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1、MM_FS_CNJ_01出口肉肉制品盐霉素残留量液相色谱-质谱法滤纸片法MM_FS_CNJ_0121出口肉及肉制品中盐霉素残留量检验方法1.适用范围本方法适用于出口鸡肉中盐霉素残留量的检验。2.原理概要用甲醇提取试样中盐霉素残留，提取液与四氯化碳进行液-液分配。将四氯化碳提取液减压浓缩至干，残渣用正己烷溶解。过硅胶柱净化，用三氯甲烷-甲醇溶液洗脱。洗脱液减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解，溶液再过氧化铝柱净化。所得甲醇溶液经减压浓缩至干，再以甲醇溶解残渣，并定容为样液。样液用滤纸片法测定，利用样液中盐霉素残留与嗜热脂肪芽孢杆菌
2、作用产生抑菌圈，根据抑菌圈大小用标准曲线法定量。3.主要试剂和仪器.主要试剂无水甲醇；甲醇水溶液：10％，90％（V/V）；四氯化碳；正己烷；三氯甲烷；三氯甲烷-甲醇（95＋5）；无水硫酸钠：经650C灼烧4h,置干燥器中冷却后备用；硅胶：60目。经130C活化2h，置干燥器中冷却后备用；氧化铝：270〜335目。经300E活化3h,于干燥器中冷却备用；硅胶柱：将3g硅胶装到层析柱（高200mm内径10mm内，在其上部再装填2g无水硫酸钠；氧化铝柱：将活性氧化铝5g装填入层析柱（高20mm内径10mm中;盐霉素标准品：纯
3、度979卩g/mg，中国兽药监察所提供。密封避光、防潮，4C冰箱保存；盐霉素标准贮备液：称取适量的盐霉素标准品（精确至，用无水甲醇配制成浓度为500卩g/mL的标准贮备液。于4C冰箱中保存，可使用二周；盐霉素标准工作液：吸取一定量盐霉素标准贮备液，用10％甲醇溶液稀释成浓度为2、4、816、32卩g/mL的标准工作液，其中4卩g/mL为参考浓度的标准工作液，以上溶液须当日配制和使用；试验菌种：嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus，菌号ATCC1014，9由Americantypecult
4、urecollection提供；培养基I（附录A中A1）；培养基U（附录A中A2）；培养基川（附录A中A3）；生理盐水：称取氯化钠，溶解于11水中，于121C高压灭菌15min。.仪器培养皿：内径90mm底部平整光滑的玻璃或塑料皿，具陶瓦盖；滤纸片：直径10mm厚，吸水量〜的滤纸圆片，日本ToyorOkaisha,ltd.产品，或相当的产品微量注射器：10〜100卩L;游标卡尺：测量范围0〜200mm精度或抑菌圈测量仪；均质器：不低于10000r/min；离心机：不低于8000r/min；恒温培养箱：(55±1)C,隔板
5、保持水平；高压灭菌器；绞碎机：电动；旋转真空蒸发器。1.试样的抽取与制备.检验批以不超过2500件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。.抽样数量批量，件最低抽样数，件1〜25126〜1005101〜25010251〜50015501〜1000171001〜250020.抽样方法按规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品。如每件中无小包装,或有小包装,但每袋重量超过2kg者,可用灭菌刀具在抽出的包件中每件割取不少于100g,作为原始样品，原始样品总量不少于2kg
6、,混合后，置于清洁容器内,加封并标明标记,及时送交实验室。.试样制备从原始样品中取出部分有代表性的样品,将可食部分用绞碎机绞碎,充分混匀,用四分法缩分出不少于500g作为试样,装入清洁容器内,加封并标明标记。.试样保存将试样于—18C以下冷冻保存。注：在抽样及制样的操作过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。2.过程简述.样液制备称取10g试样(精确至于均质杯内，加入20mL甲醇，于10000r/min均质3min。移入离心管中离心30min(8000r/min)。吸取上清液置分液漏斗中,于残渣中再加入3mL
7、甲醇，搅匀，离心。合并上清液，加入80mL四氯化碳，振摇10min,移四氯化碳层于500mL茄形瓶中。同上重复操作两次，合并三次四氯化碳层。于40〜45C减压浓缩至干，加入20mL正己烷溶解残渣。将正己烷溶液移入硅胶柱中，以min流速过柱。用100mL三氯甲烷淋洗后弃去流出液。用30mL三氯甲烷-甲醇溶液进行洗脱。将洗脱液于40〜45C减压浓缩至干，加入20mL甲醇溶液(90%)以溶解残渣。溶液再过氧化铝柱，用20mL甲醇溶液(90%)淋洗，收集全部流出液，于40〜45C减压浓缩至干。加入mL甲醇以溶解残渣，所得溶液作为
8、最终样液。.菌悬液的制备将嗜热脂肪芽抱杆菌接种于培养基I内，于（55±1）C培养（17±1）h。于8000r/min离心15min,弃去上层液。加入适量生理盐水，离心，反复洗涤，弃去洗液。最后加入30mL生理盐水，制成菌悬液，于4°C冰箱保存，可使用6〜8个月。.检定平板的制备在制平板前，先用吸有的2卩g/mL浓度的
