最新感受态细胞的制备和质粒的转化PPT课件.ppt

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1、感受态细胞的制备和质粒的转化感受态细胞的制备实验目的：学习感受态细胞的制备过程实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/µgDNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/µgDNA。CaCl2感受态细胞的制备实验步骤前夜接种受体菌（DH5或DH10B）

2、，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；4℃下3000g冷冻离心5分钟；弃去上清，加入100ul预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4℃下3000g冷冻离心5分钟；弃去上清，加入100ul预冷0.1MCaCl2

3、溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转

4、化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。热激法转化实验步骤制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中250ulAmp（100mg/ml），混匀后倒入灭菌培养皿中；取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；每100ul感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）

5、及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；复苏：每管加400ulLB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LA平板；培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察菌落质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中250lAmp（100mg/ml），250lX-gal(20mg/

6、ml)，25lIPTG(200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；每管感受态细胞加入1l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；电转化仪选择1800V作为输出电压；将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；立即加1mlSOC培养基到转化杯中重悬细胞；将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时；吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；37ºC培养过夜，观察结果。附注：利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落）

7、，同时37℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。中心化验室危害辨识与风险控制培训班概述HSE（健康安全和环境）管理体系是当前国际石油界普遍采用的现代化管理方法，它是在充分吸收ISO9000质量管理体系和ISO14000环境管理体系优点的基础上，经过不断探索和实践，总结出来的一种能够提高企业健康安全环境管理水平，降低企业风险的先进管理方法。宁夏石化经过十余年的体系运行，取得了非常好的安全业绩。已跻身于集团公司的安全先进行列之

8、中。定义1、危害可能造成伤亡、职业病、财产损失、作业环境破坏的根源或状态。即所有可引发事故或职业病的各种危险因素2、危害辨识识别危害的存在并判定其性质的过程。危险因素种类繁多，存在形式和阶段各异。按其性质可分为物理性因素、化学性因素、生物性因素、心