甲胎蛋白抑制pten活性导致肝癌细胞耐受atra诱导凋亡探究

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1、甲胎蛋白抑制PTEN活性导致肝癌细胞耐受ATRA诱导凋亡探究　　【摘要】目的研究分析甲胎蛋白对PTEN活性产生抑制引起肝癌细胞耐受ATRA发生凋亡。方法选取2012年11月～2013年11月期间本院诊治36例肝癌患者，将患者术后肝癌细胞制成标本。结果人体肝癌HepG2与Bel7402细胞均存在PTEN表达，经160μmol/L的ATRA处理24h后可加强这些细胞的PTEN的表达。Co-IP技术实验得知甲胎蛋白可与PTEN相结合，最终对ATRA产生影响。结论肝癌细胞中表达的甲胎蛋白可与PTEN相结合，最终发现AFP为肝癌细胞耐受ATRA

2、的重要因子。【关键词】甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌细胞；ATRA肝癌是人类健康最大的威胁疾病中的一种，因为受到病毒性肝炎、环境等有关因素的影响，导致肝癌发病的机率逐渐升高。因为肝癌细胞会出现再生、转移，同时癌细胞对药物存在一定的耐受，从而增加了治疗难度。因此，充分掌握肝癌耐药因子的机制，对临床肝癌的治疗十分重要。甲胎蛋白（简称AFP）是肝癌细胞合成的具有很高特异性的蛋白质之一，绝大多数肝癌患者在发病期会产生AFP基因高表达的特点，并且AFP是肝癌诊断的金标准。有资料指出，3肝癌细胞产生的AFP能加强肿瘤细胞增殖与诱导肿瘤细胞的双重作用

3、。PTEN则是将3-磷酸肌醇（简称PIP3）水解成2-磷酸肌醇（简称PIP2）的磷酸酶，同时可以避免3-磷酸肌醇激酶（简称PI3K）磷酸化蛋白激酶B（简称PKB/AKT），导致PI3K/AKT信号传导被中断，可见是一种非常关键的抑癌基因。AFP的生物学性质可能还存在对ATRA抗凋亡产生诱导作用，但是肝癌细胞合成的AFP在机体中肝癌细胞耐受凋亡过程具体发挥的作用报道较少，现本次研究进一步探讨AFP在人体肝癌细胞中对PTEN活性产生的影响，总结如下。1资料与方法1.1一般资料选取2012年11月～2013年11月期间本院诊治36例肝癌患者

4、，并在患者术后肝癌组织中提取HLE、HepG2、Bel7402细胞加以培养。实验蛋白质材料：ser473多克隆抗体、兔抗人AKT/PKB多克隆抗体、小鼠抗人AFP单克隆抗体均源自PS公司。Β-Actin单克隆抗体及鲁米诺试剂源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗体由美国实验室视觉公司生产。二抗是羊抗兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠。FITC标记的羊抗兔与TRITC标记的羊抗小鼠二抗由美国杰克逊IR公司生产。RNA干扰试剂盒，即癌/GFP/Neosi-RNA表达载体试剂盒由上海吉玛公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提

5、供。pcDNA3.1载体源自广州泰盛公司。31.2方法应用Westernblotting法对全反式维甲酸（简称ATRA）进行分析并处理人体肝癌HepG2、Bel7402细胞24h后，PTEN表达产生变化的情况[2]。通过免疫共沉淀（简称Co-IP）技术分析PTEN与AFP之间相互作用。应用激光共聚焦显微镜监测PTEN与AFP在细胞内的共定位情况。通过RNA干扰（即指RNAi）技术对AFP的表达产生抑制作用，然后采用ATRA处理24h后，检测细胞中PTEN表达发生变化的情况，同时研究蛋白激酶B（简称AKT）的磷酸化程度。再利用pcDNA

6、3.1质粒、人体afp基因连接组成表达AFP的载体（简称pcDNA3.1-afp），最后转染成不表达AFP的人体肝癌HLE细胞。1.3统计学方法运用统计学软件SPSS16.0对组间试验研究数据加以统计学分析，应用t法对组间计量资料进行检验，应用χ2检验对组间计数资料进行检验。如若对比差异P3