最新脆性X综合征诊断与治疗新进展教学讲义ppt.ppt

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1、脆性X综合征诊断与治疗新进展脆性X综合征(fragileXsyndrome,FXS)是引起先天性智力低下的常见疾病，新生儿发生率为0.4‰~0.67‰，占X连锁智力低下病人的1/2~1/3。男性发病率约为1/4000，女性发病率约为1/6000~1/8000，前突变的携带者在男性中约为1/800，而在女性中则高达1/100~1/200。FXS发病率仅次于先天愚型，占智力低下的2%,估计20％IQ水平30~55之间的男性患有该病。给家庭和社会带来沉重的负担。同时FXS具有家族遗传性且临床表现复杂。为临床诊断和治疗带来了极大的困难。1FXS临床诊断方法新进展FXS是由于

2、FMR-1基因5′端(CGG)n重复系列大量扩展的结果，如果(CGG)n重复上升到230至1000次之间，就会产生FXS。目前对于脆性X综合征的诊断主要依赖于实验室检查。根据2005年最新ACMG指南对于以下几种临床情况应进行分子生物学检测：⑴智力缺陷,发育迟缓,性格孤僻,行为体征疑为脆性X综合征者；⑵具有不明原因的智力障碍者；⑶具有脆性X综合征家族史者；⑷具有脆性X综合征或不明原因智力缺陷家族史，生育前进行遗传咨询者；⑸脆性X综合征携带者母亲的胎儿；⑹卵胞刺激素升高并伴有卵巢早衰的妇女，特别是具有不明原因智力缺陷家族史者；⑺未明原因的新发震颤/小脑性共济失调患者，

3、特别是伴有不明原因的智力缺陷家族史者。。FXS实验室诊断方法有细胞遗传学、Southern印迹杂交、聚合酶链反应（PCR）、RT-PCR和免疫组化分析1．1细胞遗传学检测该方法至尽今已发展成熟。诊断的重要指标：培养中期细胞染色体Xq2.7显示脆性位点大于4%为阳性。甲氨蝶呤或5-氟脱氧尿苷可诱导出脆性位点提高显现率，与原位杂交荧光技术结合可分析检测数量和结构的异常并提高图谱分辨率至10万bp。fra(X)并不是在所有的中期细胞中都能找到，标本来源于外周淋巴细胞、羊水、绒毛或脐血。一般智力低下男性患者fra(X)的表达率为10%~30%。年龄较大、表型正常的女性携带者

4、可不表达，表达常低于5%。故不用于对表型正常的女性携带者的诊断。该法费时费力、检出率低于50%，且只能对男性患者及部分女性患者做出诊断，不能检出不全显性患者及女性杂合子，对于男性患者也易产生假阴性。所以应用较局限。1．2Southern印迹杂交法FXS5’端的（CGG）n的异常扩增及CpG岛异常甲基化使其上的特异性酶切位点消失，需用限制性核酸内切酶识别、结合并切割特异性序列，产生不同长度的核酸片段，用于诊断。根据待测片段的大小选择合适内切酶。全突变使用HindIII或EcoRI可得到很强的杂交信号，不完全突变需使用PstI方可产生清晰的高分辨条带。目前认为应用较远侧

5、探针（StB12.3）对双酶解（如EcoRI/EagI）DNA样本进行杂交，可检出全部前突变和全突变等位基因及嵌合体状态，同时可了解甲基化状态，是最可靠的诊断方法。Southern印迹杂交法缺点为：需要DNA样品多、需要同位素标记、操作复杂、费用大、耗时长、不易推广；若酶解不完全会产生杂交带，可产生错误诊断；较难鉴别(CGG)n大的正常个体和小的前突变个体；有较大的漏诊率和约5%的误诊率。1．3聚合酶链反应技术为目前快速、准确检测（CGG）n重复的方法，传统的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术可以检测正常个体及小片段的前突变等

6、位基因的（CGG）n重复数。对于较长片段的前突变及全突变患者，由于高的GC含量，序列内部易于形成发夹结构不易扩增，可利用甲基化敏感性聚合酶链反应（methylationsensitivePolymeraseChainReaction;ms-PCR），引入特异性的引物使扩增不出来的等位基因产生smear条带，通过不同的探针标记引物，利用毛细管电泳法检测PCR扩增产物，可以准确的检测（CGG）n重复数。结合普通PCR及ms-PCR技术，可以鉴别正常个体、前突变、全突变男性及全突变女性。由于PCR技术优先扩增较小片段的等位基因，因此对于呈嵌合型的患者，也会产生PCR扩增产

7、物，易于产生假阴性。PCR技术是快速筛查脆性X综合征的基因诊断方案。难以扩增出全突变的等位基因，因此限制了它对于脆性X综合征患者临床诊断方面的应用，PCR技术和Sothernblot技术的联合应用，可以弥补相互之间的缺陷。1．4逆转录－聚合酶链反应技术绝大多数FXS征男性患者无FMR1基因的表达，而女性患者的FMR1基因是杂合的，FMR1基因表达降低，但可检测到。所以RT-PCR在男性患者、缺失或点突变的个体是检测不到扩增引物，而对于正常个体、前突变及女性可以获得扩增条带。HmadchaA等用RT-PCR方法检测该FMR1基因的表达。WuLQ等设计合成了2对特异