、实验步骤：1.烟末0.5g于研钵中加入5ml10%乙酸，研磨匀浆后用蒸馏水定容100ml，用滤纸过滤到三

4、角瓶中备用。2.1ml滤液加入到20ml干燥试管中，加1ml蒸馏水，水合茚三铜3ml,0.1%抗坏血酸0.1ml,加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。四.计算：求三重复的平均值，由标准曲线得知各样的氨基酸ug数，代入公式计算。氨基酸含量（mg/g干样）=｛氨基酸ug数×（提取液总体积/测定体积）｝/（样品g数×1000）