(全)微生物综合实验2012.11

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1、《微生物学综合实验》一、大肠菌群(M.R.N.)的测定1、目的和要求（1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义  （2）学习并掌握大肠菌群的检验的原理和方法，以判别食品的卫生质量 2 、原理大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。三步法：（1）发酵乳糖，产酸产气初发酵实验；（2）初发酵阳性管通过伊红美蓝平板进行分离；（3）复发酵对分离菌

2、作证实实验食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。 最近似数（most probable number-简称MPN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。3 、材料3.1 样品乳、肉、禽蛋制品、饮料

3、、糕点、发酵调味品或其他食品。3.2 菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）3.3 培养基及试剂乳糖胆盐发酵管（单料或双料）、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、无菌生理盐水（9ML/试管，225ML/250ML三角瓶，内含适量玻璃珠）、75%酒精棉球等3.4 其它恒温箱、恒温水浴、药物天平、无菌培养皿、无菌吸管（1ML、10ML）、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、匀质器、载玻片等84 、流程样品（无菌称量25g）→稀释{温热的225ml灭菌生理盐水锥形瓶；再作1：1

4、0稀释度（即取1ml第一次稀释后的样品，加入到装9ml重量盐水的试管中）；再做1：100稀释度}→接种（各取1ml接种）（选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管）培养（24±2h，36±1℃）→初发酵结果：⊙若不产气，即为大肠杆菌阴性，报告大肠杆菌阴性。⊙若产气，划线伊红美蓝平板（18-24h，36±1℃）培养→分离结果：⊙用革兰氏染色：若为G+阳性，报告大肠杆菌阴性；⊙若革兰氏染色G-阴性无芽孢杆菌，→接种（复发酵）乳糖发酵管（24±2h，36±1℃）培养→结果：产气，报告大肠杆菌阳性；不产气，报告大肠杆菌阴性。5 、步骤取样及稀释，做成

5、1:10、1：100的均匀稀释液为检样。同一稀释度接种3个乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。以无菌操作取检样25g（或25ml），放于225ml灭菌生理盐水的灭菌广口瓶（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振荡或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000—10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml,沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及吸管内液面),振摇试管混合均匀,制成1:

6、100的稀释液。另取1.0ml灭菌吸管,按上操作顺序,制成10倍递增的稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1.0ml吸管。5.1 乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。5.2 分离培养将产气的

7、发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出, 观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。85.3 证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳 性。5.4 报告根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。6 、结果6.1试验结果表接种量管号 发酵反应结果有无典型菌落革兰氏染色结果复发酵反应结果最后结论+或-

8、1ml1230.1ml1230.01ml123注：填写初发酵与复发酵结果应以下列符号表示。“-”表示不产酸也