游离氨基酸的测定实验报告.doc

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1、游离氨基酸的测定实验方案（茚三酮比色法）一、实验目的茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸含量，利用氨基酸含量这个参数，控制发酵过程。二、实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。三、实验材料发酵液样品；实验试剂：水合茚三酮；氨基酸标准液；0.1%抗坏血酸实验仪器：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；移液器；枪头；沸水浴；具塞刻度试管20

2、ml×10；分光光度计四、实验方法1.溶液配制（1）水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9mlPH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。（2）氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ml），取此液5ml，用水定容至50ml，此为含氮量5ug/ml工作液。（3）0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100ml，随用随配。2.标准曲线绘制取6支20ml试管，按下表加剂：试剂管号123

3、456亮氨酸标准液(ml)00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮(ml)3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸(ml)0.10.10.10.10.10.1氨基氮量（ug/管）01.02.03.04.05.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min，取出后立即用冷水摇动冷却，用60%乙醇定容至20ml，摇匀。λ=570nm处测定吸光度00.0250.0550.0990.1460.186以吸光度为纵坐标，氨基氨ug数为横坐标，绘标准曲线如图：3.样品中游离氨

4、基酸的测定取20ml试管，取待测液1ml，加蒸馏水lml，水合茚三酮3.0ml，坏血酸0.1ml，混匀，封口。沸水浴加热15分钟，冷水中摇动冷却，用60%乙醇定溶至20ml，摇匀，于570mn测定吸光度。五、结果统计测得吸光度，由标准曲线得知样液的氨基氮ug/mlm，代入公式十算：A=0.0382m-0.0103式中：A为吸光度，代入公式算得m（ug/ml）。