最新葡萄球菌肠毒素C纯化探究总结幻灯片.ppt

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1、葡萄球菌肠毒素C纯化探究总结一、培养基及培养条件的优选二、用分子截留方法浓缩肠毒素原液三、用DEAE-纤维素（系Pharmacia产品）柱层析作第一步提取四、用SephadexG-75分子筛层析柱进一步纯化五、纯化前后SET-C的SDS-PAGE鉴定六、纯化后的SET-C分子量测定七、对SET-C纯化品的N末端氨基酸测定前言为了检测“金葡素”制剂中有效成份葡萄球菌肠毒素C(SET-C),我们对提纯SET-C方法进行了较为系统的研究。经多次试验，认为按四部法提取SET-C能获得较好效果，并对SET-C的某些生物学特

2、性作了探索。现总结如下：三、用DEAE-纤维素（系Pharmacia产品）柱层析作第一步提取一般要求DEAE-纤维素40～100目，临用前过筛，再以蒸馏水漂洗，去除细微粒子。用1%NaoH和和1%HCL交替处理后直至洗涤液呈中性。再用0.01mol/LPH5.4PB冲洗平衡，装柱。柱大小为4.1×42cm。装柱时切忌气泡进入，装好柱后用同一PB缓慢洗涤使整个柱内达到平衡，然后上样。即将上一步浓缩透析过的SET-C原液缓慢加入使全部入柱后。先用PH5.00.01mol/LPB洗涤，使有色液体流尽。其后作分管收集，每

3、10分钟收集一管，其量为7.5ml，对收集液逐管在OD280nm紫外分光自动检测仪测蛋白峰出现管数。其后相继换用PH6.6、0.06mol/LPB和PH6.8，0.2mol/LPB分步洗脱，洗速为45ml/hr，每管仍用OD280nm紫外分光自动检测仪测洗脱液蛋白吸收峰。并对各峰洗脱液合并，再用反相胶乳凝集试验（RPLA）检测是否有SET-C存在，合并蛋白峰。收集结果证明SET-C在第Ⅱ峰，结果见图1，并对Ⅱ峰用PEG浓缩至一定量，提供下一步纯化。图1：用DEAE-纤维素层析结果四、用SephadexG-75分子筛

4、层析柱进一步纯化对收集经DEAE-纤维素层析分离的第Ⅱ峰洗脱液合并，用PEG浓缩，将浓缩液置透析袋中，用0.01mol/LPH7.4PB透析平衡后，将第一步浓缩透析液再通过事先准备好的SephadexG-75分子筛柱(2.6×30cm)过柱。上样后用0.01mol/LPH7.4PB洗脱，洗脱液出现一个蛋白峰，用RPLA检测毒素即在此峰，收集Ⅰ峰混合，浓缩。结果见图2：图2：用SephadexG-75分子筛结果对截留后浓缩液及通过DEAE纤维素柱层析与SephadexG-75分子筛过柱后各项内容的变化情况见表1：

5、表1：SET-C的提纯及回收率检测内容项目体积（ml）蛋白量(mg/ml)总蛋白（mg）RPLA(mg/ml)毒素（mg）总回收率(%)纯度（%）分子截留后的浓缩液40022.188400.4276.25DEAE纤维素Ⅱ峰10420.72152.84.6180.386646SephadexG-75峰524.18217.369.64138.577696.4从表1可见，通过DEAE-纤维素柱层析后，SET-C回收率为66%而纯度为46%，再通过SephadexG-75分子筛过柱后回收率达76%，而纯度则达96.4%。五

6、、纯化前后SET-C的SDS-PAGE鉴定对分子截留浓缩的截留原液，经DEAE-纤维素初步提以的浓缩液及再经SephadexG-75分子筛纯化后浓缩液，在同一块10%的SDS-PAGE凝胶板上，分别滴样进行电泳后染色观察，结果见图3：CBA（A：浓缩液B：经DEAE柱C：经SephadexG-75柱）图3SET-C各部样品的电泳图谱从图3可见，经DEAE-纤维素柱层析后，杂蛋白带显著减少，而再经SephadexG-75分子筛提纯后，在SDS-PAGE中呈现一条清晰的条带。六、纯化后的SET-C分子量测定对纯化后的S

7、ET-C制品与已知分子量标准蛋白质在同一块10%SDS-PAGE凝胶板进行电泳后作染色检定，结果见图4、图5（M:standardproteinS:sample）图4SDS-PAGE测定肠毒素C分子量图5SETC分子量测定结果30000从图4、图5中可见纯化SET-C在PAGE中呈现单一条带，通过与标准蛋白分子量比较计算，SET-C的分子量约在28000dalton左右。七、对SET-C纯化品的N末端氨基酸测定由我公司提供纯化SET-C，请上海基康生物技术有限公司，用PROCISE(R)cLC蛋白测序系统（App

8、liedBiosystems）检测N末端10个氨基酸，结果这10个氨基酸依次为“GluSerGlnProAspProThrProAspGlu”。谢谢五年级科学下册第一单元：沉和浮第一节物体在水中是沉还是浮1、物体在水中（），判断物体沉浮有一定的标准。2、（）构成的物体，改变它的（），沉浮状况不改变。3、物体的沉浮与自身的（）和（）都有关。有沉有浮同种材料重量