MMFSCNJ出口肉及肉制品中卡那霉素残留量检验方法.docx

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1、MM_FS_CNJ_01出口肉肉制品卡那霉素残留量杯碟法MM_FS_CNJ_0134出口肉及肉制品中卡那霉素残留量检验方法1.适用范围本方法适用于出口禽肉中卡那霉素残留量的检验。2.原理概要用磷酸盐缓冲液抽提试样中残留的卡那霉素，经均质、离心，取上清液进行杯碟法测定。利用被测定样液中的残留卡那霉素与枯草杆菌的作用，产生抑菌圈，从抑菌圈大小用标准曲线法进行定量测定。3.主要试剂和仪器.主要试剂卡那霉素标准品：775卩g/mg,由中国药品生物制品检定所提供；缓冲液I土：称取无水磷酸二氢钾及无水磷酸氢二钾溶于水中，定容100

2、0mL121°C高压灭菌15min；缓冲液n±:称取无水磷酸二氢钾及氢氧化钾溶于水中，定容1000mL121C高压灭菌15min；缓冲液川土：称取无水磷酸二氢钾及无水磷酸氢二钾溶于水中，定容1000mL121C高压灭菌15min；试验菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），由中国药品生物制品检定所提供，菌株号63501；生理盐水：称取氯化钠，溶解于1000mL水中，121C高压灭菌15min；卡那霉素标准储备液：准确称取适量的卡那霉素标准品，精确到±，用缓冲液I溶解并定容至1000卩g/mL,置4C冰箱

3、保存，可使用一个月；卡那霉素标准工作液：吸取一定量卡那霉素标准储备液，用缓冲液U稀释成、、卩g/mL的标准工作液。以上溶液均须当日配制和使用；培养基保存及增菌用培养基（见附录A中A1）o基层及菌种用培养基（见附录A中A2）o.仪器培养皿：内径90mm底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖；牛津杯：不锈钢管，外径土mm内径土mm高度土mm游标卡尺：测量范围0〜200mm精度；绞碎机：电动；均质器：不低于10000r/min；离心机：不低于4000r/min；恒温培养箱：（36±1）C,搁板应保持水平；高压灭菌器；恒温水浴

4、锅；其他：实验室常用玻璃器皿。4.试样的抽取与制备.检验批以不超过2500件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。.抽样数量批量，件最低抽样数，件仆25126〜1005101〜25010251〜50015501〜1000171001〜250020.抽样方法按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，抽取的原始样品总量不少于2kg，放入清洁容器内，加圭寸后，标明标记及时送交实验室。如每件中无小包装或有小包装但每袋重量超过2kg者，则可用灭菌刀具在抽出的包件中，

5、每件割取不少于100g样品，混合后置清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的总量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。.试样制备从取回的原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀。用四分法缩分出不少于500g作为试样。装入清洁容器内，加封后标明标记。.试样保存将试样于—18C以下冷冻保存。注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。1.过程简述.样液制备称取试样于均质杯内，加入20mL缓冲液川，搅匀，放置60min，均质2min(10000r/min)后

6、，移入离心管中离心30min(4000r/min)。取上清液检查pH，必要时用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至土，此溶液作为样液。.芽胞悬液的制备取适量生理盐水加入已培养好的枯草杆菌63501试管斜面中，制成悬液。取1mL悬液涂布于装有增菌用培养基(见附录A中A1)的克氏瓶中，置培养箱(36±1)C培养7天。镜检芽抱数达85鸠上，用适量生理盐水洗下菌苔，置于(65±1)C恒温水浴中加热30min,经离心(3000r/min)20min，弃去上清液。再加生理盐水洗涤，经离心后弃去上清液，如此重复洗涤芽抱悬液三次。置常温

7、24h后再置于(65±1)C恒温水浴中加热30min,然后用适量生理盐水制成芽抱悬液。置4C冰箱中可保存数月。.芽胞悬液用量的确定在实际测定前，应先用卩g/mL卡那霉素标准工作液对加有不同量的芽胞悬液的平板进行预测试，经培养后能使卩g/mL标准工作液产生直径》10mm青晰、完整的抑菌圈的最佳芽胞悬液用量。.检定用平板注入10mL基层培养基(见附录A中A2)于灭菌培养皿内，水平静置，使其凝固。将基层培养基(见附录A中A2)熔化，冷却至50E左右，加入适量(从测得)的芽胞悬液使之充分混合后，取约7mL注入已铺有基层培养基的

8、平板中，保持水平，使其凝固。所用平板须当天制备。.标准曲线的制备用卡那霉素标准工作液制备标准曲线，以卩g/mL浓度的标准工作液为参考浓度。每个标准工作液浓度取三个检定平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使牛津杯在半径为的圆面成90°角间距，对角两个杯加卩g/mL参考浓度标准工作液，另两个对角杯加其他浓度的一种标准工作液。4个浓度